食醋釀造中酯類(lèi)生成及酯化酶的應(yīng)用研究

秦偉軍，王建云

(1.北京大陸航星質(zhì)量認(rèn)證中心股份有限公司，北京 100089；2.山西梁汾金龍魚(yú)醋業(yè)有限公司，山西 晉中 030622)

食醋是人們?nèi)粘ｏ嬍持蟹浅Ｖ匾乃嵝哉{(diào)味品。食醋要想引起人們的食欲與達(dá)到食物調(diào)味的目的，必須具有良好的感官特性，包括色澤、香氣、滋味、體態(tài)[1]。其中影響食醋風(fēng)味的成分包括揮發(fā)性成分、不揮發(fā)性成分。不揮發(fā)性成分影響食醋的滋味，即人的味覺(jué)評(píng)價(jià)；揮發(fā)性成分影響食醋的香氣，即人的嗅覺(jué)評(píng)價(jià)[2]。香氣對(duì)評(píng)價(jià)食醋風(fēng)味品質(zhì)起著至關(guān)重要的作用。

食醋香氣主要呈現(xiàn)果香、堅(jiān)果香、焦香及烘烤香、花香、酸香的復(fù)合香氣。影響食醋香氣的物質(zhì)主要包括酯類(lèi)、醇類(lèi)、酸類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、雜環(huán)類(lèi)[3-5]。食醋中的酯類(lèi)物質(zhì)是醋香的主要構(gòu)成物質(zhì)，是形成食醋特有香氣的重要成分，在食醋發(fā)酵釀造和后熟的過(guò)程中霉菌、酵母菌、細(xì)菌等微生物在酯化酶的作用下，將發(fā)酵中產(chǎn)生的有機(jī)酸和醇類(lèi)物質(zhì)通過(guò)酯化反應(yīng)形成酯類(lèi)物質(zhì)，其通常具有果香或花香氣味[6,7]。

在白酒生產(chǎn)過(guò)程中，酶化酶的使用可有效縮短發(fā)酵時(shí)間，提高白酒的出酒率和提取率，提高白酒的品質(zhì)[8]。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道可以使用超聲波、超高壓、微波、高壓靜電場(chǎng)、紅外等方法對(duì)酒類(lèi)、醋類(lèi)進(jìn)行催陳，食醋的色、香、味有所提高[9,10]，但由于各種原因，實(shí)際應(yīng)用較少，生物酶法加速醋的陳化是新的研究方向。陳釀過(guò)程中的主要化學(xué)反應(yīng)包括：酸與醇的酯化反應(yīng)、醇醛縮合反應(yīng)、氧化反應(yīng)、極性分子之間的締合、美拉德反應(yīng)等，其中酯化反應(yīng)是其陳釀過(guò)程中的重要反應(yīng)[11]。在固態(tài)食醋釀造工藝中添加含有一定量酯化酶的制劑，酯香有明顯提高[12]。固定化酯化酶處理的山西老陳醋醋液中總酯含量比原醋液提高28.1%，感官評(píng)定基本達(dá)到自然陳釀3個(gè)月醋液的口感，具有食醋催陳的作用[13,14]，是比較先進(jìn)的新工藝。但研究食醋釀造過(guò)程中各階段總酯生成變化和酯化酶在醋酸發(fā)酵中的應(yīng)用研究資料較少。

本文通過(guò)探究酯類(lèi)在酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵階段的生成變化，確定食醋酯類(lèi)生成的主要階段，然后對(duì)酯化酶在食醋醋酸發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)行優(yōu)化應(yīng)用研究，探究酯化酶對(duì)食醋酯類(lèi)和品質(zhì)的影響，尤其是對(duì)食醋口感和香氣的影響，為香醋的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

膨化高粱；大曲；麩皮；谷糠；酯化酶(食品級(jí)，100000 U/g)：武漢佳成生物制品有限公司；酒醪；酒醅；醋醅；醋液；無(wú)水乙醇。

1.2 儀器與設(shè)備

pHSJ-3F型pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；水浴鍋；BSA124S型電子天平 賽多利斯公司；HP5890型氣相色譜儀。

1.3 方法

1.3.1 酒精發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

對(duì)調(diào)好的配料醪液進(jìn)行酒精發(fā)酵，其中前3 d敞口發(fā)酵，后15 d密閉發(fā)酵。配料比例中膨化高粱、大曲、水的比例為100∶62.5∶500。對(duì)大缸中發(fā)酵的酒醪1～18 d每天進(jìn)行取樣，檢測(cè)總糖、總酯、總酸、不揮發(fā)酸、香氣成分，并對(duì)酒醪進(jìn)行感官分析，包括分層情況、上清液的顏色、酒醪的香氣、固形物比例，考察酯類(lèi)的變化。

1.3.2 醋酸發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

在酒醅中接入2/3量的固態(tài)火醅(菌種)進(jìn)行醋酸發(fā)酵，并按照固態(tài)發(fā)酵的方式每天進(jìn)行翻醅發(fā)酵。在酒醅加入不同比例的酯化酶液進(jìn)行攪拌混勻和醋酸發(fā)酵。每天對(duì)醋醅進(jìn)行取樣，檢測(cè)總酯、總酸含量。

1.3.3 陳釀實(shí)驗(yàn)

對(duì)醋醅進(jìn)行淋醋和滅菌，得到滅菌醋。在滅菌醋中加入不同比例的酯化酶液封口陳釀不同時(shí)間，考察酯類(lèi)的變化。每天對(duì)醋醅進(jìn)行取樣，檢測(cè)總酯、總酸含量。

1.3.4 測(cè)定方法

總糖、總酯、總酸、不揮發(fā)酸的檢測(cè)方法詳見(jiàn)GB/T 19777-2013《地理標(biāo)志產(chǎn)品 山西老陳醋》[15]。

1.4 酯化率計(jì)算

式中：A1為添加酯化酶的醋醅總酯含量；A2為未添加酯化酶的醋醅總酯含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 食醋釀造過(guò)程中指標(biāo)變化分析

2.1.1 酒精發(fā)酵過(guò)程中指標(biāo)變化

在酒精發(fā)酵過(guò)程中酒精度、酸度、酯類(lèi)變化見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 酒精發(fā)酵過(guò)程中酒精度含量變化Fig.1 The changes in alcohol content during alcohol fermentation process

由圖1可知，酒精度在0～8 d呈逐步上升的趨勢(shì)：0～2 d增長(zhǎng)幅度最大，為5.5%；2～8 d變化范圍為5.5%～7.8%，變化僅為2.3%；8～18 d變化很小，略有下降，從7.9%下降到7.4%。

圖2 酒精發(fā)酵過(guò)程中酸類(lèi)與酯類(lèi)含量變化Fig.2 The changes in content of acids and esters during alcohol fermentation process

由圖2可知，總酸含量在0～18 d總體變化很小；發(fā)酵8～18 d略有增長(zhǎng)趨勢(shì)?？傰ズ吭?～1 d上升最快，為1.58 g/dL，這與在大曲中存在酯化酶和酯化菌有關(guān)。隨后1～8 d呈現(xiàn)略微下降趨勢(shì)；8～18 d呈現(xiàn)略微上升趨勢(shì)，由0.8 g/dL上升至1.28 g/dL。

8～18 d酒精度呈現(xiàn)略微下降趨勢(shì)，總酸和總酯含量呈現(xiàn)略微增長(zhǎng)趨勢(shì)，說(shuō)明存在醇類(lèi)與酸類(lèi)的酯化反應(yīng)，并存在部分乙醇轉(zhuǎn)化為酸的變化過(guò)程。由于大曲中所含酯酶的菌系和酯酶較多，具體生成機(jī)理不是非常明確，其原因還有待進(jìn)一步分析研究。

2.1.2 醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸、總酯含量變化

在醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸、總酯的變化見(jiàn)圖3和圖4。添加酯化酶進(jìn)行醋酸發(fā)酵總酸幾乎沒(méi)有變化，影響可以忽略。

圖3 醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量變化Fig.3 The changes in total acids' content during acetic acid fermentation process

圖4 醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酯含量變化Fig.4 The changes in total esters' content during acetic acid fermentation process

由圖3和圖4可知，醋酸發(fā)酵總酯的生成量主要在前4 d，平均每天的生成量為0.21 g/dL。第5，6天醋酸發(fā)酵為結(jié)束期，產(chǎn)酸分別為3.94，3.90 g/dL(新酒醅的總酯含量為0.71 g/dL)。酯類(lèi)的生成量隨著醋酸發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，當(dāng)醋酸發(fā)酵接近結(jié)束時(shí)，酯類(lèi)的生成量也趨于穩(wěn)定。具體生成機(jī)理未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其原因還有待進(jìn)一步分析研究。

2.1.3 陳釀過(guò)程中總酯變化

對(duì)食醋進(jìn)行密封陳釀，1，2，3個(gè)月分別取樣查看總酯和總酸變化。1～3個(gè)月總酯變化略有上升，約上升0.40 g/dL；3～4個(gè)月總酯變化趨于穩(wěn)定。總酸在0～4個(gè)月略有下降，約下降0.12 g/dL。

表1 總酯和總酸隨陳釀時(shí)間的變化Table 1 The changes in content of total acids and totalesters during aging process

通過(guò)以上分析，在酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、陳釀過(guò)程中，都伴隨著總酯的變化。其中醋酸發(fā)酵過(guò)程是總酯生成的主要階段，總酯生成時(shí)間比酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵所用時(shí)間短，生成總酯量最多。

2.2 酯化酶在食醋釀造中的應(yīng)用

在食醋釀造環(huán)節(jié)中添加酯化酶，提高總酯生成量，縮短食醋催陳時(shí)間，提高食醋酯香味和品質(zhì)。

2.3 酯化酶對(duì)醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酯的影響

在醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸變化見(jiàn)圖5。添加酯化酶進(jìn)行醋酸發(fā)酵總酸幾乎沒(méi)有變化，影響可以忽略。在醋醅中添加酯化酶與不添加酯化酶進(jìn)行醋酸發(fā)酵的總酯含量對(duì)比見(jiàn)圖6。

圖5 醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酸含量變化Fig.5 The changes in total acids' content during acetic acid fermentation process

圖6 醋酸發(fā)酵過(guò)程中總酯含量變化Fig.6 The changes in total esters' content during acetic acid fermentation process

由圖6可知，隨著醋酸發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，總酯呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。其中加入酯化酶的醋醅總酯生成量在2 d時(shí)最大，增加1.58 g/dL，2～6 d增加很小，僅為0.18 g/dL。未加酯化酶的醋醅，總酯生成量逐步增加，1～4 d生成量比較均衡?？偟膩?lái)看，加酯化酶的醋醅生成總酯量要多于未加酯化酶的總酯總量，醋酸發(fā)酵第6天結(jié)束，加酯化酶的醋醅、未加酯化酶的醋醅，總酯生成量分別為3.64，2.47 g/dL，加酶的醋醅所生成總酯比未加酶總酯含量高1.17 g/dL，說(shuō)明醋酸發(fā)酵期間加酯化酶酯化反應(yīng)是有效的。發(fā)酵6 d結(jié)束，酯化率提高了47.3%。

2.4 酯化酶對(duì)陳釀過(guò)程中總酯生成的影響

對(duì)食醋進(jìn)行常溫密封陳釀，添加酯化酶的食醋，總酯和總酸變化見(jiàn)表2。

表2 總酯和總酸隨陳釀時(shí)間的變化Table 2 The changes in content of total esters and total acids during aging process

總酸在0～12 d略有下降，下降約0.12 g/dL。1，2，3個(gè)月分別取樣查看總酯和總酸變化。經(jīng)過(guò)優(yōu)化，添加0.2% 的酯化酶為足量的，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，總酯含量逐步增加，在第9天時(shí)總酯變化趨于穩(wěn)定。經(jīng)過(guò)感官品評(píng)，未陳釀的加酯化酶的醋酸發(fā)酵滅菌醋要好于未加酯化酶陳釀3個(gè)月的滅菌醋。加酯化酶來(lái)提高食醋的總酯含量，對(duì)食醋有催陳作用，食醋更有醇厚感,這與王冕等、張媛淵等研究得出的結(jié)論較為一致。

3 結(jié)論

在食醋釀造的整個(gè)過(guò)程中，跟蹤分析香氣中總酯生成變化。在酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵、陳釀過(guò)程中均對(duì)香氣總酯的生成有貢獻(xiàn)，但醋酸發(fā)酵的總酯生成量最大。

在醋酸發(fā)酵、陳釀過(guò)程中加酯化酶，分析研究酯化酶對(duì)總酯生成的影響。酯化酶可促進(jìn)總酯的生成，醋酸發(fā)酵總酯的促進(jìn)生成主要在0～2 d。醋酸發(fā)酵第6天結(jié)束，加酯化酶的醋醅、未加酯化酶的醋醅，總酯生成量分別為3.64，2.47 g/dL，加酶的醋醅所生成總酯比未加酶總酯含量高1.17 g/dL，說(shuō)明醋酸發(fā)酵期間加酯化酶酯化反應(yīng)是有效的。發(fā)酵6 d結(jié)束，酯化率提高了47.3%。酯化反應(yīng)對(duì)總酸的變化影響較小。加酯化酶陳釀9 d的食醋與未加酯化酶陳釀3個(gè)月的食醋，酯類(lèi)增加量相當(dāng)，約0.4 g/dL，酯類(lèi)香氣濃郁，食醋醇厚感增強(qiáng)，酯化酶對(duì)食醋催陳品質(zhì)提高具有很好的作用。