人腦膠質(zhì)瘤MGMT和TopoⅡ基因的表達(dá)對(duì)其化療敏感性的影響觀察

陳穎東 宋清宇

廣州市第八人民醫(yī)院(廣州 510000)

人腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤(簡(jiǎn)稱“腦膠質(zhì)瘤”)是一種彌漫性中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤疾病，約占顱內(nèi)腫瘤的45%和顱內(nèi)惡性腫瘤的80%，此疾病于1938年由國(guó)外學(xué)者Nevin首次描述并給予命名，WHO將膠質(zhì)瘤分為星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤、少枝膠質(zhì)細(xì)胞瘤、室管膜瘤和胚胎性腫瘤，其中以星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤最為常見(jiàn)[1-2]。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段、多因素作用的產(chǎn)物，但目前其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，以現(xiàn)有的干預(yù)手段難以治愈。盡管化療在臨床腫瘤的治療中占重要地位，其治療效果卻往往不盡如人意。腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥是困擾腫瘤治療的關(guān)鍵性難題，同時(shí)也是導(dǎo)致腫瘤化療失敗的常見(jiàn)原因。腦膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制是多種基因共同參與的復(fù)雜過(guò)程[3]。因此，探索和研究腦膠質(zhì)瘤組織中相關(guān)的耐藥基因的表達(dá)情況可用于判斷腫瘤的惡性程度，同時(shí)鑒別臨床化療敏感性，為開(kāi)展膠質(zhì)瘤個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。O6—甲基鳥(niǎo)嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(MGMT)、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)分別屬于DNA修復(fù)酶、細(xì)胞核基質(zhì)酶蛋白，近年來(lái)逐漸引起臨床醫(yī)學(xué)的關(guān)注，已被證實(shí)與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展具有一定相關(guān)性[4-5]。本研究進(jìn)一步分析MGMT、TopoⅡ基因的表達(dá)情況及其對(duì)腦膠質(zhì)瘤化療敏感性的影響，以期將為腦膠質(zhì)瘤的診斷治療、預(yù)后評(píng)估提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本收集

收集醫(yī)院2012年4月—2018年6月期間進(jìn)行開(kāi)顱手術(shù)切除的新鮮膠質(zhì)瘤標(biāo)本80例，因頭暈、頭痛、記憶力和視力下降、惡心嘔吐、肢體麻木或乏力、間歇性癲癇發(fā)作等表現(xiàn)入院，均經(jīng)細(xì)胞學(xué)或組織病理學(xué)證實(shí)，其中男40例，女40例，年齡20～70歲，中位年齡44歲，平均(48.36±9.49)歲，包括星形細(xì)胞瘤29例、室管膜瘤24例、少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤18例、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤9例；根據(jù)2007最新(第4版)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[6]對(duì)其進(jìn)行病理分級(jí)，包括Ⅱ級(jí)27例、Ⅲ級(jí)36例、Ⅳ級(jí)17例。另外收集同期入院就診并經(jīng)顱腦手術(shù)治療的腦外傷或腦出血內(nèi)減壓切除的正常腦組織30例作為對(duì)照，其中男15例，女15例，年齡20～70歲，中位年齡45歲，平均(47.22±10.55)歲。兩組性別分布、年齡比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，認(rèn)為可比性充分。以上所有標(biāo)本均由患者或其家屬簽署知情同意書(shū)，并經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過(guò)。

1.2 MGMT和TopoⅡ基因的表達(dá)檢測(cè)

1.2.1 免疫組化檢測(cè) 將膠質(zhì)瘤標(biāo)本、正常腦組織標(biāo)本蠟塊連續(xù)切片，片厚5.0 μm；將石蠟切片置于60 ℃烤片烘烤120 min，將石蠟切片100%乙醇中3 min，然后按95%、80%、70%梯度水化，來(lái)水沖洗；切片置入含抗原修復(fù)液(檸檬酸)的高壓鍋中，加熱至沸騰，持續(xù)2 min后于室溫下自然冷卻，完成抗原修復(fù)。接下來(lái)滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，通過(guò)室溫下避光孵育15 min，PBS洗滌3次(每次30 min)，加入鼠抗人MGMT抗體(一抗)50 μL 4 ℃冰箱過(guò)夜孵育；PBS液沖洗3次后，二抗室溫孵育15 min，PBS洗滌3次(每次 4 min)，去除PBS液。配制顯色液，混勻后滴至切片，顯微鏡下觀察1～3 min；自來(lái)水沖洗5 min，蘇木素復(fù)染3 min，0.1%鹽酸分化5 s，流水沖洗 5 min，PBS返藍(lán)。最后切片經(jīng)梯度酒精浸泡脫水，二甲苯浸泡透明，待切片干燥后用中性樹(shù)膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.2.2 結(jié)果判定 由我院2位高資歷病理醫(yī)師采用雙盲法觀察每張切片，隨機(jī)選取5個(gè)高倍顯微鏡(400×)視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比兩者乘積進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度：0分：無(wú)著色；1分：著淺黃色：2分：著棕黃色；3分：著棕褐色。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比：顯微鏡下觀察10個(gè)高倍視野(400×)下每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，取10個(gè)視野的百分比平均數(shù)，0分：陽(yáng)性細(xì)胞<5%；1分：陽(yáng)性細(xì)胞5%～25%；2分：陽(yáng)性細(xì)胞25%～50%；3分：陽(yáng)性細(xì)胞50%～75%；4分：陽(yáng)性細(xì)胞>75%。染色強(qiáng)度評(píng)分與陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分相乘，0分為陰性(-)，1～4分為弱陽(yáng)性(+)，5～8分為中度陽(yáng)性(++)，9～12分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.3 藥敏試驗(yàn)

1.3.1 腦膠質(zhì)瘤U251、U87細(xì)胞培養(yǎng) U251、U87細(xì)胞被培養(yǎng)在DMEM培養(yǎng)基中，此培養(yǎng)基含有10%胎牛血清，不含抗生素，生長(zhǎng)環(huán)境為5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.3.2 體外藥物干預(yù) 腦膠質(zhì)瘤U251、U87細(xì)胞以 2×106/孔接種于96孔板后第2 d加替莫唑胺，先通過(guò)出MTT求出加入替莫唑胺作用72 h的IC50；接種6孔板，第2 d加入替莫唑胺至終濃度(略低于IC50濃度)，每2 d更換1次加藥的培養(yǎng)基，作為實(shí)驗(yàn)組，1 d后收取細(xì)胞做后續(xù)試驗(yàn)，不加藥的作為陰性對(duì)照組。

1.3.3 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn) U251、U87細(xì)胞體外侵襲力的測(cè)定在Transwell小室中進(jìn)行。4 ℃融解Matrigel每孔50 μL加入預(yù)冷的Transwell小室的上室中，將培養(yǎng)板置于37 ℃孵育1 h，少量PBS 清洗各孔。用含1% 牛血清白蛋白(BSA)的無(wú)血清培養(yǎng)液調(diào)整U251和U87細(xì)胞密度為1×106/mL 每孔200 μL加入各孔上室，下室加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液作為趨化因子。37 ℃、5%CO2孵育24 h后棄去上室液體，取出聚碳酸酯膜，擦凈膜上的Matrigel膠及上室未穿膜的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30 min，1%結(jié)晶紫染色，隨機(jī)于100倍光鏡下取上、下、左、右、中心5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞，取其平均數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 MGMT和TopoⅡ基因表達(dá)情況

膠質(zhì)瘤標(biāo)本、正常腦組織MGMT和TopoⅡ基因表達(dá)程度分布比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且二者M(jìn)GMT基因的陽(yáng)性表達(dá)率分別為63.75%、3.33%，TopoⅡ基因的陽(yáng)性表達(dá)率分別55.00%、0.00%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1～2。MGMT在細(xì)胞核顯示為呈棕黃色顆粒(陽(yáng)性染色)；TopoⅡ在細(xì)胞核表現(xiàn)為棕黃色顆?；驈浬⒎植嫉年?yáng)性顯色。見(jiàn)圖1～2。

表1 MGMT表達(dá)情況

表2 TopoⅡ基因表達(dá)情況

圖1 MGMT基因在膠質(zhì)瘤、正常腦組織中的表達(dá)(×200)注：圖A、B分別為Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤(++)、正常腦組織(-)中MGMT基因表達(dá)情況

圖2 TopoⅡ基因在膠質(zhì)瘤、正常腦組織中的表達(dá)(×200)注：圖A、B分別為Ⅲ級(jí)膠質(zhì)瘤(++)、正常腦組織(-)中TopoⅡ基因表達(dá)情況

2.2 Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組替膜唑胺干預(yù)前U251、U87細(xì)胞穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組U251、U87細(xì)胞穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)高于陰性對(duì)照組(P<0.05)，提示干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組U251、U87細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲力。見(jiàn)表3。

表3 替膜唑胺干預(yù)前、后U251、U87細(xì)胞侵襲力比較

3 討 論

隨著影像學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和相關(guān)設(shè)備的普及應(yīng)用，國(guó)內(nèi)腦膠質(zhì)瘤的檢出率不斷提高[7]。改善膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的主要治療方法為手術(shù)切除，由于腦膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，具有浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的特性，生長(zhǎng)迅速且具有較強(qiáng)的侵襲能力，手術(shù)切除相對(duì)困難；盡管化療在臨床惡性腫瘤的治療中占重要地位，但是其治療效果卻往往不盡如人意，如相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)50%以上的惡性腦膠質(zhì)瘤對(duì)常規(guī)化療藥卡莫司丁耐藥，致使其對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的治療有效率僅為20%左右[8]。目前，腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物耐藥是困擾腦膠質(zhì)瘤治療的關(guān)鍵性難題，而腦膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制是多種基因共同參與的復(fù)雜過(guò)程。近年來(lái)，實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)腦膠質(zhì)瘤各種治療效果及預(yù)后的差異是由于腫瘤的異質(zhì)性造成的，即組織病理學(xué)相同的膠質(zhì)瘤類型其基因水平的改變可能不同，而分子病理學(xué)一般通過(guò)運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)基因水平的差異[9]。

MGMT是一種普遍存在的DNA修復(fù)酶，可降低多種化學(xué)藥物的細(xì)胞毒作用。He[10]等的研究表明，MGMT啟動(dòng)子甲基化將獲益于替莫唑胺化療，當(dāng)無(wú)甲基化時(shí)替莫唑胺可誘導(dǎo)MGMT修復(fù)DNA損傷，從而促成化療耐藥。國(guó)內(nèi)近期報(bào)道證實(shí)，MGMT是膠質(zhì)瘤組織耐受烷化劑類抗癌藥的主要原因之一，MGMT表達(dá)陰性的膠質(zhì)瘤患者化療效果明顯優(yōu)于MGMT陽(yáng)性者[11]。Topo屬于細(xì)胞核基質(zhì)酶蛋白，主要包括同工酶TopoI、TopoII，二者在DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、重組及染色體分離中扮演重要角色[12]。研究發(fā)現(xiàn)，TopoII在細(xì)胞周期的S 期和G2/M期內(nèi)表達(dá)最高，故其表達(dá)水平可能與細(xì)胞增殖性存在關(guān)聯(lián)[13]。多數(shù)研究認(rèn)為T(mén)opoII在多種腫瘤中存在高表達(dá)，且TopoⅡ基因的表達(dá)情況與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度具有一定關(guān)系[14-15]。本研究采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定MGMT、TopoⅡ基因在腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本、正常腦組織標(biāo)本中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤標(biāo)本、正常腦組織MGMT和TopoⅡ基因表達(dá)程度分布差異比較均有顯著性，且膠質(zhì)瘤標(biāo)本中MGMT、TopoⅡ基因的陽(yáng)性表達(dá)率均顯著高于正常腦組織，MGMT、TopoⅡ基因均在細(xì)胞核顯示為陽(yáng)性染色。提示MGMT和TopoⅡ基因在人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率高，與劉平[16]等的結(jié)果一致，均證實(shí)MGMT和TopoⅡ基因與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

本研究通過(guò)Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加藥(替莫唑胺)前后腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和U87細(xì)胞的侵襲能力，發(fā)現(xiàn)體外藥物干預(yù)的實(shí)驗(yàn)組、未進(jìn)行藥物干預(yù)的陰性對(duì)照組干預(yù)前U251、U87細(xì)胞穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)比較無(wú)顯著性，但干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組U251、U87細(xì)胞穿膜細(xì)胞計(jì)數(shù)高于陰性對(duì)照組，提示干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組U251、U87細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲力，表明MGMT和TopoⅡ基因可能參與促進(jìn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲，進(jìn)而影響腫瘤化療敏感性。Holmes[17]等的研究指出，MGMT表達(dá)陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞對(duì)烷化劑抗癌藥耐藥性比MGMT表達(dá)陰性更強(qiáng)，故在MGMT表達(dá)陽(yáng)性的惡性膠質(zhì)瘤中下調(diào)MGMT表達(dá)能夠改善替莫唑胺的治療效果。呂雨虹[18]等的研究則證實(shí)了TopoⅡ基因?qū)Υ笫驝6膠質(zhì)瘤細(xì)胞順鉑化療敏感性有一定的影響。上述研究分別說(shuō)明MGMT、TopoⅡ基因與腦膠質(zhì)瘤治療過(guò)程中的耐藥性有關(guān)，故推測(cè)二者對(duì)指導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤的臨床意義重大，且國(guó)內(nèi)外已陸續(xù)有學(xué)者展開(kāi)研究，如亓旭晨[19]等的研究認(rèn)為T(mén)opoⅡ基因能夠催化DNA鏈的斷裂和結(jié)合，參與腦膠質(zhì)瘤耐藥性的形成，同時(shí)，該研究將針對(duì)TopoⅡ設(shè)計(jì)的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入多藥耐藥細(xì)胞株中，證實(shí)其可逆轉(zhuǎn)腦膠質(zhì)瘤的多藥耐藥性。蔡曉君[20]等、Stechishin[21]等的研究均發(fā)現(xiàn)通過(guò)降低MGMT的表達(dá)，可增強(qiáng)惡性腦膠質(zhì)瘤對(duì)替莫唑胺的化療敏感性。因此，我們認(rèn)為MGMT、TopoⅡ基因可為腦膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后評(píng)估提供新的途徑，進(jìn)而有望成為腦膠質(zhì)瘤治療的新靶點(diǎn)。