固定化法枸杞葡萄皮渣醋的發(fā)酵工藝探討

張存智，劉晶，張宏，趙建華

(1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銀川 750021；2.寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校，銀川 750021；3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院，銀川 750002)

在葡萄釀酒過程中，產(chǎn)生大量的皮渣副產(chǎn)物，約占葡萄加工量的25%～30%。在新鮮紅葡萄皮渣中，含有花色素類、白藜蘆醇、黃酮類、酵母自溶物質(zhì)等多種有效成分，具有抗氧化、降低血脂膽固醇、軟化血管、抗癌抑癌、美容養(yǎng)顏之功效。目前我國絕大多數(shù)的葡萄皮渣得不到有效利用，一般作為飼料、肥料，甚至垃圾處理，資源綜合利用率很低[1-3]。枸杞中富含枸杞多糖、甜菜堿等有效成分，具有提高免疫力、抗衰老、抗腫瘤、保肝等保健作用[4,5]。

果醋被譽為“第四代飲料”，通常是以葡萄、蘋果和桑葚等水果或果品加工的下腳料為主要原料，經(jīng)酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵釀造而成[6]。徐敏[7]利用葡萄皮渣釀造果醋，李彩霞等[8]利用葡萄和枸杞釀造復(fù)合果醋，但以壓榨后常溫保存的新鮮葡萄皮渣和干枸杞微粉復(fù)配進行枸杞葡萄醋工藝研究未見報道。液態(tài)固定化法釀造果醋也有報道[9-12]，但以玉米芯為固定化載體進行枸杞葡萄醋工藝研究未見報道。

本研究以室溫保存的新鮮葡萄皮渣和干枸杞微粉為原料，以玉米芯為固定化載體，采用固定化法醋酸液態(tài)發(fā)酵工藝，研究皮渣的新鮮度、枸杞微粉添加量對皮渣酒液和醋液酚類物質(zhì)含量及醋感官品質(zhì)的影響，以及不同工業(yè)醋酸菌菌種篩選，為高效利用葡萄皮渣，簡化果醋發(fā)酵工藝提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干枸杞：寧夏山里紅生物科技有限公司中寧特級枸杞。

葡萄皮渣1：2017年，玉泉營“美樂”葡萄正常發(fā)酵，殘?zhí)? g/L，螺旋壓榨，干重為33.8%(100 g的皮渣在40 ℃下烘干3 h后的重量)。

葡萄皮渣2：2017年，玉泉營“美樂”∶玫瑰香為3∶1，葡萄正常發(fā)酵，留糖53 g/L，用氣囊壓榨機壓榨，壓力為0.4個大氣壓，皮渣放置2 d后，干重為24.66%。

活性醋酸菌：濟寧玉園生物科技有限公司活性醋酸菌。本品以AS1.41、滬釀1.01為原種，混合液體培養(yǎng)，真空濃縮，吸附干燥而成。

果醋菌：煙臺帝伯仕自釀機有限公司。

主要試劑：無水碳酸鈉、F-C試劑(福林酚)、2-辛醇等分析純試劑；Biosystem花青素、多酚等試劑盒；蘆丁標準試劑。

輔料：白砂糖，市售；無菌潔凈曬干玉米芯。

1.2 儀器與設(shè)備

722S可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司；普析TU-1901雙光率紫外可見分光光度計；Y15葡萄酒快速分析儀 西班牙Biosystem公司；粉碎粒度可調(diào)的粉碎機；8 L玻璃瓶。

1.3 方法

1.3.1 葡萄皮渣酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵方法

醋酸菌、果醋菌活化方法：按重量比1∶10的比例將菌接種待醋酸發(fā)酵的酒液中,搖床培養(yǎng)30 min，轉(zhuǎn)速120 r/min,溫度在25～35 ℃。

皮渣酒精發(fā)酵：皮渣2在密封罐中存放4，6，8，10 d，加糖，使葡萄醪的比重在1050～1055，加入破碎的枸杞，進行酒精發(fā)酵，結(jié)束后的酒精度在6.5% 左右。

皮渣酒精發(fā)酵結(jié)束后，皮渣分離，酒液加入到玻璃瓶中，瓶中裝好滅菌的玉米芯，酒液高度以剛好浸沒玉米芯為宜，然后分別加入活化的果醋菌和醋酸菌進行醋酸發(fā)酵，接種量10%。循環(huán)噴淋，循環(huán)量0.5 L/min，發(fā)酵溫度為28～35 ℃，發(fā)酵3 d后，測總酸的變化情況，檢測醋酸發(fā)酵進程。當總酸不再上升或者開始下降時，發(fā)酵時間為15～20 d，加入0.4 g/L的食鹽，防止醋酸氧化，對容器進行封口處理，滿罐貯存。

1.3.2 枸杞不同粉碎粒度的影響

將枸杞利用粉碎粒度可調(diào)的粉碎機進行粉碎，分別過50，100，200目的篩網(wǎng)，篩選枸杞不同粉碎粒度對試驗難易程度的影響。

1.3.3 葡萄皮渣不同新鮮度對酒中和醋中酚類物質(zhì)含量的影響

將皮渣1放置于30 L不銹鋼罐中，封閉保存，分別取在罐中放置不同時間2，4，6，8，10 d的皮渣，酒精發(fā)酵后，檢測葡萄皮渣不同新鮮度對酒中和醋中酚類物質(zhì)含量的影響。

將皮渣2放置于30 L不銹鋼罐中封存，在6，8，10 d后啟動酒精及醋酸發(fā)酵，菌種為果醋菌，檢測葡萄皮渣不同新鮮度對醋中酚類物質(zhì)含量的影響。

1.3.4 枸杞不同添加量對醋感官質(zhì)量和多糖、黃酮含量的影響

取破碎50目的枸杞2，4，6 g/L和0，2，3，4 g/L兩組，分別加入11倍的去離子水，加入果膠酶20 mg/L，在(41±3) ℃水浴中水浴處理3 h后，加入到存放4 d的皮渣2中，在玻璃瓶中進行酒精和醋酸發(fā)酵。2，4，6 g/L處理,醋酸發(fā)酵結(jié)束7 d后進行感官分析。0，2，3，4 g/L處理，發(fā)酵結(jié)束后30 d后進行醋酸多糖和黃酮含量的檢測。

1.3.5 不同菌種對感官質(zhì)量的影響

存放8 d的皮渣2，加入50目過篩枸杞4 g/L，酒精發(fā)酵結(jié)束后，分別加入果醋菌和醋酸菌進行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束7 d進行感官質(zhì)量分析；存放30 d后，檢測總酸、L-蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸在添加不同醋酸菌的果醋中的含量。

1.3.6 檢測方法

L-總糖、總酸、酒精度、pH采用GB/T 15038-2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》進行測定。

M-蘋果酸、乳酸、檸檬酸、總糖、多酚、花色苷、單寧、花青素、總糖透光率的測定：采用分光光度法。

N-感官指標檢測：10人品鑒小組(都具有品鑒經(jīng)驗)。

2 結(jié)果分析

2.1 枸杞不同粉碎粒度對試驗難易程度的影響

枸杞含有糖和果膠，當枸杞的粉碎粒度為200目時，枸杞容易發(fā)粘，呈塊狀，難以均勻分離。枸杞粉碎到100目時，果肉粉碎了，但是枸杞籽不易粉碎；過篩時，容易將果肉和枸杞籽分離，造成浪費。粉碎成50目過篩，破碎的果肉和枸杞籽都可以通過篩孔。因此，枸杞的粉碎粒度以50目為宜。

2.2 葡萄皮渣不同新鮮度對酒中和醋中酚類物質(zhì)含量的影響

2.2.1 葡萄皮渣1不同新鮮度對葡萄酒中花色苷和單寧含量的影響

圖1 葡萄皮渣不同新鮮度對葡萄酒中花色苷和單寧含量的影響Fig.1 Effect of different degrees of freshness of grape peel residues on the content of anthocyanins and tannins in red wine

由圖1可知，皮渣壓榨后，存放2，4，6，8，10 d，皮渣酒精發(fā)酵后得到的葡萄酒中，花色苷和單寧在2 d時最高，達到572.67 mg/L和1778.57 mg/L，之后隨著貯藏天數(shù)增多，花色苷從572.67 mg/L降低到6 d的138.58 mg/L,降低了75.8%；單寧從1778.57 mg/L降低到6 d的464.29 mg/L，降低了74.9%；兩者均在6 d后速度減慢，10 d后單寧含量僅是2 d的16.5%；花色苷是10.2%。所以，當葡萄酒發(fā)酵結(jié)束、皮渣分離后，盡快進行葡萄酒醋的加工，皮渣放置的時間越長，有效成分損失的越多。

2.2.2 葡萄皮渣2不同新鮮度對醋中花青素、多酚和黃酮含量的影響

圖2 葡萄皮渣不同新鮮度對醋中花青素、多酚、黃酮含量的影響Fig.2 Effect of different degrees of freshness of of grape peel residues on the content of anthocyanins, polyphenols and flavonoids in vinegar

由圖2可知，葡萄皮渣2存放的時間越長，果醋菌釀成果醋花青素、多酚、黃酮含量逐漸降低，8 d后降低至接近最低，花青素含量由6 d的23 mg/L下降到4 mg/L，下降了82.6%，多酚含量由6 d的1320 mg/L下降到420 mg/L，下降了68.1%，黃酮含量由6 d的1.54 mg/L下降到0.33 mg/L，下降了78.6%。醋中酚類物質(zhì)含量的降低與皮渣酒中結(jié)果一致。

2.3 枸杞不同添加量對醋感官質(zhì)量和多糖、黃酮含量的影響

2.3.1 枸杞不同添加量對醋感官質(zhì)量的影響

由表1可知，隨著枸杞添加量的增加，醋的顏色變淺，有可能是枸杞中黃酮和類胡蘿卜素影響醋的顏色。加入枸杞6 g/L的醋在口感、香氣上欠佳；加入枸杞2 g/L的醋香氣好，香氣優(yōu)雅，令人愉悅，但口感不如4 g/L飽滿和協(xié)調(diào)，加入4 g/L為最適宜配方。

2.3.2 枸杞不同添加量對醋多糖和黃酮含量的影響

圖3 不同枸杞添加量對醋多糖、黃酮含量的影響Fig.3 Effect of different additive amount of wolfberry on the content of polysaccharides and flavonoids in vinegar

由圖3可知，隨著枸杞量的增加，黃酮含量和多糖含量都在遞增，由對照0.82，9.57 mg/L，遞增到4 g/L的2.02，13.08 mg/L，分別遞增了2.46倍和1.37倍。由表1可知，枸杞添加量為4 g/L時，感官分析最佳。多糖具有抗腫瘤、增強人體免疫力、降血糖、抗衰老的作用，黃酮具有降血脂、抑制血栓、降血壓、雌性激素(異黃酮)以及抗病毒、抑菌、消炎、保肝等功效，從保健作用、感官質(zhì)量方面綜合分析，4 g/L枸杞添加量是最佳選擇。

2.4 不同醋酸菌種對醋質(zhì)量的影響

2.4.1 不同醋酸菌對醋感官品質(zhì)的影響

存放8 d的皮渣2，加入50目過篩枸杞4 g/L酒精發(fā)酵結(jié)束后，酒精度為7.23%(V/V)，分別加入果醋菌和醋酸菌進行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束7 d進行感官質(zhì)量分析，品鑒結(jié)果見表2。

表2 不同菌種的醋感官分析Table 2 Sensory analysis of vinegar with different bacteria

由表2可知，不同菌種發(fā)酵醋的感官質(zhì)量不同。果醋菌有花香和水果的清香，入口有甜感，刺激性強，酸較柔，回味長，有甜感；醋酸菌具有糧食醋的香氣，香氣、口感更加濃烈和尖酸。綜合評價，果醋菌的醋適宜做醋飲，醋酸菌的醋口感更加厚實，更適宜做調(diào)味品。

2.4.2 不同醋酸菌對醋有機酸含量的影響

不同菌種發(fā)酵的果醋密封存放30 d后，檢測總酸、L-蘋果酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸在添加不同醋酸菌的果醋中的含量。測得的總酸含量不同，果醋菌總酸含量是6.15 g/dL，醋酸菌總酸含量為6.52 g/dL，有機酸含量也不同，見圖4。

圖4 不同醋酸菌種有機酸濃度的比較Fig.4 Comparison of organic acid content of different acetic acid bacteria

由圖4可知，兩種發(fā)酵醋中均以檸檬酸為主，含量相同；L-蘋果酸、酒石酸、乳酸3種有機酸的含量，醋酸菌都比果醋菌的高，在感官品鑒中，醋酸菌入口更加尖酸。

3 討論與結(jié)論

目前，食醋的生產(chǎn)工藝主要有固態(tài)、液態(tài)發(fā)酵兩大類，對于優(yōu)化固定化菌釀造食醋的工藝參數(shù)的研究不多，固定化微生物技術(shù)是通過將微生物高度密集地固定在所選載體上，菌體在短時間內(nèi)快速增殖，增加單位體積中菌體含量和菌液密度，縮短發(fā)酵周期，具有發(fā)酵效率高、穩(wěn)定性好、易于實現(xiàn)生產(chǎn)自動化、連續(xù)化、菌體可重復(fù)利用等優(yōu)點。通過前期的預(yù)備試驗，本研究直接將工業(yè)醋酸菌用酒液活化，省去菌種在培養(yǎng)基上的擴大培養(yǎng)，以玉米芯為固定化劑，采用噴淋循環(huán)通氧，該技術(shù)應(yīng)用在葡萄果醋發(fā)酵工藝研究中還未見報道。本研究用皮渣2+糖+枸杞微粉釀造的皮渣酒酒精度為7.23%，不同醋酸菌釀造的醋總酸不同，果醋菌總酸含量是6.15 g/dL，醋酸菌總酸含量為6.52 g/dL，并且有機酸含量也不同，醋酸菌的蘋果酸、酒石酸、乳酸含量要高于果醋菌。

試驗發(fā)現(xiàn)，隨著保存時間的延長，壓榨后葡萄皮渣中花色苷、單寧含量迅速降低，這與龐志申[13]的研究結(jié)果一致，38 ℃儲存10 d時，花色苷降解一半。本研究發(fā)現(xiàn)葡萄皮渣密封保存6 d的皮渣，酒中單寧和花色苷相比密封保存2 d的分別下降了74.9%和75.8%；10 d后單寧含量僅是2 d的16.5%；花色苷是10.2%。在醋中，黃酮、花青素和多酚的含量下降程度也得出同樣的結(jié)論。分析原因是葡萄皮渣在壓榨過程中，溶解大量的氧氣，謝程程[14]研究發(fā)現(xiàn)氧化劑可直接親核進攻花色苷的C位使花色苷開環(huán)生成查耳酮，查耳酮進一步降解生成各種無色的酯類物質(zhì)和香蘭素的衍生物。郭耀東[15]研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高，葡萄皮花色苷降解速度加快，在光照條件下，花色苷降解速率加快。因此，葡萄皮渣壓榨最好用具有氮氣保護的氣囊壓榨機壓榨，最好低溫、避光、密封保存，并且壓榨后的皮渣應(yīng)盡快處理，不易保存時間過長。

枸杞粉碎目數(shù)以50目最佳，枸杞的添加量不是越多越好，枸杞添加量4 g/L為宜。不同醋酸菌對醋的口感和香氣有顯著的影響，有機酸含量不同，果醋菌更利于生產(chǎn)果醋飲料，醋酸菌更適宜于生產(chǎn)調(diào)味品醋。