尿液細胞外囊泡的單顆粒水平多參數(shù)定量表征

劉海生 袁文理 陳永鈺 陳 晨 田 野 顏曉梅

(廈門大學化學化工學院化學生物學系， 譜學分析與儀器教育部重點實驗室， 化學生物學福建省重點實驗室， 廈門 361005)

1 引 言

細胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)是由細胞分泌到細胞外基質(zhì)中的納米尺度 (30～1000 nm)、具有磷脂雙層膜結(jié)構(gòu)的小囊泡[1]。根據(jù)分泌機制的不同，EVs主要包括由多泡小體與細胞膜融合釋放的外泌體(Exosomes, 30～150 nm)和從細胞膜出芽脫落的微囊泡(Microvesicles, 100～1000 nm)[2]。EVs攜載有親本細胞來源的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸和其它生物分子，參與細胞間通訊、抗原呈遞、血管新生、腫瘤侵襲等生理病理過程，在疾病診斷、預后和治療中顯示出巨大的應用前景[3]。EVs廣泛存在于人類各種體液和排泄物中，如血液、唾液、汗液、眼淚、糞便和尿液等[4]，其中，尿液樣本因具有簡單易得、非侵入性采樣和標本量大等特點備受關(guān)注。2002年，Thongboonkerd等[5]通過對尿液超速離心后的沉淀物進行蛋白質(zhì)組學分析，發(fā)現(xiàn)沉淀物中含有大量膜蛋白，為尿液中存在具有膜結(jié)構(gòu)的EVs提供了實驗證據(jù)。2004年，Pisitkun等[6]通過超速離心，首次提純了uEVs，并且通過蛋白質(zhì)組學發(fā)現(xiàn)uEVs攜載的很多蛋白與人類疾病密切相關(guān)。近幾年，uEVs攜載的分子標志物已被用于多種泌尿系統(tǒng)疾病(如急性腎損傷、前列腺癌和膀胱癌等)的診斷與治療監(jiān)控[7～13]。盡管uEVs的生物學功能及臨床應用價值不斷地被發(fā)掘，但由于uEVs自身具有高度的個體差異性和多樣性，同時缺乏相應的單顆粒表征技術(shù)，研究者對于uEVs自身組成、結(jié)構(gòu)和功能的了解較少，這嚴重阻礙了uEVs研究的進一步深入[14]。

透射電子顯微鏡、掃描電子顯微鏡和原子力顯微鏡等顯微技術(shù)被廣泛應用于EVs物理性狀(如粒徑、濃度和形態(tài)等)的表征，但這些技術(shù)存在樣品制備繁瑣、測量速度慢、粒徑分布缺乏統(tǒng)計代表性等缺點[15]。動態(tài)光散射技術(shù)(Dynamic light scattering, DLS)、納米顆粒跟蹤分析技術(shù)(Nanoparticle tracking analysis, NTA)、可調(diào)電阻脈沖傳感技術(shù)(Tunable resistance pulse sensing, TRPS)和流式細胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)等，常被用于EVs粒徑和濃度的快速測定。采用DLS測量EVs時，測量的散射強度由顆粒尺寸加權(quán)所得，與粒徑的六次方成正比，因此，少量的大粒徑雜質(zhì)顆?；蚰遗輹螞]小粒徑EVs的信號，使得小顆粒信號失真，不適于EVs等高度異質(zhì)性顆粒樣本的表征[16]。與DLS不同，NTA是對單個納米顆粒的散射光強進行測量，采用激光照射納米顆粒懸浮液，通過高速相機對視野中的顆粒進行拍照，從而對每個顆粒的散射光點進行跟蹤記錄，以獲得納米顆粒布朗運動的軌跡，進而計算出單位時間間隔內(nèi)每個納米顆粒的均方位移和擴散系數(shù)，最后將每個顆粒的擴散系數(shù)代入Stokes-Einstein方程，計算出各自的水合動力學直徑。然而，NTA得到的粒徑包含顆粒外的水化層，將顆粒在x-y-z三維空間的布朗擴散變成x-y二維平面的顆粒追蹤，導致測得的速率比顆粒的實際運動速率偏小，使得顆粒粒徑的測定結(jié)果偏大，同時，也使測得的顆粒粒徑分布相比于真實分布存在展寬。此外，由于EVs粒徑分布較寬，為了防止大顆粒的散射光信號過飽和，必須降低相機亮度，導致小顆粒的散射光信號較弱，難以被儀器跟蹤分析。因此，NTA僅能檢測粒徑大于70 nm的EVs，并且顆粒粒徑分布結(jié)果通常大于電鏡的測定結(jié)果，且展寬較為嚴重[17]。TRPS是一種利用納米孔技術(shù)對溶液中納米顆粒的粒徑分布和濃度在單顆粒水平進行快速測定的方法，其對于EVs樣本的表征存在以下挑戰(zhàn)：(1)校準粒子應與EVs樣本具有相同的緩沖液組分，然而在測量EVs，尤其是生物樣本中的EVs時，緩沖組分通常是未知的; (2)由于EVs的粒徑分布廣，樣品中的大尺寸EVs常會造成納米孔的堵塞，從而阻礙測量[18]。FCM是一種對懸液中的細胞或細胞大小的顆粒進行快速定量分析的先進技術(shù)，散射光可揭示細胞或顆粒的粒徑以及材質(zhì)的疏密程度，多色熒光標記可實現(xiàn)細胞內(nèi)基因表達、特異性蛋白表達、酶活、離子濃度等生化性狀的測定?；诿资仙⑸淠Ｐ偷纳⑸涔馀c粒徑的關(guān)系，2018年，van der Pol等[19]對各種商品化流式細胞儀可檢測到的EVs的粒徑范圍進行了評估，發(fā)現(xiàn)只有少數(shù)幾款高靈敏設備(包括Apogee A50- Micro，BD influx以及BD LSR II)可檢測300～600 nm范圍的EVs，其它常規(guī)配置的流式細胞儀只適用于檢測粒徑范圍在600～1200 nm和/或1200～3000 nm的大尺寸EVs。

傳統(tǒng)的EVs生化檢測方法主要是基于集權(quán)平均的分析方法，如Western blotting、酶聯(lián)免疫法(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)、蛋白質(zhì)組學分析、核酸測序等。這些方法雖可對EVs樣本中的生物分子豐度進行整體分析，卻無法揭示EVs在蛋白、核酸等方面的個體差異性，而EVs亞類的分析對于EVs分泌機制和功能的研究至關(guān)重要[20～22]。因此，如何在單顆粒水平對EVs的理化性質(zhì)進行精準測量，以揭示EV顆粒間異質(zhì)性，是一個亟待解決的科學難題[23]。為了實現(xiàn)納米顆粒的高靈敏度多參數(shù)檢測，本研究組結(jié)合瑞利散射和鞘流單分子熒光檢測技術(shù)，成功研制出納米流式檢測裝置(Nano-flow cytometer, nFCM)，將EVs、病毒、二氧化硅納米顆粒 (SiNPs)、納米金顆粒 (AuNPs) 的散射檢測下限分別降低至40、27、24和7 nm，較傳統(tǒng)流式細胞儀的散射檢測靈敏度提升4～5個數(shù)量級，檢測速率高達每分鐘上萬個顆粒，粒徑表征分辨率與冷凍透射電鏡[17,24,25]相當。在熒光檢測方面，nFCM可檢測到單個藻紅蛋白的熒光信號，較傳統(tǒng)流式細胞儀靈敏1～2個數(shù)量級[26]。本研究采用nFCM對uEVs在單顆粒水平進行多參數(shù)定量表征。

uEVs提取的方法主要有超速離心法、非對稱場流分離、密度梯度離心法、免疫親和分離法、超濾法和聚合物沉淀法等[27,28]。其中，超速離心法最為常用，其提取步驟一般為：(1) 3000 g離心10 min，取上清液，以17000 g離心20 min，去除尿液中的細胞和細胞碎片; (2)200000 g超速離心110 min， 2次，提取uEVs沉淀; (3)對提純的uEVs進行密度梯度離心，提高EVs純度[27,29]。其中，差速離心需要5～6 h，密度梯度離心約需要24 h，非常耗時費力。為了能在較短的時間內(nèi)獲得高純度的uEVs，本研究采用配備了TLA-120.2轉(zhuǎn)頭的Beckman Coulter Optima MAX-XP臺式超速離心機對uEVs進行純化，將EVs的單次超速離心時間從110 min縮短至17 min。具體提取步驟如圖1所示：(1) 3000 g離心20 min， 去除尿液中的細胞碎片; (2)100000 g離心17 min，2次，提取uEVs。整個提純過程僅需1 h。基于nFCM散射和熒光檢測的高靈敏和快速性，本研究對尿液提純的uEVs的純度、濃度、粒徑分布、核酸和蛋白豐度等進行了定量表征。此外，本研究還對10位健康受試者連續(xù)5天的中段晨尿進行了uEVs的追蹤分析。

圖1 uEVs的超速離心純化步驟及納米流式分析圖Fig.1 Schematic depiction of urinary extracellular vesicles (uEVs) isolation by differential ultracentrifugation and nano-flow cytometer (nFCM) analysis

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

5810R冷凍離心機(德國Eppendorf公司)； Optima Max-XP超速離心機，配備TLA 120.2轉(zhuǎn)頭(美國Beckman Coulter公司)。 nFCM為本研究組自行開發(fā)[30]，本研究在檢測uEVs的純度、濃度、粒徑和蛋白時所用的儀器參數(shù)與之前報道的相同。532 nm (16 mW) 激光器發(fā)出的激光經(jīng)反射鏡反射后，被消色差膠合透鏡聚焦為直徑約10 μm的激光光斑，激光光斑與鞘液聚焦后的uEVs樣品流正交于石英流動室的中心處，uEVs顆粒穿越激光探測區(qū)所發(fā)出的光信號被顯微鏡物鏡收集后，由二向色分光鏡Dic-F(美國Semrock公司，F(xiàn)F555-Di03)分為兩束光路，波長λ<555 nm的光被反射至第一個APD進行散射檢測，而波長λ>555 nm的光經(jīng)過FF01-579/34帶通濾波片BP(美國Semrock公司)被第二個APD接收，進行熒光檢測。當檢測綠色熒光染料CFSE、SYTO16和RNASelect標記的uEVs時更換為488 nm激光器(20 mW), 此時二向色分光鏡FF555-Di03更換為FF500-Di01，λ<500 nm的光被反射至第一個APD進行散射檢測，而λ>500 nm的光經(jīng)過FF01-525/45帶通濾波片BP(美國Semrock公司)被第二個APD接收，進行熒光檢測。儀器其它參數(shù)不變。

磷酸鹽緩沖液 (PBS, pH 7.4)經(jīng)220 nm濾膜過濾，于4℃保存，備用; Triton X-100(美國Sigma-Aldrich公司); 熒光標記的抗體(美國BD Biosciences公司)，包括藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)標記小鼠IgG 1, κ(Clone MOPC-21)、PE標記鼠抗人CD9抗體(Clone M-L13)、PE標記鼠抗人CD63抗體(Clone H5C6)、PE標記鼠抗人CD81抗體(Clone JS-81)和 PE標記鼠抗人CD24抗體(Clone ML5)，5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE, CFSE，美國MedChemExpress公司，HY-D0938); RNase-free DNase I (日本Takara公司，2270A); RNase A(EN0531)、SYTO 16(S7578)和SYTO RNASelect(S32703)(美國Thermo Fisher公司)。

2.2 實驗方法

2.2.1 uEVs的純化中段晨尿來源于10名年齡20～30歲的健康志愿者(5名男性，5名女性)，受試者無腎臟和糖尿病等慢性病史，尿液留取兩周內(nèi)，受試者無急性感染、無用藥史，女性受試者均避開生理期。5 mL尿液以3000 g離心20 min(5810 R冷凍離心機)，去除細胞和細胞碎片，取上清液。將1 mL上清液轉(zhuǎn)入超速離心管，100000 g離心17 min(Optima Max-XP超速離心機)，棄上清液，沉淀重懸于1 mL PBS中; 100000 g離心17 min，棄上清液，uEVs重懸于100 μL PBS中，備用。

2.2.2 冷凍透射電鏡觀測uEVs 冷凍透射電鏡拍攝使用Tecnai F20透射電子顯微鏡在120 kV的電壓下拍攝。

2.2.3 uEVs純度鑒定將10 μL PBS稀釋的10% Triton X-100加到90 μL uEVs中，Triton X-100的終濃度為1%。樣品振蕩混勻后，冰上孵育30 min, 以裂解uEVs。反應結(jié)束后，將樣品稀釋20倍，使用nFCM檢測Triton X-100處理前后uEVs的顆粒濃度變化。

2.2.4 CFSE標記uEVs將100 μL 稀釋于PBS的200 μmol/L CFSE加到100 μL 6 ×108個/mL的uEVs中 (CFSE終濃度為100 μmol/L)，37℃避光孵育2 h。將樣品轉(zhuǎn)入超速離心管，用PBS補至1 mL, 100000 g離心17 min。棄上清液，向超速離心管加入1 mL PBS, 100000 g離心17 min。將標記后的uEVs重懸于100 μL PBS，用于nFCM檢測。

2.2.5 uEVs核酸標記將4 μL 5 U/μL RNase-free DNase I或1 μL 10 mg/mL RNase A加入到100 μL 3 × 108個/mL uEVs中，37℃孵育30 min。隨后，將SYTO 16或SYTO RNASelect加入uEVs中，使其終濃度為6 μmol/L或10 μmol/L，37℃孵育20 min，用于nFCM檢測。

2.2.6 uEVs蛋白標記將尿液3000 g離心，取1 mL上清液轉(zhuǎn)入超速離心管，100000 g離心17 min，棄上清液，將uEVs重懸在50 μL PBS中，分別加入20 μL PE標記小鼠IgG 1, κ同型對照、PE標記鼠抗人CD9抗體、PE標記鼠抗人CD63抗體、PE標記鼠抗人CD81抗體或 PE標記鼠抗人CD24抗體原液，37℃孵育30 min。用PBS補至1 mL, 100000 g離心17 min。棄上清液，向超速離心管加入1 mL PBS, 100000 g離心17 min，將標記后的uEVs重懸于100 μL PBS，用于nFCM檢測。

3 結(jié)果與討論

3.1 uEVs形態(tài)與純度

普通透射電鏡在制備樣本時會造成EVs脫水，無法展示EVs的真實形態(tài)。在低溫下，冷凍透射電鏡將溶劑中的EVs快速冷凍固定后拍攝，能夠保持EVs的原始形態(tài)[15]。為了獲得uEVs的真實形態(tài)，本研究采用冷凍透射電鏡對uEVs進行拍攝，其形態(tài)如圖2A所示，主要有球形和棒狀兩種形態(tài)，此外，還存在著一些具有多層膜結(jié)構(gòu)的囊泡。Triton X-100是一種非離子型表面活性劑，可裂解uEVs的磷脂雙分子層，不會破壞無脂膜結(jié)構(gòu)的雜質(zhì)顆粒[30]。通過使用nFCM測定Triton X-100處理前后uEVs的顆粒濃度，可對uEVs的純度進行評估。圖2B和2C分別為nFCM檢測1% Triton X-100處理前后的uEVs的側(cè)向散射信號(Side scattering, SSC)波形圖和統(tǒng)計直方圖。計算結(jié)果表明，uEV的純度為92%，而超速離心純化獲得的血漿和細胞上清液來源的EVs的純度通常為90%和70%～80%[17]，這主要是因為與血漿和細胞上清液相比，尿液中含有少量脂蛋白、血清蛋白等雜質(zhì)顆粒。CFSE是一種可穿透細胞膜的熒光染料，自身不具有熒光性質(zhì)。當CFSE進入囊泡內(nèi)部，其乙酸基團被囊泡內(nèi)部的酯酶水解，此時，CFSE可發(fā)出較強的綠色熒光，但不再具有膜通透性; 同時，CFSE含有的琥珀酰亞胺基團可與囊泡內(nèi)蛋白的游離胺基反應，形成具有熒光的蛋白加合物[31]。本研究使用CFSE對uEVs進行標記，CFSE熒光強度與側(cè)向散射強度的二維散點圖(圖2D)表明，82.6%的uEVs可被CFSE標記，標記比例與uEVs的純度相近，且粒徑越大的EVs，CFSE的熒光亮度越強。

圖2 uEVs的形態(tài)與純度鑒定：(A)uEVs冷凍透射電鏡圖; (B)nFCM檢測Triton X-100處理前后，uEVs的散射信號波形圖; (C)nFCM檢測Triton X-100處理前后，uEVs的散射信號統(tǒng)計直方圖; (D)CFSE標記uEVs的散射-熒光信號二維散點圖Fig.2 Morphology and purity identification of uEVs: (A) Representative cryo-transmission electron microscopemicrographs of uEVs; (B) Representative side scatter (SSC) burst traces of uEVs before and after 1% Triton X-100 treatment for 30 min by nFCM; (C) SSC distribution histograms of uEVs before and after 1% Triton X-100 treatment; (D) Bivariate dot-plots of green fluorescence versus SSC for uEVs fluorescently labeled with CFSE

3.2 uEVs顆粒濃度測定

雖然尿液樣本具有簡單易得、無創(chuàng)取樣等優(yōu)點，但尿液中uEVs的濃度易受晝夜節(jié)律、水合狀態(tài)的變化、鍛煉和飲食等因素影響[32]。因此，對于不同個體或同一個體不同時間點uEVs進行濃度測定對于后續(xù)的研究具有一定的指導意義。首先使用nFCM對初始濃度為2.03 × 109個/mL 的100 nm聚苯乙烯熒光標準球進行梯度稀釋檢測(采樣時間為1 min)，建立聚苯乙烯熒光標準球的濃度與nFCM單位時間檢測顆粒數(shù)之間的標準工作曲線(圖3A和3B)，相關(guān)系數(shù)R2=0.998。隨后，在相同進樣壓力條件下對uEVs樣本的散射信號進行檢測，采樣時間為1 min，將檢測到的uEVs的顆粒數(shù)代入標準工作曲線，即可得到待測樣本中uEVs的顆粒濃度?；诖朔椒ǎ狙芯繉?0名受試者每天晨尿中uEVs的顆粒濃度進行了為期5天的連續(xù)追蹤。圖3C表明，所有受試者的uEVs濃度均分布在3.0 × 109～8.9 ×1010個/mL之間，這個濃度遠高于文獻報道的2.0 × 108～4.0 × 108個/mL[33]，這主要是因為nFCM靈敏度高，能檢測到小粒徑的uEVs。對比每位受試者連續(xù)5天的uEVs濃度，可知受試者的濃度變化存在較大的個體差異，個人5天的濃度變異系數(shù)(Coefficient of variation, CV)在18.5%～142.0%之間。此外，雖然男性受試者和女性受試者的uEVs濃度不存在顯著差別，但女性受試者5天的濃度變異系數(shù)(47.1%～142.0%)略高于男性(18.5% ～82.1%)。

圖3 uEVs的濃度測定：(A)100 nm聚苯乙烯熒光標準球的散射-熒光二維散點圖; (B)nFCM單位時間(1 min)檢測到的100 nm聚苯乙烯熒光標準球顆粒數(shù)與其實際濃度的線性關(guān)系曲線; (C)10名受試者連續(xù)5天晨尿中uEVs的濃度檢測結(jié)果Fig.3 Concentration measurement of uEVs by nFCM: (A) A bivariate dot-plot of fluorescence versus side scattering for 100 nm fluorescent polystyrene beads; (B) Linear relationship between the events rate measured by the nFCM in 1 min and the true concentration of 100 nm fluorescent polystyrene beads; (C) Concentrations of uEVs isolated from 10 healthy donors for five consecutive days

3.3 uEVs粒徑分布測定

粒徑分布是細胞外囊泡研究中重要的物理參數(shù)，粒徑與囊泡的分泌來源和攜載分子的豐度密切相關(guān)[21]。基于nFCM對單個EVs散射光強度的快速檢測，同時，采用單分散性良好的SiNPs粒徑標準球建立散射光強度與粒徑的關(guān)系曲線，并結(jié)合米氏散射理論對SiNPs和EVs的折射率偏差進行校正，實現(xiàn)了對粒徑低至40 nm的EVs的粒徑快速表征，其準確性和分辨率與冷凍透射電鏡[17]相當。圖4A是10位健康受試者同一天uEVs粒徑分布統(tǒng)計直方圖，雖然不同的個體在分布上略有差異，uEVs的粒徑主要分布在40～120 nm之間。5位男性受試者uEVs的中位粒徑(Median size)分別為69、66、67、63和67 nm， 5位女性受試者uEVs的中位粒徑分別為65、62、63、67和62 nm。通過對比可知，男性受試者uEVs的粒徑略大于女性受試者，但并無顯著區(qū)別(p= 0.08)，這種結(jié)果可能是樣本量較少造成的。隨后，對其中1位男性受試者uEVs的粒徑進行了連續(xù)5天的追蹤分析，由圖4B可知，同一受試者uEVs的粒徑分布在不同的日期粒徑分布差異并不明顯，5天粒徑中位值為(68 ± 4) nm。上述實驗結(jié)果表明，不同受試者或同一受試者在不同日期uEVs的粒徑分布變化不大。

3.4 uEVs的核酸檢測

根據(jù)文獻報道，uEVs中存在DNA片段和多種類型的RNA(miRNA、mRNA和rRNA等)[34～36]。這些DNA和RNA在基于uEVs的疾病診斷研究中至關(guān)重要，如以uEVs攜載RNA為檢測靶標的前列腺癌診斷試劑盒ExoDxTMProstate (IntelliScore) 已被用于臨床分析[37]。然而，現(xiàn)有的表征技術(shù)尚無法確定DNA和RNA是否存在于每個uEVs顆粒中，是攜載于uEVs的內(nèi)部，還是粘附于uEVs的外部，以及核酸豐度等問題。本研究使用SYTO 16對一位男性健康受試者uEVs的DNA進行標記，采用nFCM在單顆粒水平檢測uEVs的熒光和散射信號，探究DNA在uEVs中的分布及其與粒徑的關(guān)系。SYTO 16是一種可跨膜的綠色熒光核酸染料，熒光光譜表明，SYTO 16與DNA結(jié)合的熒光強度比與相同濃度的RNA結(jié)合高15倍，說明其對DNA具有高度的特異性(圖5A)。為了探究uEVs表面是否黏附有DNA片段，在核酸染色前使用DNase I對uEVs進行處理。由于uEVs具有完整封閉的磷脂雙分子膜，DNase I只能作用于uEVs外表面，無法水解uEVs內(nèi)部包裹的DNA片段。由SYTO 16熒光強度與散射光強度的二維散點圖(圖5B)可知，DNase I處理前后uEVs的染色比例和熒光強度均無明顯變化。此實驗現(xiàn)象表明uEVs外表面沒有DNA片段黏附，uEVs的DNA主要分布在uEVs內(nèi)腔。結(jié)合散射信號強度可知，DNA主要分布在粒徑較大的uEVs的內(nèi)腔中。為了分析RNA在uEVs中的分布與豐度，使用SYTO RNASelect對uEVs中的RNA進行定量標記。SYTO RNASelect是目前唯一商業(yè)化的RNA特異性熒光染料，是一種跨膜的綠色熒光染料，通過熒光光譜(圖5C)可知，其與RNA結(jié)合的熒光強度比與同濃度DNA高30倍。為了探究uEVs外表面是否黏附RNA，采用RNase A處理uEVs。由SYTO RNASelect熒光強度與散射光熒光強度的二維散點圖(圖5D)可知，RNase A處理前后uEVs的染色比例分別為5.2%和4.7%，而且熒光強度也沒有明顯變化。結(jié)果說明，uEVs表面幾乎沒有RNA黏附，RNA同樣主要分布在uEVs的內(nèi)腔中。

圖5 uEVs的核酸檢測：(A)熒光分光光度計考察SYTO 16對于DNA和RNA熒光標記的特異性(SYTO 16濃度為6 μmol/L，DNA和RNA的濃度均為5 μg/mL); (B)nFCM測定uEVs未經(jīng)DNase I處理和處理后使用6 μmol/L SYTO 16染色的散射-熒光二維散點圖; (C)熒光分光光度計考察SYTO RNASelect對于RNA和DNA熒光標記的特異性(SYTO RNASelect濃度為10 μmol/L，DNA和RNA的濃度均為5 μg/mL); (D)nFCM測定uEVs 未經(jīng)RNase A處理和處理后使用10 μmol/L SYTO RNASelect染色的散射-熒光二維散點圖Fig.5 nFCM analysis of DNA and RNA on single uEVs: (A) Fluorescence emission spectra of SYTO 16 without or with RNA or DNA binding. The concentration of SYTO 16 is 6 μmol/L, and the concentrations of RNA and DNA were both 5 μg/mL. (B) Bivariate dot-plots of green fluorescence versus SSC for uEVs without or with DNase I treatment and then fluorescently labeled with SYTO 16. The concertation of SYTO 16 is 6 μmol/L. (C) Fluorescence emission spectra of SYTO RNASelect without or with RNA or DNA binding. The concentration of SYTO RNASelect is 10 μmol/L, and the concentrations of RNA and DNA are both 5 μg/mL. (D) Bivariate dot-plots of green fluorescence versus SSC for uEVs without or with RNase A treatment and then fluorescently labeled with SYTO RNASelect. The concertation of SYTO RNASelect is 10 μmol/L

3.5 uEVs的蛋白標志物檢測

CD9、CD63和CD81是鑒定EVs最經(jīng)典的蛋白標志物，這3種蛋白也常被用于EVs的親和捕獲，以提純EVs[20,38]。但是否每個uEVs都攜載這3種蛋白標志物尚不清楚。nFCM的熒光通道可高靈敏度地檢測單個藻紅蛋白PE的熒光信號，本研究使用PE標記的抗體對CD9、CD63和CD81在單個uEVs中的表達進行定量檢測。圖6顯示對于受試健康男性uEVs樣本，CD9、CD63和CD81陽性的uEVs比例分別為26.8%，21.0%和6.0%，因此，如果用這些蛋白的抗體對uEVs進行親和捕獲，將會遺漏大部分的uEVs。CD24是一種糖基磷脂酰肌醇錨蛋白，是黏蛋白樣黏附分子，通過糖基磷脂酰肌醇黏附在細胞膜上。文獻[39]報道，CD24在健康人uEVs中高表達，被認為是uEVs的蛋白標志物。通過nFCM對uEVs表面的CD24進行檢測，結(jié)果表明，CD24在uEVs中的陽性比例為19.9%，熒光強度比CD9、CD63和CD81高，說明CD24的單顆粒表達水平比這3種蛋白高。

圖6 uEVs蛋白標志物的免疫熒光檢測，(A～F)uEVs的抗體PE熒光-散射二維散點圖：(A)同型對照IgG 1; (B)同型對照IgG 2b; (C)CD9; (D)CD63; (E)CD81; (F)CD24Fig.6 Protein marker analysis of uEVs by nFCM upon immunefluorescent staining. (A-F) Bivariate dot-plots of PE orange fluorescence versus SSC for a uEV isolate fluorescently labeled with PE-conjugated monoclonal antibody specific to IgG 1 (A), IgG 2b (B), CD9 (C), CD63 (D), CD81 (E) or CD24 (F)

4 結(jié) 論

基于nFCM可在單顆粒水平對納米顆粒進行高靈敏、高通量和多參數(shù)定量檢測的獨特優(yōu)勢，本研究對uEVs的純度、濃度、粒徑、DNA、RNA以及蛋白標志物進行了表征。研究表明，采用超速離心純化的uEVs純度高達92%，整個提純過程僅需1 h; 對10位健康受試者uEVs的檢測結(jié)果表明，uEVs的顆粒濃度主要分布在3.0 × 109～8.9 ×1010個/mL之間，存在較大的個體差異，且同一受試者不同日期也存在較大的差別。此外，uEVs的粒徑主要分布在40～120 nm之間，個體差異和同一受試者不同日期的差異不大。核酸檢測結(jié)果表明，uEVs的外表面均無DNA或RNA黏附，核酸主要存在于uEVs的內(nèi)腔。蛋白標志物的檢測結(jié)果表明，并不是每個uEVs都表達CD9、CD63、CD81等蛋白，對于所測樣本，這3種蛋白的陽性率分別為26.8%、21.0%和6.0%，而CD24的陽性率為19.9%。本研究對uEVs的多種物理和生化參數(shù)在單個顆粒水平進行了精確的定量表征，nFCM可為uEVs的分泌方式研究、亞群鑒定以及臨床價值挖掘提供強大的技術(shù)支撐。