基于網絡藥理學分析重用生白術組方治療小兒功能性便秘的作用機制

梁學玲 秦艷虹

1 山西中醫(yī)藥大學(太原 030000) 2 山西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院( 太原 030000)

小兒便秘[1]為臨床常見病、多發(fā)病，其嚴重危害小兒的身心健康；一般是指非器質性病變的各種原因所導致的糞便在腸內滯留時間過久，秘結不通，排便周期延長，或周期不長，但糞質干結，排出困難，或糞質不硬，雖有便意，但便而不暢的病癥。目前，國內外“便秘診治指南”多數(shù)認為便秘屬于功能性胃腸病[2]。因其發(fā)病受地理環(huán)境、種族特征、飲食習慣、家庭教育等各種因素的影響，故本病的發(fā)病率報道各異。根據(jù)流行病學的統(tǒng)計，在正常小兒群體中，其便秘發(fā)病率為0.2%～28%[3]。如此高的發(fā)病率已嚴重影響小兒的健康成長。因此，如何有效治療小兒便秘意義重大。白術[4]：菊科植物白術Atractylodes macrocephala Koidz的干燥根莖，以浙江、湖南、湖北等為主要產地。其味甘、苦，性溫。歸脾、胃經，功效為益氣健脾、燥濕利水、止汗、安胎等。臨床廣泛應用于脾氣虛證、氣虛自汗及脾虛胎動不安等病癥。目前，針對小兒便秘的藥物以酪酸梭菌活菌片、麻仁軟膠囊、開塞露、小兒消食顆粒等為主。導師秦艷虹教授在臨床中重用生白術治療小兒功能性便秘取得了較好的療效，但具體的作用機制尚未見有關報道。

小兒臟腑嬌嫩，?？梢娢迮K六腑功能狀況不夠穩(wěn)定、發(fā)病傳變迅速。飲食稍有不慎，易出現(xiàn)食積、便秘等癥[5]。白術具有益氣健脾、燥濕利水的功效，很少見白術用于治療小兒便秘。但現(xiàn)代藥理研究[6]發(fā)現(xiàn)白術可通過影響乙酰膽堿(Ach)和P物質(SP)兩個胃腸道最重要的興奮性神經遞質的分布以促進腸道運動。經查閱文獻可知關于白術治療便秘的最早記載為張仲景所著方書之祖《傷寒論》。原文第174條[7]：“傷寒八九日，風濕相搏，身體疼煩，不能自轉側，不嘔不渴，脈浮虛而澀者，桂枝附子湯主之；若大便堅，小便自利者，去桂加白術湯主之”?！侗静菡x》云白術“最富脂膏, 雖苦溫能燥, 而亦滋津液”“以其豐于脂膏, 故宜于煎劑”“萬無傷陰之慮”。說明白術通便, 機制主要是健脾助運, 津液得行, 且質潤生津滋液, 二者相佐, 大便得通。清代王泰林在《王旭高醫(yī)書六種》中道[8]“白術生腸胃之津液，大便硬是腸胃之津液干枯，故加白術”，道出生白術可潤腸通便的機理。當代最先見于北京名中醫(yī)魏龍驤先生，他在《醫(yī)話四則：白術通便秘》中說到“故余治便秘，概以生白術為主，少則一、二兩，重則四、五兩，便干結者加生地以滋之，時或少佐升麻，乃升清降濁之意”[9]，其認為大便干結是由于陰津虧少，腸道失于濡潤。但若單純專于滋潤，而不健運脾土，則脾不能為其行津液，屬治標，重用生白術運化脾陽，實為治本之意[10]。陶賢周[11]在臨床中重用生白術治療老年人便秘效佳。朱樹寬[12]認為生白術30 g以下，可起到益氣健脾的功效，專于補，而用至30 g以上，則專于通利。中醫(yī)傳統(tǒng)觀念認為，改善腸道津液的狀況，增強腸道蠕動能力是治療便秘的關鍵之所在。生白術可健脾益氣，脾主為胃行其津液，津液得行則燥便得通。導師秦艷虹教授總結前人經驗，結合自身多年臨床經驗認為重用生白術特別適用于小兒功能性便秘，認為“增水行舟”是治療便秘的基本大法。

中藥具有多成分、多途徑、多層次和多靶點的特點[13]，很難明確中藥藥效的物質基礎及其作用機制。許多學者嘗試用現(xiàn)代醫(yī)學解釋中藥的作用機制。網絡藥理學[14]是基于系統(tǒng)生物學理論，對生物系統(tǒng)的網絡進行分析，選取特定信號節(jié)點進行多靶點藥物的分子設計的新學科，是建立在高通量組學數(shù)據(jù)分析、計算機虛擬計算及其網絡數(shù)據(jù)庫檢索基礎上的生物信息網絡構建及網絡拓撲結構分析策略和基數(shù)基礎上的實驗方法。 目前，網絡藥理學因其數(shù)據(jù)獲取渠道多、種類豐富、涵蓋面廣、能對抽象且龐大的數(shù)據(jù)內容進行可視化分析等特點，被應用在臨床醫(yī)學、藥學、生物信息等多個學科領域數(shù)據(jù)處理過程中[15-16]。 網路藥理學[17]這一概念于2007年由英國藥理學家Hopkins率先提出，是基于系統(tǒng)生物學和多向藥理學等學科理論，從多維度視角理解藥物干預疾病的分子機制。研究表明，通過網絡藥理學的方法研究中藥的作用機制符合中醫(yī)藥整體觀念，方法準確，結果可信度高。如林適等[18]運用網絡藥理學研究骨碎補治療骨質疏松癥的作用機制，得出其有多靶點、多通路、多系統(tǒng)的特性的觀點。黃啟和等[19]應用分子對接技術篩選延胡索抗心肌缺血物質的基礎研究，認為其含有治療心肌缺血主要的物質基礎。馬新稱等[20]運用網絡藥理學理論研究鉤藤治療高血壓的作用機制，為其臨床應用提供依據(jù)。很多學者均運用此方法研究中藥的分子機制，為深入研究重用生白術防治便秘的作用機制奠定了基礎。本文以生白術為研究對象，采用網絡藥理學方法，探究生白術防治便秘的作用機制，為臨床治療便秘提供數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 篩選化學成分及相應靶點

以口服生物利用度(OB)>30%，并且化合物類藥性(DL)>0.18為篩選條件[21]，從TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中檢索白術的化學成分并收集化合物的相應靶點。其中生物利用度和類藥性是篩選化合物的重要指標，值越高，表明越有可能被開發(fā)為臨床藥物。

1.2 便秘相關靶點的獲得

從Gene Cards、OMIM共2個疾病相關靶點的數(shù)據(jù)庫中檢索便秘相關靶點，篩選關鍵詞設置為“constipation”,設定物種為“Homo sapiens”。

1.3 藥物靶點和疾病靶點交集

利用R語言，對“1.1”“1.2”所得到的藥物預測靶點和疾病靶點集合的靶點名稱，取交集。

1.4 中藥調控網絡構建

根據(jù)上述的靶點預測結果，采用Cytoscape 3.7.1構建藥物-成分-基因-疾病的思維網絡模型圖。在網絡中，用不同的形狀表示藥物、化學成分、交集基因、疾病等信息，連接線表示兩節(jié)點間存在關聯(lián)或映射關系。并利用STRING在線數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/)進行蛋白相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網絡的構建，獲得清晰的可視化框架，以便于篩選關鍵基因。

1.5 基因本位論分析

基因本位論(GO)[22]是描述基因產物功能并廣泛應用于生物信息學領域的一個本體。本次研究采用R語言中的CludterProfiler包對生白術-便秘交集靶點進行GO富集分析，以P值反映蛋白質生物功能的顯著性(P<0.05表示有顯著性)。

1.6 KEGG通路富集分析

應用R語言中的CludterProfiler包對生白術-便秘交集靶點進行KEGG富集分析，篩選出顯著富集的通路。當P<0.05時，則可以認為其是具有顯著性的關鍵性通路；P值越小，顯著程度越高。

2 結 果

2.1 生白術-便秘交集靶點的預測結果

檢索得到白術中有效成分數(shù)目為7個，預測靶點數(shù)目為774個。通過GeneCards數(shù)據(jù)可篩選獲得疾病靶點2 859個，取藥物與疾病靶點的交集，共五個。具體有效成分見表1，篩選后藥物靶點見表2，交集靶點見圖1，網絡可視化圖譜見圖2。(圖中，八邊形代表藥物，菱形代表疾病，長方形代表中藥有效成分，橢圓形代表篩選獲得的交集基因)

表1 白術篩選后得到的7個活性成分

表2 白術對應藥物靶點信息

續(xù)表

圖1 生白術-便秘交集圖

圖2 生白術-便秘“有效成分-有效靶點”網絡

2.2 PPI網絡圖

利用STRING數(shù)據(jù)平臺，將藥效團匹配得到的5個共同靶標進行蛋白互作分析，結果發(fā)現(xiàn)其中4個靶標可發(fā)生相互作用(1個靶標未參與蛋白互作)，其包含10條相互作用的邊。由結果知毒蕈堿性膽堿受體M1(CHRM1)和其他蛋白的互相關聯(lián)程度最高，說明其可能參與的藥理作用最明顯。蛋白互作網絡見圖3。

圖3 生白術-便秘靶蛋白PPI網絡

2.3 生白術-便秘疾病交集靶點的GO分析結果

GO分析結果顯示，5個靶點共計富集26項生物過程，包括神經遞質受體的活動、乙酰膽堿受體的活動，磷脂酰肌醇磷脂酶活性、G蛋白偶聯(lián)神經遞質受體活性、磷脂酶C活性、神經遞質結合等，見圖4和圖5所示。

圖4 生白術防治便秘活性靶點GO富集分析柱狀圖

圖5 生白術防治便秘活性靶點GO富集分析氣泡圖

2.4 KEGG通路富集分析結果

對5個生白術-便秘交集靶點的KEGG通路富集分析結果顯示，P<0.05的生白術治療便秘所涉及的信號通路有6個，分別為膽堿能突觸、鈣信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調控、神經活性配體-受體相互作用、CAMP信號通路、磷酸肌醇-3(PI3K)-蛋白肌酶B(AKT)信號通路來治療便秘。(圖6為膽堿能突觸信號通路)

圖6 膽堿能突觸信號通路

3 討 論

小兒便秘為多因素、多途徑引發(fā)的較為復雜的疾病?，F(xiàn)代藥理學研究表明[23]，白術主要含有揮發(fā)油、多糖和苷類等，具有利尿、抗菌、免疫調節(jié)、消炎的作用，對消化系統(tǒng)也有一定的作用。本文通過網絡藥理學方法構建生白術的分子作用網絡，預測其治療便秘的作用機制。在構建的“成分-靶點”核心網絡中，預測了生白術7種潛在藥效成分和2 859個便秘相關靶點。篩選的2種潛在藥效成分均作用于PGR、CHRM3、CHRM1、ACHE、CHRM2共5個便秘靶點，體現(xiàn)了中藥多成分、多靶點協(xié)同作用的特點。

在疾病-成分-靶點網絡中，2種藥效成分作用于5個便秘靶點，其中CHRM1、CHRM2、CHRM3、ACHE四個靶點相關度較高。已有研究表明，膽堿能神經元末梢的胞質中乙酰膽堿由VACH T負責轉運并包裝成突觸囊泡，在囊泡中儲存直到釋放，以作用于乙酰膽堿受體[24]。M膽堿受體大量分布在胃腸道平滑肌及腺體等部位，其中CHRM1主要分布在胃壁細胞、神經節(jié)及中樞神經系統(tǒng)中，受體接收到乙酰膽堿的激動則會表現(xiàn)出胃腸道及其它臟器平滑肌收縮、腺體分泌增加、胃腸活動加快等效應[25]。膽堿能神經在胃腸運動的神經調控中起重要作用，通過釋放乙酰膽堿，作用于胃腸道ICC細胞(Cajal間質細胞是一類特殊的介于神經細胞與成纖維細胞之間的胃腸道間質細胞)膜膽堿能毒蕈堿受體(CHRM)進一步影響平滑肌的收縮[26]。ACHE對胃腸平滑肌收縮有著重要的作用，可研究生理或病理狀態(tài)下胃腸運動的變化，目前公認的ACHE增強則代表ACHE釋放增加，其作用于平滑肌M受體，可開放質膜上L型Ca2+通道，使Ca2+內流而加強胃腸平滑肌收縮[27]。由此推測，生白術可能通過作用于以上靶點發(fā)揮治療便秘的作用。

已有研究發(fā)現(xiàn)，治療便秘的藥物機制主要是通過增加腸內興奮性神經肽表達來刺激腸道蠕動，減少腸內非膽堿能非腎上腺素能神經遞質表達來減輕對腸蠕動的抑制，減少黏膜和黏膜下層水腫糜爛程度或炎性細胞數(shù)量并保持腺體規(guī)整從而達到維護腸道排便功能的目的[28]。本文分析結果顯示，生白術治療便秘參與調節(jié)膽堿能突觸、鈣信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調控、神經活性配體-受體相互作用、CAMP信號通路、PI3K-AKT信號通路共6條信號通路。根據(jù)預測結果推測生白術防治便秘主要是參與調節(jié)膽堿能神經的CHRM1、CHRM2、CHRM3等靶點調節(jié)神經活性配體-受體相互作用，G 蛋白偶聯(lián)受體參與調節(jié)鈣信號通路、CAMP信號通路、PI3K-AKT信號通路、肌動蛋白細胞骨架的調控有關。

總之，本文采用網絡藥理學方法構建生白術的“成分-靶點-信號通路”網路，從整體上分析其潛在藥效成分、靶點、信號通路之間的相互作用關系，從多個角度探討生白術防治便秘的潛在作用機制。研究結果初步驗證了生白術的基本藥理學作用和相關作用機制，為進一步深入探討重用生白術防治便秘作用機制奠定了良好的理論基礎，也為臨床重用生白術防治小兒便秘提供了理論依據(jù)，后期要通過動物實驗、基因芯片技術進行驗證，以更好的指導臨床應用。