HPLC-MS測定增強免疫力類保健食品中非法添加的13種藥物成分

（河南省食品藥品檢驗所，河南 鄭州 450008）

增強免疫力類保健食品可補充機體所需營養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)機體功能，提高免疫力。一些不法分子為求高額利潤，向產(chǎn)品中添加針對性的化學(xué)藥品，從而提高產(chǎn)品療效，消費者食用后，會因攝入化學(xué)藥物過量引起嚴重的不良反應(yīng)，對消費者的身體造成嚴重傷害[1-3]。為進一步規(guī)范食品市場，2019年12月1日《中華人民共和國食品安全法實施條例》等政策正式實施，這也表明保健食品市場監(jiān)管將更加嚴格。

目前，針對保健食品中非法添加物質(zhì)的檢測方法，最常用的是超高效液相色譜法（UPLC）[4]及液質(zhì)聯(lián)用方法（HPLC-MS），HPLC-MS一般采用多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式[5-10]，這些方法存在檢測時間長、容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果等不足。本研究選取了增強免疫力類保健食品中常見添加的13個化學(xué)成分[11-12]，建立高效液相色譜-離子肼質(zhì)譜（HPLCITMS）分析方法，利用ITMS的優(yōu)點，選用MRM掃描觸發(fā)增強子離子掃描（MRM-IDA-EPI），首先可采用MRM掃描進行定量分析和第一步定性分析，當(dāng)MRM檢測出超出預(yù)設(shè)值的信號時會觸發(fā)增強子離子掃描（EPI），獲得高質(zhì)量子離子譜圖，通過與譜庫中對應(yīng)化合物子離子譜圖對比，達到進一步定性分析效果，完全避免假陽性結(jié)果。方法學(xué)驗證及樣品檢驗證明建立的方法可用于增強免疫力類保健食品中非法添加的藥物成分的快速篩查及定量分析。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-30A超高效液相色譜儀（日本島津）；QTRAP 6500+三重四級桿質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX）；Milli-Q超純水器（美國密理搏公司）；KQ-600DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器公司）；XPE205型電子天平（梅特勒-托利多）。

1.2 對照品與試劑

那紅地那非（批號：520039-201401，含量98.3 %，中國食品藥品檢定研究院）；紅地那非（批號：520047-201401，含量99.9 %，中國食品藥品檢定研究院）；伐地那非鹽酸鹽（批號：26480，含量99.3 %，北京曼哈格）；枸櫞酸羥基豪莫西地那非（批號：510032-201301，含量98.8%，中國食品藥品檢定研究院）；西地那非（批號：25530，含量99.9 %，北京曼哈格）；豪莫西地那非（批號：520046-201401，含量99.6 %，中國食品藥品檢定研究院）；氨基他達拉非（批號：520042-201401，含量99.8 %，中國食品藥品檢定研究院）；他達拉非（批號：25739，含量99.5 %，北京曼哈格）；硫代艾地那非（批號：26000，含量99.5 %，北京曼哈格）；偽伐地那非（批號：520041-201401，含量99.0 %，中國食品藥品檢定研究院）；那莫西地那非（批號：520040-201401，含量99.5 %，中國食品藥品檢定研究院）；去甲基他達拉非（批號：AL170606-14，含量98.56 %，Stanford Chemicals）；硫代西地那非（批號：26034，含量99.8 %，北京曼哈格）；甲醇，乙腈（色譜級，Merck）；甲酸（色譜級，Acros）；水為經(jīng)Milli-Q超純水器處理后的超純水。魚油軟膠囊（1000 mg/粒，批號：817250601，威海南波灣生物技術(shù)有限公司），澳天力牌蜂膠軟膠囊（500 mg/粒，批號：20180301-01，廣東美麗康保健品有限公司），大保龍牌螺旋藻咀嚼片（250 mg/片，批號：20180404，南寧富萊欣生物科技有限公司），澳天力牌牛初乳咀嚼片（0.5 g/片，批號：20171101-01，廣東美麗康保健品有限公司），怡生安康牌美齡丸（3 g/袋，批號：20180401，河南百消丹華南藥業(yè)有限公司），正官莊牌高麗參精丸[210 mg/粒，批號：40238001，正官莊六年根商業(yè)（上海）]，均為河南省食品藥檢驗所抽檢樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters BEH-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；以0.1 %甲酸溶液為流動相A，乙腈為流動相B，梯度洗脫：0～3 min，88 %～15 %A；3～4 min，15 %A；4～4.5 min，15 %～88 %A；4.5～6 min，88 %A。流速0.4 ml/min；柱溫40 ℃；進樣量3 μl。

2.2 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧離子源；電離模式：正離子模式；檢測方式：MRM-IDA-EPI；MRM掃描模式參數(shù)：氣簾氣（curtain gas）：30 psi；碰撞氣（collision gas）：中等（Medium）；離子化電壓：+5500 V；離子源溫度：600 ℃；噴霧氣：55 psi；輔助加熱氣：55 psi；EPI掃描模式的離子源參數(shù)與以上MRM掃描模式參數(shù)保持一致，各目標化合物監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)設(shè)定見表1。

2.3 溶液的制備

2.3.1 混合對照品溶液的制備 分別準確稱取適量上述對照品，用甲醇配制成500 μg/ml的貯備液，冷藏備用。取對照品貯備液各50 μl，置于同一25 ml量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液。再取混合對照品溶液適量，用80 %甲醇制成質(zhì)量濃度分別為2，10，25，50，100 ng/ml的混合對照品溶液。

表1 13種非法添加藥物的保留時間tR及質(zhì)譜參數(shù)

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品（片劑、丸劑取適量研細，軟膠囊和硬膠囊取適量內(nèi)容物混勻）0.5 g于50 ml量瓶中，加80 %甲醇適量，超聲30 min，放冷至室溫，再定容至刻度，搖勻，離心（6000 r/min）5 min，取上清，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得，如果檢出且含量較高，可再稀釋適量倍數(shù)。

2.3.3 陰性樣品溶液 取1.2項下膠囊劑、片劑和丸劑的陰性樣品（即13種非法添加藥物成分檢驗結(jié)果為陰性的樣品）各2份，按2.3.2項下方法制成3種劑型的陰性樣品溶液。

2.4 方法專屬性考察

取上述陰性樣品溶液、混合對照品溶液、加標陰性樣品溶液，按2.1、2.2項下色譜和質(zhì)譜條件進樣，得到色譜和質(zhì)譜圖，3種溶液的總離子流色譜圖見圖1，MRM定量離子對色譜圖見圖2。結(jié)果表明，陰性樣品溶液在每個離子對通道中均未見有干擾13種成分的色譜峰，且MRM定量離子對通道之間互不干擾，定量準確度好。上述3種劑型所含成分均不干擾目標物的測定，方法專屬性較好。

圖1 總離子流色譜圖

圖2 定量離子對色譜圖

2.5 線性范圍考察

取2.3.1項下混合對照品溶液，按2.1、2.2項下色譜和質(zhì)譜條件進樣，以目標組分定量離子的峰面積（Y）為縱坐標，濃度（X）為橫坐標，繪制標準曲線，見表2。結(jié)果表明，所有化合物在標準曲線范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r均在0.9939～1.0000范圍內(nèi)。

2.6 檢出限（LOD）和定量限（LOQ）

在陰性樣品中添加混合對照品溶液，用80 %甲醇逐步稀釋后進樣，以3倍信噪比計算各組分的LOD，10倍信噪比計算各組分的LOQ，結(jié)果見表2。結(jié)果表明方法具有很高的靈敏度，完全滿足非法添加藥物的檢測要求。

2.7 進樣精密度考察

取50 ng/ml混合對照品溶液，按2.1、2.2項下色譜和質(zhì)譜條件進樣，連續(xù)6次，記錄各非法添加藥物定量離子的峰面積，分別計算各成分峰面積的RSD，見表2。結(jié)果表明方法進樣精密度良好。

2.8 回收率試驗

取1.2項下膠囊劑、片劑、丸劑陰性樣品各6份，每份精密稱取0.5 g，分別置于50 ml量瓶中，各分3組，加入適量混合對照品溶液，按2.3.2項下方法分別制成0.5，2.0，5.0 μg/g添加水平供試品溶液。按2.1、2.2項下色譜和質(zhì)譜條件，進行回收率試驗，結(jié)果見表3。結(jié)果表明膠囊劑基質(zhì)中，非法添加藥物回收率均在70 %～112 %之間，片劑基質(zhì)中，非法添加藥物回收率均在66 %～112 %之間，丸劑基質(zhì)中，非法添加藥物回收率均在66 %～120 %之間，回收率良好。

表2 13種非法添加藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD、LOQ

2.9 精密度試驗

采用添加水平為2.0 μg/g的供試品溶液進行日內(nèi)和日間精密度試驗，按2.1、2.2項下色譜和質(zhì)譜條件進樣。日內(nèi)精密度由每隔2 h重復(fù)測定6次得到，日間精密度由連續(xù)3 d重復(fù)取樣測定得到。結(jié)果，日內(nèi)精密度RSD控制在0.7 %～4.0 %；日間精密度RSD控制在1.0 %～5.0 %，表明方法精密度良好。

2.10 樣品測定

本次研究共收集增強免疫力類保健食品近50批，按2.3.2方法配制樣品溶液，按2.1、2.2項下色譜和質(zhì)譜條件進樣測定。若樣品溶液中，有組分的色譜峰保留時間及相對豐度比與對照品一致，則可初步判定為檢出該組分，然后與譜庫中對應(yīng)化合物子離子譜圖對比，進一步判斷。根據(jù)定量離子對的色譜峰面積，采用外標法計算樣品中各非法添加藥物的含量。結(jié)果50批樣品中，有1批檢驗出西地那非，含量為24.3 mg/g，其余均未檢出。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究考察了常用的Waters BEH-C18色譜柱和Waters T3色譜柱[10]在水-乙腈、0.1 %甲酸水溶液-乙腈、0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸乙腈溶液、10 mmol/L乙酸銨-乙腈4種流動相體系中的保留效果、峰型和質(zhì)譜響應(yīng)等，結(jié)果表明，C18柱明顯優(yōu)于T3柱；添加甲酸可明顯提高質(zhì)譜的響應(yīng)值，以0.1 %甲酸水溶液-乙腈和0.1 %甲酸水溶液-0.1 %甲酸乙腈溶液流動相體系最佳，且兩種流動相體系的質(zhì)譜響應(yīng)值無明顯差別。綜上，采用Waters BEH-C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和0.1 %甲酸水溶液-乙腈流動相體系，保留效果、峰型等均滿足實驗要求。最后對梯度洗脫程序進行了優(yōu)化，保證了在短時間（6 min）內(nèi)所有化合物得到較好的分離。

3.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

本次研究利用了ITMS的特點，采用MRMIDA-EPI掃描模式。該掃描模式分為兩步，首先采用MRM掃描模式，比較了正、負離子模式下13種非法添加藥物的質(zhì)譜響應(yīng)，發(fā)現(xiàn)正離子模式下，響應(yīng)更好，故選擇正離子模式。選擇合適的母離子，并在不同碰撞能量下對子離子進行優(yōu)化，選擇2個響應(yīng)高且穩(wěn)定的子離子，最后再對2個子離子的碰撞能量和去簇電壓進行優(yōu)化，并將響應(yīng)相對較高的子離子作為定量離子，另一個作為定性離子。然后在EPI模式下，發(fā)現(xiàn)去簇電壓為50 V，碰撞能量為35 V時，能得到滿意的增強子離子掃描圖。

3.3 譜庫的建立

取50 ng/ml混合對照品溶液，按2.1、2.2項下色譜和質(zhì)譜條件進樣，利用得到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)建立13種添加物的二級質(zhì)譜圖譜庫，見圖3。

表3 13種非法添加藥物回收率

圖3 13種非法添加藥物的增強子離子掃描質(zhì)譜圖

在實際進行樣品檢測時，采用MRM-IDA-EPI模式，首先進行MRM檢測，可根據(jù)定性離子和定量離子的質(zhì)譜圖對樣品進行第一步定性和定量。當(dāng)某個通道探測掃描采集到的信號強度超過預(yù)設(shè)值時（即“出現(xiàn)色譜峰”），系統(tǒng)會觸發(fā)EPI檢測，獲得二級質(zhì)譜圖。將二級質(zhì)譜圖與建立的譜庫進行對比，并給出兩者的相似程度結(jié)果，達到進一步的定性，避免“假陽性”現(xiàn)象。如圖4為2.9項下檢測出西地那非的增強子離子掃描質(zhì)譜圖，圖5為樣品與譜庫對比圖，與譜庫中西地那非增強子離子掃描質(zhì)譜圖對比，相似度為88.6 %，進一步定性為西地那非。

圖4 樣品中西地那非的增強子離子掃描質(zhì)譜圖

圖5 樣品與譜庫中西地那非增強子離子掃描對比圖

4 結(jié)論

利用ITMS的IDA掃描模式成功建立了HPLCITMS聯(lián)用法，能快速篩查和同時測定增強免疫力類保健食品中非法添加的13種藥物成分。本方法分析時間短，定性準確性更高，提高了非法添加檢測效率，對規(guī)范保健食品市場有重要意義。