多西紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡及對PI3K/AKT 信號通路的影響

黎 磯，梁歡歡，鄧 敏

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一，隱匿性較強，大部分患者初期癥狀并不明顯，確診時已出現(xiàn)浸潤[1]。 手術(shù)切除是首選治療方式，可提高5 ～10年的生存期，但術(shù)后仍有轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)風(fēng)險[2]。 隨著治療技術(shù)逐漸提高，卵巢癌及前癌性病變得到了有效的控制[3]。 多西紫杉醇是第二代紫杉烷類半合成抗腫瘤藥物，通常被認定為抗肺癌藥物的一線和二線治療藥物。 其抗癌原理在于加快微管蛋白物聚集，促進微血管穩(wěn)定性和增強功能性微管束能力，對腫瘤細胞進行抑制和破壞[4]。 磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)是機體細胞中廣泛存在的信號通路，與細胞生長、增殖、分化密切相關(guān)，而PI3K 的異常活化是細胞發(fā)生癌變的主要原因之一[5]。 G 蛋白偶聯(lián)受體蛋白酪氨酸激酶受體可激活PI3K，激活產(chǎn)物影響AKT 活性使其呈現(xiàn)磷酸化，活性增強并激活下游一系列因子，影響細胞周期、凋亡，調(diào)控腫瘤血管新生[6]。 本研究探討多西紫杉醇誘導(dǎo)卵巢癌細胞凋亡及對PI3K/AKT 信號通路的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 Trizol 試劑(浙江聯(lián)碩生物科技有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(武漢賽維爾生物科技有限公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(上海撫生實業(yè)有限公司)，RT-PCR 試劑盒(上海優(yōu)予生物科技有限公司)，RPMI-1640 培養(yǎng)基(上海博升生物科技有限公司)，HO-8910 卵巢癌細胞株(上海奧陸生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組 取HO-8910 細胞進行接種培養(yǎng)，初次接種細胞呈圓形，懸浮狀態(tài)，1 d 后逐漸貼壁，2 d 后完全貼壁細胞梭形或多邊形，7 d 后細胞密度生長至80%～90%融合度，予以傳代培養(yǎng)，消化選用0.25%胰蛋白酶，利用吸管吹打，制成細胞懸液，移植新培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)收集第5 代細胞，將HO-8910 細胞稀釋至1×105/mL，于16 孔板中平鋪，待HO-8910 細胞密度生長為60%～80%時，吸出培養(yǎng)液進行后續(xù)實驗。

將濃度為10、40、80 μg/mL 的多西紫杉醇培養(yǎng)液加入鋪有HO-8910 細胞的16 孔板中進行培養(yǎng)，分為:Ho組(HO-8910 細胞＋生理鹽水)、Hd組(HO-8910 細胞＋10 μg/mL 多西紫杉醇培養(yǎng)液)、Hz組(HO-8910 細胞＋40 μg/mL 多西紫杉醇培養(yǎng)液)、Hg組(HO-8910 細胞＋80 μg/mL 多西紫杉醇培養(yǎng)液)[7]，培養(yǎng)48 h 后，棄上清液，更換培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 收集細胞。

1.2.2 RT-PCR 檢測 分別取出4組Ho-8910 細胞，用Trizol 法提取DNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，所有的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照說明書進行，將所得的cDNA 進行熒光實驗。 PCR 反應(yīng)條件:60 ℃預(yù)變性，10 min；95 ℃延伸，72 ℃退火，各30 s；95 ℃延伸，共循環(huán)40 次，實驗次數(shù)不少3 次。 PI3K 正向引物5′-CATCACTT CCTCCTGCTCTAT-3′，反向5′-CAGTT2GTTGGCAAT CTTCTTC-3′；AKT 正向引物5′-GGACAACCGCCAT CCAGACT-3′，反向5′-GCCAGGGACACCTCCATCTC-3′；β-action 正向引物5′-GAGAGGGAAATCGTGCGT GAC-3′，反向5′-GACGTAGCACAGCTTCTCCTTAATG-3′；用相對定量2-ΔΔCt計算PI3K、AKT 水平。

1.2.3 Westernblot 法 在6 孔板中加入100 μg 的胰蛋白酶提取液，再注入2 mL 的培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染后的細胞放入EP 管中，并與胰蛋白酶提取液按照1 ∶100進行混合，冷凍10 min，使細胞完全裂變，成為E 溶液；在EP 管中按照1:100 比例加入胰蛋白酶提取液2 mL，使細胞完全裂變成為F 溶液，把E和F 溶液以80:1 的體積進行搖勻，配制成工作液，放入37.5 ℃的保溫箱中20 min，冷卻后計算PI3K、AKT 蛋白濃度。

1.2.4 流式細胞儀檢測 將處理后的細胞放置于磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)中，予以洗滌，離心5 min，100 μL 的1×結(jié)合緩沖液，對細胞進行重懸，用5 μL 標(biāo)記FITC 的AnnexinⅤ與5 μL PI 染色混勻，無光條件下，孵育15 min 后注入400 μL 1×結(jié)合緩沖液混勻，予以洗滌，次數(shù)3 次，記錄細胞凋亡情況。

1.2.5 Transwell 檢測 將4組細胞進行饑餓處理，12 h 后加入DMSO，24 h 后離心重懸細胞5×105/mL，準(zhǔn)備Transwell 小室注入200 mL 細胞懸液，置入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，離心經(jīng)處理后的HO-8910 細胞3 ～5 min，將細胞接種在96 孔板上予以培養(yǎng)，每孔200 μL，室溫37 ℃、5% CO2，培養(yǎng)時長不少于24 h，不大于72 h，加入MTT 培養(yǎng)不小于3 h，不大于4 h，與150 μL DMSO 溶液混勻，用酶標(biāo)儀來檢測490 nm 處光密度值(OD 值)，分析細胞活力變化情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4 組間PI3K、AKT 水平情況 RT-PCR 檢測顯示:Ho組PI3K、AKT 水平高于其他3組，其余3組依次是Hd組、Hz組、Hg組，4組間PI3K、AKT 水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，圖1。

圖1 4組間PI3K、AKT 水平差異比較情況

2.2 4 組間PI3K、AKT 蛋白表達水平情況 Western Blot 檢測顯示:Ho組PI3K、AKT 蛋白表達水平最高，其余3組PI3K、AKT 蛋白表達水平從低至高依次為Hg組、Hz組、Hd組，4組間PI3K、AKT 蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，圖2。

圖2 4組間PI3K、AKT 蛋白表達水平差異

2.3 4 組HO-8910 細胞凋亡率情況 流式細胞儀檢測顯示:Hg組HO-8910 細胞凋亡率最高，其次為Hd組、Hz組，Ho組HO-8910 細胞凋亡率最低，4組HO-8910 細胞調(diào)亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，圖3。

2.4 4 組HO-8910 細胞遷移能力情況 Transwell

檢測顯示:Ho組HO-8910 細胞遷移能力最高，其余3組中HO-8910 細胞遷移能力Hg組遷移能力最低，Hz組遷移能力低于Hd組(P＜0.05)，Hg組較Hz組低(P＜0.05)，4組細胞遷移能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，圖4。

2.5 4 組HO-8910 細胞增殖能力比較 MTT 檢測顯示:Hg組HO-8910 細胞增殖能力最低，Ho組細胞增殖能力最高，Hz組低于Hd組，4組細胞增殖能力差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，圖5。

圖3 4組HO-8910 細胞凋亡率比較

圖4 4組HO-8910 細胞遷移能力情況

圖5 4組HO-8910 細胞增殖能力

3 討論

近年來，年輕女性卵巢癌發(fā)病率越來越高，且發(fā)病階段有一定潛伏期，半數(shù)以上的患者未見明顯臨床癥狀，多在日常的婦科檢查中發(fā)現(xiàn)或確認，因此，確診時已處于進展階段[8]。 多西他賽是一種半合成紫杉醇抗癌藥物，滲漏效果良好，可透過癌細胞進入細胞和內(nèi)部，通過調(diào)控微管蛋白聚集來控制病情[9]，而PI3K/AKT 信號對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有重要作用，有研究者深入證實PI3K/AKT 信號可促進淋巴血管形成，癌細胞增殖，使病情向不可控方向發(fā)展[10]。

近些年，PI3K/AKT 信號通路一直是眾多學(xué)者研究的重點，它可以干預(yù)作用于多種細胞內(nèi)表達，參與細胞的增殖和分化，并與眾多疾病都存在不可分割的關(guān)系。 Yin 等[11]已證實Netrin-1 通過PI3K/AKT信號通路經(jīng)受體neogenin 促進胃癌細胞增殖和侵襲，PI3K、AKT 參與細胞的增殖、侵襲和遷移。 有文獻報道，PI3K 是AKT 的一個上游分子，通過PI3K發(fā)生磷酸化反應(yīng)，磷酸化會促進腫瘤的生長和遷移[12]。 PI3K/AKT 作為機體內(nèi)重要信號通路，PI3K活性增強，調(diào)控下游抗氧化蛋白，導(dǎo)致機體受活性氧的侵害，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)[13]。 有研究證實，PI3K/AKT 信號在卵巢癌中有重要的作用，卵巢癌細胞中PI3K/AKT 信號相關(guān)蛋白表達受到抑制后，癌細胞的氧化和抗氧化就會失衡，卵巢癌細胞凋亡就會增多[14]。 PI3K/AKT 信號通路在眾多腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，如在胃癌和子宮內(nèi)膜癌中的異常變化具有重要參考價值。 PI3K/AKT 信號被激活時，靶器官的分化受到限制，干細胞特異性被保留，會加快肺癌細胞的分化，導(dǎo)致腫瘤形成[15]。 本研究發(fā)現(xiàn)，Ho組PI3K、AKT 水平高于其他3組，其余3組Hd組PI3K、AKT最高，Hz組其次、Hg組最低。。

本研究發(fā)現(xiàn)，Hg組HO-8910 細胞凋亡率最高，其次為Hd組、Hz組。 Ho組HO-8910 細胞遷移能力最高，Hz組遷移能力低于Hd組，Hg組較Hz組低。 Hg組HO-8910 細胞增殖能力最低，Ho組細胞增殖能力最高，Hz組低于Hd組，Hg組增殖能力最弱。 江楠等[16]研究發(fā)現(xiàn)多西紫杉醇可使卵巢癌停留在G2/M 期，G2/M 期阻滯會促進RNA 的損傷修復(fù)，細胞內(nèi)畸形染色體減少，抑制卵巢癌細胞增殖。陳涵等[17]研究表明多西紫杉醇對癌細胞的作用時間長，抗腫瘤活性能力較紫杉醇高，殺死組織內(nèi)的癌細胞，加快藥物吸收，在腫瘤細胞浸入其他器官之前將之殺死，從根本上減少了癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的可能性，且在鉑類耐藥的卵巢癌中有明顯的作用。 也有研究發(fā)現(xiàn)多西紫杉醇還能與肝癌患者體內(nèi)微管蛋白結(jié)合，對癌細胞的擴散進行有效抑制，對腫瘤的治療有較高的臨床應(yīng)用價值[18]。

綜上所述，多西紫杉醇可造成HO-8910 細胞大量凋亡，可能通過抑制PI3K/AKT 信號通路活性來實現(xiàn)的。 但本研究存在一定的不足，僅對HO-8910卵巢癌細胞株進行實驗，未對細胞的遷移、凋亡進行多時間點的研究，今后應(yīng)加入多種卵巢癌細胞系進行比較研究，以提高結(jié)論的準(zhǔn)確性。