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    白酒酒糟中醇溶蛋白的提取及性質(zhì)比較

    2020-10-22 07:04:56侯夢媛范文來徐巖
    食品與發(fā)酵工業(yè) 2020年19期
    關(guān)鍵詞:堿法酒糟乙酸

    侯夢媛,范文來*,徐巖

    1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院,江蘇 無錫,214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學(xué)),江蘇 無錫,214122) 3(江南大學(xué) 釀造微生物與應(yīng)用酶學(xué)研究室,江蘇 無錫,214122)

    白酒酒糟是糧谷類作物經(jīng)過發(fā)酵、蒸餾生產(chǎn)白酒而產(chǎn)生的混合固體廢棄物,是釀酒行業(yè)最主要的副產(chǎn)物。據(jù)統(tǒng)計,2018年我國約產(chǎn)生2 344萬t酒糟,其營養(yǎng)豐富,包含蛋白質(zhì)、脂肪、淀粉、纖維素、維生素和無機鹽等。因此為了解決酒糟堆積所帶來的資源浪費和環(huán)境污染問題,針對酒糟高附加值再利用的研究必不可少。如今,酒糟已被開發(fā)成飼料[2]、沼氣[3]、肥料[4]和白炭黑[5]等,除此之外,提取酒糟中的高附加值物質(zhì)也是一種非常可取的酒糟再利用途徑。目前已有關(guān)于多肽[6-7]和類黑精[1]提取分離的相關(guān)報道,通過對具有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性多肽的鑒定,揭示了酒糟在治療高血壓方面的潛在可能性,而酒糟中類黑精的提取和活性鑒定,也為酒糟的高附加值利用提供了新思路。目前關(guān)于白酒酒糟中醇溶蛋白的提取和利用尚未見報道。

    高粱和小麥?zhǔn)前拙漆勗旌椭魄闹饕?,?jīng)發(fā)酵和蒸餾后大量營養(yǎng)成分特別是蛋白質(zhì)殘存于酒糟中,使得酒糟蛋白含量豐富[7]。醇溶蛋白是谷物中的一種貯藏蛋白,是種子萌發(fā)時的主要碳源和氮源[8],在高粱和小麥蛋白中比例較高,占高粱總蛋白的77%~82%[9],小麥總蛋白的50%~60%[8],但醇溶蛋白在酒糟中的比例尚不清楚。高粱和小麥中提取的醇溶蛋白具有較高的工業(yè)應(yīng)用潛力,這得益于其較強的疏水性、難消化性以及廣泛的交聯(lián)性等特性。醇溶蛋白已經(jīng)在可食性薄膜及涂層、膠黏劑、藥物控釋和乳化穩(wěn)定劑等領(lǐng)域得到了研究與開發(fā)。比如,目前醇溶蛋白可食用涂層的保鮮性能已經(jīng)在梨[10]、牛油果[11]和雞肉[12]上得到證實;醇溶蛋白基膠黏劑[13]的黏合性能良好,且比常見的大豆蛋白基膠黏劑疏水性更強;有研究者通過醇溶蛋白微粒負(fù)載潑尼松龍[14]以及兒茶素和高粱縮合單寧[15]證實了其在藥物控釋方面的潛力。對酒糟這一白酒工業(yè)副產(chǎn)物進行醇溶蛋白的提取及開發(fā),既能夠解決酒糟的堆積和污染、提高酒糟附加值,又能夠在一定程度上代替高粱和小麥等谷物,從而節(jié)約谷物的用量。

    研究者們已經(jīng)探索出了幾種對于醇溶蛋白提取的方法。EMMAMBUX等[16]通過修改一種廣泛應(yīng)用于玉米醇溶蛋白提取的方法,從而得到了醇堿法,并首次將其應(yīng)用到了高粱醇溶蛋白的提取,因提取效果良好而得到廣泛應(yīng)用;乙酸法是由TAYLOR等[17]開發(fā)的一種針對高粱醇溶蛋白提取的方法,由于乙酸相對于乙醇來說具有不易燃、宗教接受度高以及與食物相容的特性,因此被認(rèn)為是優(yōu)良的醇溶蛋白提取方法。除此之外,異丙醇[18]、叔丁醇[19]和堿性硼酸鈉/十二烷基硫酸鈉緩沖液[20]也在醇溶蛋白提取上有所應(yīng)用。

    本實驗以干燥前后濃香型白酒酒糟為研究對象,對蛋白組分分布進行分析后,分別用醇堿法和乙酸法提取酒糟中的醇溶蛋白,通過對醇溶蛋白提取得率及純度、分子質(zhì)量、氨基酸組成、基本結(jié)構(gòu)和熱性質(zhì)的分析比較,進而確定適合于干燥前后酒糟醇溶蛋白提取的方法,為酒糟醇溶蛋白的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ),提高酒糟的附加值。

    1 材料與方法

    1.1 樣品與試劑

    樣品:濃香型酒糟,安徽金種子酒業(yè)股份有限公司。

    試劑:無水乙醇、NaOH、CuSO4·5H2O、K2SO4、H2SO4、KOH、KBr、焦亞硫酸鈉、乙酸、三氯乙酸,AR級,國藥集團。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Kjeltec 8400凱氏定氮儀,丹麥FOSS公司;Agilent 1100高效液相色譜儀(high performance liquid chromatography,HPLC),美國Agilent公司;Centrifuge 5418冷凍離心機,德國Eppendorf公司;Avanti J-E高速冷凍離心機,美國Beckman Coulter公司;恒溫水浴鍋、電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海博訊實業(yè)有限公司;Millipore-Q超純水系統(tǒng),美國Millipore公司;冷凍干燥機,美國LABCONCO公司;RY-280A多功能粉碎機,永康市銳意機電有限公司;Nexus 400傅里葉紅外光譜儀,美國NICOLET公司;DSC Q2000差示掃描量熱儀,美國TA儀器公司。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 酒糟前處理

    鮮酒糟:從白酒廠直接取樣;干酒糟:將鮮酒糟置于70~80 ℃的電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定,并對烘干后的酒糟去除稻殼。

    1.3.2 酒糟蛋白組分分級提取

    采用Osborne分級提取法略作修改后,對酒糟各蛋白組分進行逐級分級提取,稱取適量酒糟粉,料液比為1∶10(g∶mL),提取時間2 h,重復(fù)2次;清蛋白:以超純水為提取溶劑,提取溫度20 ℃;球蛋白:以0.5 mol/L NaCl溶液為提取溶劑,提取溫度20 ℃;醇溶蛋白:以體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液為提取溶劑,提取溫度70 ℃;谷蛋白:以0.1 mol/L KOH溶液為提取溶劑,提取溫度90 ℃。

    1.3.3 酒糟醇溶蛋白的提取

    醇堿法:參照WANG等[21]的方法,對酒糟中的醇溶蛋白進行提取。以含質(zhì)量濃度5 g/L焦亞硫酸鈉和3.5 g/L NaOH的體積分?jǐn)?shù)70%乙醇水溶液作為提取劑,料液比1∶10(g∶mL),70 ℃攪拌提取1 h,3 500×g離心10 min,重復(fù)提取3次,收集上清液;將上清液乙醇體積分?jǐn)?shù)稀釋至40%后將其置于-20 ℃冰箱中靜置12 h;3 500×g離心10 min,收集沉淀,并用蒸餾水洗滌沉淀3次,凍干;用正己烷對凍干粉末進行脫脂,室溫下通風(fēng)櫥干燥,重復(fù)3次,即得酒糟醇溶蛋白粉末。

    乙酸法:參照TAYLOR等[17]的方法,取適量酒糟在相對其4倍體積的質(zhì)量濃度5 g/L焦亞硫酸鈉溶液中浸泡16 h,過濾后去除焦亞硫酸鈉溶液,用乙酸作提取劑,料液比1∶5(g∶mL),25 ℃下攪拌提取1 h,1 000×g離心10 min,重復(fù)提取3次,收集上清液;在冰浴條件下用飽和NaOH溶液將上清液pH調(diào)節(jié)到5.0以沉淀蛋白,4 ℃靜置12 h后3 500×g離心10 min,收集沉淀,并用蒸餾水洗滌沉淀3次,凍干;正己烷脫脂,室溫下通風(fēng)櫥干燥,重復(fù)3次,即得酒糟醇溶蛋白粉末。

    1.3.4 水解氨基酸測定

    稱取100.0 mg左右的酒糟醇溶蛋白于水解管中,加入8 mL 6 mol/L的 HCl溶液,充N23 min,放入120 ℃烘箱中水解22 h,加入4.8 mL 10 mol/L NaOH溶液中和水解樣品,用蒸餾水定容,雙層濾紙過濾后取1 mL于1.5 mL離心管中15 000×g離心30 min,取400 μL上清液進行HPLC分析;OPA柱前衍生,色譜柱為Hypersil ODS柱(4 mm×250 mm,5 μL);流動相A為體積比為500∶0.11∶2.5的27.6 mmol/L乙酸鈉∶三甲胺∶四氫呋喃(pH 7.2),流動性B為體積比為1∶2∶2的80.9 mmol/L乙酸鈉∶乙腈∶甲醇(pH 7.2),波長338和262 nm,流速1 mL/min;洗脫條件:初始體積分?jǐn)?shù)8%B,0~17 min為50%B,17.0~20.1 min為100%B,20.1~24.0 min為0%B;使用17種氨基酸作外標(biāo)[7]。

    1.3.5 傅里葉紅外光譜測定

    采用Nexus 400傅里葉紅外光譜儀分析酒糟醇溶蛋白的結(jié)構(gòu)。將約4 mg樣品和150 mg KBr在光滑的研缽中徹底研磨,在400~4 000 cm-1收集數(shù)據(jù)。

    1.3.6 差示掃描量熱儀測定

    酒糟醇溶蛋白的熱性質(zhì)采用DSC Q2000差示掃描量熱儀進行測定,該儀器在測試前已經(jīng)用銦和鋅進行了校準(zhǔn)。稱取5~10 g樣品于鋁盤中,密封后在N2下以50 mL/min的流速測定樣品,其中測定溫度以10 ℃/min的速率從25 ℃加熱到280 ℃。

    1.4 數(shù)據(jù)分析

    采用Excel和Origin Pro 9.1軟件進行統(tǒng)計整理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 酒糟蛋白組分分布

    根據(jù)溶解度的差異可將酒糟的蛋白質(zhì)分成不同組分,各蛋白組分分布情況如圖1所示。其中球蛋白的含量在酒糟總蛋白中的分布比例最低,谷蛋白和清蛋白次之,醇溶蛋白含量最高,占44%~50%,是白酒酒糟中含量最高的蛋白組分。因此,本研究對酒糟中的醇溶蛋白進行提取,以期提高白酒酒糟的附加值。

    圖1 白酒酒糟蛋白組分分布情況Fig.1 Protein fractionation of distiller’s grains of Baijiu

    2.2 酒糟醇溶蛋白的提取

    表1顯示了不同方法對新鮮和干燥白酒酒糟中醇溶蛋白的提取得率及純度,其中醇堿法的提取得率及純度均高于乙酸法,該結(jié)果與高粱干酒槽及其可溶物(distillers driers grains with solubles,DDGS)中提取醇溶蛋白的結(jié)果相似。對于干燥前后酒糟中醇溶蛋白的提取,醇堿法似乎并未受到較大影響,提取得率及純度較接近,而乙酸法雖蛋白提取純度相差無幾,但蛋白得率之間差異較大。因此,從提取得率及純度的角度看,醇堿法更適合于白酒酒糟中醇溶蛋白的提取。

    表1 白酒酒糟醇溶蛋白的提取得率及純度

    單位:%

    2.3 不同方法提取的干燥前后酒糟醇溶蛋白的比較

    2.3.1 分子質(zhì)量

    醇溶蛋白是由多個亞基組成的一類蛋白質(zhì),通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) 將酒糟醇溶蛋白按照分子質(zhì)量的差異分成不同條帶,結(jié)果如圖2所示。醇堿法提取的干燥前后酒糟醇溶蛋白的電泳條帶基本相同且表現(xiàn)的較清晰,其中分別分離到了分子質(zhì)量為25和23 kDa的α1和α2-醇溶蛋白以及18 kDa的β-醇溶蛋白,而乙酸法提取的醇溶蛋白由于提取純度相對較低,因而使分離到的蛋白亞基條帶強度低。

    M-蛋白質(zhì)Marker;泳道1-醇堿法提取的干酒糟醇溶蛋白;泳道2-醇堿法提取的鮮酒糟醇溶蛋白;泳道3-乙酸法提取的干酒糟醇溶 蛋白;泳道4-乙酸發(fā)提取的鮮酒糟醇溶蛋白圖2 白酒酒糟醇溶蛋白SDS-PAGE譜圖Fig.2 SDS-PAGE of prolamin from distiller’s grains of Baijiu

    2.3.2 氨基酸組成

    圖3顯示了不同方法提取的干燥前后白酒酒糟醇溶蛋白的氨基酸組成。其中谷氨酸、亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、天冬氨酸和纈氨酸是白酒酒糟醇溶蛋白中含量較高的氨基酸。醇堿法提取的干燥前后酒糟醇溶蛋白,其氨基酸無論在種類還是含量上均未因酒糟的干燥而產(chǎn)生較大差異;而乙酸法提取的醇溶蛋白,雖氨基酸種類相同,但在含量上存在著較明顯的差異;因此相比于乙酸法,醇堿法提取的醇溶蛋白的氨基酸含量更高,且干酒糟和鮮酒糟醇溶蛋白之間的氨基酸含量差異小。

    a-醇堿法;b-乙酸法圖3 白酒酒糟醇溶蛋白氨基酸組成Fig.3 Amino acid composition of prolamin from wet and dried distiller’s grains

    2.3.3 傅里葉紅外光譜測定

    醇溶蛋白提取物并非完全的純品,據(jù)文獻報道可能含有少量酚類及糖類物質(zhì)[16, 21]。圖4為白酒酒糟醇溶蛋白提取物的傅里葉紅外光譜(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)圖,醇堿法和乙酸法提取的干燥前后醇溶蛋白的光譜圖均表現(xiàn)的極為相似,醇堿法提取純度相對要高于乙酸法。其中白酒酒糟與高粱DDGS[21]中醇溶蛋白提取物的譜圖基本保持一致,從圖4中我們可以觀察到幾個特征吸收譜帶,其中包括位于3 300和3 070 cm-1處的酰胺A和A’,1 660、1 540和1 240 cm-1處的酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,而圖4中表現(xiàn)較強的為酰胺Ⅰ譜帶,其中酰胺Ⅰ被認(rèn)為是能夠代表蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的譜帶。

    a-醇堿法;b-乙酸法圖4 白酒酒糟醇溶蛋白傅里葉紅外光譜圖Fig.4 FTIR of prolamin from wet and dried distiller’s grains

    2.3.4 差示掃描量熱儀測定

    如圖5所示,相比于醇堿法,乙酸法提取的干燥前后酒糟醇溶蛋白,其差示掃描量熱儀(differential scanning calorimetry,DSC)熱譜圖顯示出了較大的差異,其中干酒糟和鮮酒糟分別在175.17和138.21 ℃附近出現(xiàn)吸熱峰。吸熱峰意味著醇溶蛋白的變性,表明乙酸法提取的干燥前后的酒糟醇溶蛋白在變性溫度上存在著較大差異;而醇堿法提取的醇溶蛋白的吸收峰位置分別在137.64和136.22 ℃附近,兩者之間的變性溫度差異小,表明所提取的干燥前后酒糟醇溶蛋白的變性溫度較一致,且與高粱中醇溶蛋白的變性溫度接近。

    a-醇堿法;b-乙酸法圖5 白酒酒糟醇溶蛋白熱分析圖Fig.5 Thermograms of prolamin from wet and dried distiller’s grains

    3 結(jié)論

    在實際應(yīng)用中,若要避免夏季高溫時的霉變,需對酒糟進行干燥處理,為盡量保持干酒糟和鮮酒糟中醇溶蛋白品質(zhì)的一致性,便于后續(xù)對酒糟及其醇溶蛋白的高附加值再利用,本研究分別采用醇堿法和乙酸法,探究適合于干燥前后白酒酒糟中醇溶蛋白的提取方法。從提取得率及純度上來看,醇堿法要優(yōu)于乙酸法,且醇堿法的提取效果并未因酒糟的干燥處理而受到顯著影響,而乙酸法對于鮮酒糟的提取得率顯著高于干酒糟;從醇溶蛋白來看,無論酒糟干燥與否,醇堿法提取的醇溶蛋白在分子質(zhì)量、氨基酸組成、FTIR和DSC方面均無明顯差異,而乙酸法提取的干燥前后酒糟醇溶蛋白,雖FTIR分析差異不明顯,但在分子質(zhì)量、氨基酸組成和DSC分析上均有所不同。綜上所述,醇堿法更適合于干燥前后白酒酒糟中醇溶蛋白的提取。

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