一測多評法同時(shí)測定清熱疏肝口服液中8種活性成分

劉艷芬，馬 云

0 引言

清熱疏肝口服液由茵陳、白芍、柴胡、板藍(lán)根和桃仁配伍而成，主要用于急性黃疸型肝炎、慢性肝炎屬肝膽濕熱證等病癥的治療[1]。中藥及其制劑所含有效成分復(fù)雜，其臨床療效為多個(gè)成分共同作用的結(jié)果，清熱疏肝口服液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對該制劑所含單一成分進(jìn)行定量控制，也未檢索到對該制劑多成分質(zhì)量控制的文獻(xiàn)報(bào)道，單一成分難以全面評價(jià)清熱疏肝口服液的產(chǎn)品質(zhì)量，本文參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確定原則，選取君藥茵陳所含活性成分濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸，臣藥柴胡所含特征性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d，佐藥白芍所含主要活性成分氧化芍藥苷和芍藥苷為檢測目標(biāo)成分，以異槲皮苷為內(nèi)參物，首次采用一測多評法[2]，實(shí)現(xiàn)對清熱疏肝口服液中8種活性成分含量的同時(shí)測定，建立了清熱疏肝口服液多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式，為全面評價(jià)清熱疏肝口服液的產(chǎn)品質(zhì)量、完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)，Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；BS224S型電子天平(德國Sartorius公司)；Waters Symmetry C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sapphire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。

濱蒿內(nèi)酯對照品(批號：111511-201704，CAS號：120-08-1，含量以99.9%計(jì))、芍藥苷對照品(批號：110736-201943，CAS號：23180-57-6，含量以95.1%計(jì))、金絲桃苷對照品(批號：111521-201809，CAS號：482-36-0，含量以94.9%計(jì))、異槲皮苷對照品(批號：111809-201804，CAS號：482-35-9，含量以97.2%計(jì))、柴胡皂苷a對照品(批號：110777-201912，CAS號：20736-09-8，含量以94.8%計(jì))和柴胡皂苷d對照品(批號：110778-201912，CAS號：20874-52-6，含量以96.3%計(jì))均來源于中國食品藥品檢定研究院；氧化芍藥苷對照品(批號：18031641，CAS號：39011-91-1，含量以98.8%計(jì))和4,5-O-二咖啡?？鼘幩釋φ掌?批號：18010521，CAS號：57378-72-0，含量以99.7%計(jì))均來源于上海同田生物技術(shù)股份有限公司；清熱疏肝口服液(規(guī)格：每支裝10 ml，批號：181011、190218、190517)來源于清華德人西安幸福制藥有限公司；乙腈為色譜純，水為純凈水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱取氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品各適量，用甲醇制成各目標(biāo)成分質(zhì)量濃度分別為0.258、1.392、1.156、0.494、0.176、1.742、0.418、0.352 mg/ml的8個(gè)對照品儲備液；精密吸取8個(gè)對照品儲備液各2.5 ml，置50 ml量瓶中用甲醇制成混合對照品溶液(氧化芍藥苷12.9 μg/ml、芍藥苷69.6 μg/ml、濱蒿內(nèi)酯57.8 μg/ml、金絲桃苷24.7 μg/ml、異槲皮苷8.8 μg/ml、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?7.1 μg/ml、柴胡皂苷a 20.9 μg/ml和柴胡皂苷d 17.6 μg/ml)。

2.1.2 清熱疏肝口服液供試品溶液 精密量取清熱疏肝口服液1.0 ml，置25 ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得清熱疏肝口服液供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液 按清熱疏肝口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)下工藝處方分別制備缺茵陳、缺柴胡、缺白芍的3種陰性樣品，再按“2.1.2”項(xiàng)下方法分別制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以Waters Symmetry C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，柱溫為30 ℃；以乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫(0～12.0 min，15.0%A；12.0～22.0 min，15.0%A→21.0%A；22.0～49.0 min，21.0%A→35.0%A；49.0～64.0 min，35.0%A→42.0%A；64.0～70.0 min，42.0%A→15.0%A)，體積流量1.0 ml/min；檢測波長分別為230 nm[3-6](0～22.0 min檢測氧化芍藥苷和芍藥苷)、345 nm[3,7-8](22.0～49.0 min檢測濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷和4,5-O-二咖啡酰奎寧酸)和210 nm[3,9](49.0～70.0 min檢測柴胡皂苷a和柴胡皂苷d)；進(jìn)樣量10 μl。在上述色譜條件下，取“2.1.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液以及“2.1.2～2.1.3”項(xiàng)下各溶液依法進(jìn)樣檢測，記錄所檢測色譜圖。結(jié)果目標(biāo)成分氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色譜峰均能達(dá)到有效分離，分離度均>1.5，理論塔板數(shù)按待測目標(biāo)成分峰計(jì)均不低于4 500。所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，各陰性樣品色譜圖中在與樣品中氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d保留時(shí)間相對應(yīng)位置上未見色譜峰，表明陰性樣品對清熱疏肝口服液中8種成分的定量測定無干擾，HPLC色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下的8個(gè)對照品儲備液各2.0 ml，置同一20 ml量瓶中，用甲醇制成線性關(guān)系混合對照品溶液1，精密吸取混標(biāo)溶液1各適量，依次用甲醇稀釋2、5、10、15、20倍，制成線性關(guān)系混合對照品溶液2～6，取上述6種混合對照品溶液依法進(jìn)樣檢測，記錄氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色譜峰的峰面積，以質(zhì)量濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，見表1。

表1 8個(gè)成分線性關(guān)系和范圍

2.4 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察

2.4.1 精密度考察 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色譜峰峰面積，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為1.11%、0.67%、0.71%、0.96%、1.25%、0.53%、1.02%和0.89%。

2.4.2 重復(fù)性考察 取同一批次的清熱疏肝口服液樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，依法進(jìn)樣檢測，記錄氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色譜峰峰面積，計(jì)算各待測目標(biāo)成分的含量，結(jié)果所測各成分含量的RSD分別為1.83%、1.02%、1.15%、1.44%、0.75%、0.91%、1.38%和1.50%。

2.4.3 穩(wěn)定性考察 臨用新配1份清熱疏肝口服液供試品溶液，于制備后0、4、8、12、18、24 h依法進(jìn)樣檢測，記錄氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d色譜峰峰面積，結(jié)果各待測成分峰面積的RSD分別為1.07%、0.62%、0.68%、0.94%、1.21%、0.56%、0.99%和0.87%，表明清熱疏肝口服液供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已知含量的清熱疏肝口服液樣品0.5 ml，共9份，置25 ml量瓶中，按照中國藥典2015年版四部要求，分別精密加入根據(jù)已知各待測成分含量另行配制的混合對照品溶液(氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d質(zhì)量濃度分別為0.142、0.894、0.658、0.266、0.098、1.072、0.234、0.188 mg/ml)0.5 ml 3份、1.0 ml 3份、1.5 ml 3份，使待測目標(biāo)成分對照品加入量約為樣品含量的50%、100%和150%，再按“2.3”項(xiàng)下方法制備加樣樣品溶液。依法進(jìn)樣檢測，結(jié)果所測成分氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩帷⒉窈碥誥和柴胡皂苷d的平均加樣回收率及相應(yīng)的RSD分別為98.27%(1.50%)、99.00%(0.53%)、99.82%(0.81%)、97.93%(1.44%)、97.68%(1.16%)、100.04%(0.64%)、98.90%(0.97%)、96.86%(1.09%)。

2.6 相對校正因子的測定 本研究以異槲皮苷為內(nèi)參物，分別計(jì)算其與氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的相對校正因子。取線性關(guān)系考察項(xiàng)下6種混合對照品溶液依法進(jìn)樣測定，記錄氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面積，按公式fi/s=fi/s=(Wi×As)/(Ws×Ai)(式中W代表質(zhì)量濃度，A代表峰面積，i代表內(nèi)參物，s代表其他待測組分)分別計(jì)算氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的相對校正因子，結(jié)果見表2。

2.7 相對校正因子耐用性考察

2.7.1 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響 本研究考察了Waters 2695型、Agilent 1100型2種型號高效液相色譜儀和Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sapphire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 3種型號色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3。

2.7.2 不同柱溫對相對校正因子的影響 本研究考察了不同柱溫(28 ℃、29 ℃、30 ℃、31 ℃、32 ℃)對相對校正因子的影響，結(jié)果見表4。

2.7.3 待測組分色譜峰的定位 本研究以內(nèi)參物異槲皮苷色譜峰為基準(zhǔn)峰，分別考察Waters 2695型、Agilent 1100型2種型號高效液相色譜儀和Waters Symmetry C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Sapphire C18(250 mm×4.6 mm，5 μm) 3種型號色譜柱條件下，采用相對保留時(shí)間值法對色譜峰進(jìn)行定位考察，結(jié)果見表5。

表2 以異槲皮苷為內(nèi)參物的7種成分的相對校正因子

表3 不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響

表4 不同柱溫對相對校正因子的影響

表5 不同儀器、不同色譜柱待測成分色譜峰的相對保留值

2.8 一測多評法(QAMS)與外標(biāo)法(ESM)結(jié)果比較 取3個(gè)批次的清熱疏肝口服液樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法每個(gè)批次平行制備3份清熱疏肝口服液樣品溶液，依法進(jìn)樣檢測，記錄各成分色譜峰的峰面積，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表6。

表6 各成分含量測定結(jié)果(mg/ml)

3 討論

3.1 待測目標(biāo)成分的確定 清熱疏肝口服液由茵陳、白芍、柴胡、板藍(lán)根和桃仁5味藥材加工而成，方中茵陳清利濕熱、利膽退黃，為君藥；柴胡、板藍(lán)根疏肝解郁、散熱升陽、清熱涼血，合為臣藥；白芍養(yǎng)血柔肝、平抑肝陽，為佐藥；桃仁活血祛瘀、潤腸通便，為使藥。諸藥共奏，以達(dá)清熱利濕、疏肝解郁、和血通絡(luò)的功效。茵陳為菊科植物濱蒿或茵陳蒿的干燥地上部分，主要含有黃酮類、香豆素類、有機(jī)酸類等多種化學(xué)成分，其中濱蒿內(nèi)酯、東莨菪內(nèi)酯、秦皮乙素等為其香豆素類代表性成分，具有抗炎、抗肝損傷作用，金絲桃苷、異槲皮苷和4,5-O-二咖啡?？鼘幩岬葹槠潼S酮類主要成分，對四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有保護(hù)作用；柴胡為傘形科植物柴胡或狹葉柴胡的干燥根，主要含有皂苷類、揮發(fā)油類、黃酮類、多糖類等成分，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷d等皂苷類為其主要活性成分，具有解熱、抗炎、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)等藥理作用；白芍為毛茛科植物芍藥的干燥根，芍藥苷、氧化芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、苯甲酰芍藥苷等單萜類成分為其主要活性成分，具有抗炎、止痛、保肝和抑制自身免疫等多種藥理作用。本文選取清熱疏肝口服液方中君藥茵陳所含濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?，臣藥柴胡所含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d，佐藥白芍所含氧化芍藥苷、芍藥苷為定量測定目標(biāo)成分，為全面評價(jià)清熱疏肝口服液產(chǎn)品質(zhì)量提供依據(jù)。

3.2 供試品溶液制備方法的確定 供試品溶液的制備方法直接影響所建立方法的可行性和檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)依次對不同提取溶劑(甲醇[3,6,9-10]、50%甲醇、乙醇、50%乙醇[3-5,7])、提取方式(超聲提取法[5-6,9-10]和加熱回流提取法[3-4,7-8])和提取時(shí)間(15 min、30 min、60 min)進(jìn)行了對比考察，以清熱疏肝口服液中待測目標(biāo)成分氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩?、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的綜合提取率為考察指標(biāo)，同時(shí)結(jié)合加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果，最終確定采用甲醇超聲提取30 min作為清熱疏肝口服液供試品溶液的制備方法。

3.3 色譜條件流動(dòng)相的選擇 色譜條件中流動(dòng)相直接決定了待測目標(biāo)成分的分離效果，本實(shí)驗(yàn)首先對比考察了乙腈-水[3,9-10]、甲醇-水[8]2個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，以待測目標(biāo)成分氧化芍藥苷、芍藥苷、濱蒿內(nèi)酯、金絲桃苷、異槲皮苷、4,5-O-二咖啡酰奎寧酸、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的分離效果、峰形以及色譜峰基線的平穩(wěn)情況為綜合考察指標(biāo)，結(jié)果以乙腈-水為流動(dòng)相時(shí)效果較佳，但待測目標(biāo)成分氧化芍藥苷、4,5-O-二咖啡?？鼘幩岱蛛x效果欠佳，金絲桃苷色譜峰存在拖尾現(xiàn)象；在此基礎(chǔ)上，對流動(dòng)相中水相(0.1%甲酸水溶液、0.1%磷酸水溶液[3-4,7-8,11]、0.1%冰醋酸水溶液[5])進(jìn)行了對比考察，最終確定采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，按正文中的流動(dòng)相比例梯度洗脫對清熱疏肝口服液中8種活性成分進(jìn)行同時(shí)檢測，在此條件下所記錄色譜圖基線平穩(wěn)，待測目標(biāo)成分均能達(dá)到有效分離，色譜峰峰形良好。

本文首次采用一測多評法，實(shí)現(xiàn)了對清熱疏肝口服液中8種活性成分的同時(shí)測定，建立了清熱疏肝口服液多指標(biāo)成分控制方法，所建立的方法操作便捷、結(jié)果準(zhǔn)確，節(jié)約了檢驗(yàn)成本，為全面評價(jià)清熱疏肝口服液的產(chǎn)品質(zhì)量，確保清熱疏肝口服液產(chǎn)品質(zhì)量的均一性和臨床治療效果的一致性提供了參考依據(jù)。