土槿乙酸誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞HO-8910自噬及其機(jī)制

王佳賀,王 楠,苑莉莉

0 引言

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，對(duì)女性的生命健康構(gòu)成了嚴(yán)重的危害[1-3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，許多中藥的有效成分通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬[4-7]。因此，探討中藥有效成分誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬的分子機(jī)制對(duì)于卵巢癌的治療具有重要的臨床意義。土槿乙酸 (Pseudolaric acid-B，PAB)是由松科植物金錢松的根皮(土槿皮，又稱土荊皮)及近根皮提取的二萜類化合物。PAB通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞黏附和遷移、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡以及抑制腫瘤血管生成等發(fā)揮抗腫瘤作用[8-9]。但關(guān)于土槿乙酸能否誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞自噬及相關(guān)機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

因此，本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)觀察土槿乙酸是否能夠誘導(dǎo)卵巢癌HO-8910細(xì)胞自噬和PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白的變化，以及自噬特異性抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)及自噬激動(dòng)劑雷帕霉素(RAPA)是否能夠影響土槿乙酸所致的卵巢癌HO-8910細(xì)胞自噬蛋白的表達(dá)，初步探討土槿乙酸誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞自噬及其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，3-MA 和RAPA為Sigma 公司產(chǎn)品，自噬相關(guān)抗體LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、β-actin及其他試劑均購(gòu)于武漢博士德生物工程公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)Backman公司；HO-8910 細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將HO-8910 細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)箱中孵育(37 ℃，5%CO2)，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)到90%時(shí)，應(yīng)用0.25%胰酶進(jìn)行消化，再用0.02%EDTA處理細(xì)胞，以備進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞處理 將細(xì)胞置于培養(yǎng)皿中，當(dāng)貼壁細(xì)胞增長(zhǎng)到70%～90%時(shí)，移除培養(yǎng)液，應(yīng)用PBS清洗2次，將不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)加入HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)0、6、12、24 h。

1.4 臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HO-8910細(xì)胞(2×105/孔)接種于6孔板上，加入不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)0、6、12、24 h。貼壁細(xì)胞經(jīng)胰酶處理后制成細(xì)胞懸液，然后加入0.4%臺(tái)盼藍(lán)溶液以9∶1混合均勻，3 min內(nèi)在電子顯微鏡下計(jì)數(shù)活細(xì)胞和死細(xì)胞。

1.5 Western blot檢測(cè)HO-8910細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)蛋白、PI3K/Akt通路相關(guān)蛋白及3-MA和RAPA作用后細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)的變化 不同濃度土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)處理HO-8910細(xì)胞0、6、12、24 h后分別檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR等蛋白的表達(dá)。將HO-8910細(xì)胞分為空白對(duì)照組、土槿乙酸組(4 μmol/L)、土槿乙酸(4 μmol/L)聯(lián)合3-MA(10 mmol/L)組、土槿乙酸(4 μmol/L)聯(lián)合RAPA(10 μmol/L)組，分別培養(yǎng)24 h后檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1。常規(guī)收集各組細(xì)胞，洗滌、離心后加入細(xì)胞裂解液RIPA 和PMSF，提取細(xì)胞總蛋白。BCA 法檢測(cè)蛋白濃度，逐步進(jìn)行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、洗膜、封閉，按操作說(shuō)明加入一抗，4 ℃搖床過(guò)夜;洗膜3次;加入二抗溶液，室溫?fù)u床2 h；TBST室溫洗膜3次。ECL成像系統(tǒng)發(fā)光顯影。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。多組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 土槿乙酸抑制人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的活性 應(yīng)用臺(tái)盼藍(lán)染色法測(cè)定土槿乙酸對(duì)人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的活性影響。用不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 μmol/L)作用HO-8910細(xì)胞株，作用時(shí)間為0、6、12、24 h。結(jié)果顯示，在作用時(shí)間相同時(shí)，隨著藥物濃度的增加，HO-8910細(xì)胞的活力下降；相同的藥物濃度下，隨藥物作用時(shí)間的延長(zhǎng)，HO-8910細(xì)胞的活力亦隨之下降，且作用24 h后HO-8910細(xì)胞的活力下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。以上結(jié)果提示,土槿乙酸抑制人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的活性作用有時(shí)間依賴性及濃度依賴性。

2.2 土槿乙酸促進(jìn)人卵巢癌細(xì)胞株HO-8910的自噬 應(yīng)用Western blot方法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1等的表達(dá)情況。用不同濃度的土槿乙酸分別處理HO-8910細(xì)胞不同時(shí)間后，用Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和Beclin-1。結(jié)果顯示，隨著土槿乙酸藥物濃度的增加或時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞中LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)水平逐漸增強(qiáng)，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例也逐漸增加，Beclin-1蛋白的表達(dá)逐漸升高(圖1)；應(yīng)用自噬特異性抑制劑3-MA后，自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)減低，應(yīng)用自噬激動(dòng)劑RAPA后，LC3Ⅱ、Beclin-1等蛋白表達(dá)增加(圖2)。p-Akt、p-mTOR的表達(dá)隨時(shí)間的延長(zhǎng)及濃度的增加均逐漸降低(圖3)。

圖1 用不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 mol/L)作用HO-8910細(xì)胞24 h后Western blot法檢測(cè)LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)

圖2 Western blot法檢測(cè)不同組HO-8910細(xì)胞培養(yǎng)24 h后LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的表達(dá)。

圖3 用不同濃度的土槿乙酸(0、2、4、8 mol/L)作用HO-8910細(xì)胞24 h后Western blot法檢測(cè)Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR的表達(dá)

3 討論

卵巢癌為女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅女性的健康。由于卵巢癌患者在早期往往沒(méi)有明顯的臨床癥狀，又缺乏有效的篩查手段，就診時(shí)多數(shù)已處于進(jìn)展期或已有轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。臨床上常常采用手術(shù)、放療、化療、靶向治療等多種干預(yù)手段，但一部分患者因化療藥物耐藥而導(dǎo)致治療效果不佳，影響預(yù)后[10-12]。因此，尋找調(diào)節(jié)和對(duì)抗耐藥的方法，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，是目前卵巢癌治療研究的熱點(diǎn)。

自噬是溶酶體中細(xì)胞器和未折疊蛋白分解代謝的生物學(xué)過(guò)程[13]。在細(xì)胞增殖中，自噬是一把雙刃劍，它不僅可以通過(guò)為細(xì)胞提供能量和營(yíng)養(yǎng)，如細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)或組織的降解來(lái)促進(jìn)細(xì)胞增殖，也可誘導(dǎo)自噬細(xì)胞死亡或與細(xì)胞增殖抑制程序交聯(lián)[14-15]。自噬是細(xì)胞死亡的重要機(jī)制,許多抗腫瘤藥物均通過(guò)提高自噬活性甚至誘導(dǎo)自噬來(lái)發(fā)揮抗腫瘤作用[16]。細(xì)胞自噬可通過(guò)多種途徑被激活，其調(diào)控點(diǎn)包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、低氧誘導(dǎo)因子、PI3K、P53、caspase家族、Bcl-2家族等。細(xì)胞自噬亦參與腫瘤對(duì)化療藥物的反應(yīng)[17-18]。LC3 是自噬重要的標(biāo)志物之一。LC3包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ 2種存在形式。LC3-Ⅱ通常存在于自噬體的外膜中。聯(lián)合應(yīng)用自噬抑制劑3-MA和PAB后，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)降低，而自噬的激動(dòng)劑RAPA與PAB聯(lián)用后，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin-1蛋白表達(dá)增加。

PI3K/Akt信號(hào)通路是一種重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期中均起著關(guān)鍵的調(diào)控作用[19]。PI3K/Akt通路也是自噬調(diào)節(jié)經(jīng)典途徑，抑制該通路可起到活化自噬的作用。激活的PI3K啟動(dòng)下游激酶Akt的激活[20]。此外，磷酸化Akt還能促進(jìn)細(xì)胞的存活和增殖，調(diào)節(jié)各種信號(hào)傳導(dǎo)。研究表明，在胃癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌等各種惡性腫瘤中，Akt的表達(dá)和激活過(guò)多。Yuan等[21]證實(shí)，Akt激酶的過(guò)度表達(dá)和激活與卵巢癌的惡性生物學(xué)行為有密切關(guān)系。本研究中，應(yīng)用不同濃度的土槿乙酸處理HO-8910細(xì)胞后，p-Akt、p-mTOR的表達(dá)均有所下降，且存在濃度依賴性。這表明土槿乙酸可能通過(guò)抑制PI3K/Akt通路來(lái)促進(jìn)HO-8910細(xì)胞的自噬。

總之，土槿乙酸可降低HO-8910細(xì)胞的存活率，誘導(dǎo)HO-8910細(xì)胞自噬，使自噬增加的程度存在藥物濃度及作用時(shí)間的依賴性。土槿乙酸可抑制PI3K/Akt通路，其抑制作用亦存在藥物濃度依賴性。因此，土槿乙酸可通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/Akt通路促進(jìn)HO-8910細(xì)胞的自噬，土槿乙酸有望成為卵巢癌治療的新型藥物，也為中藥單體抗腫瘤的研究提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。