片仔癀對(duì)LncRNA-ANRIL 介導(dǎo)大腸癌淋巴管新生的影響

逯 遙 ，張 敏 ，劉 潔 ，毛倩倩 ，曹治云 ，林久茂 *

1 福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州350122；

2 福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350122；

3 中西醫(yī)結(jié)合基礎(chǔ)福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（福建中醫(yī)藥大學(xué)），福建 福州 350122

大腸癌（colorectal cancer，CRC）包括結(jié)、直腸癌，是最常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一。 據(jù)美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)的最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，全球每年新增大腸癌發(fā)病例數(shù)接近109.6 萬(wàn)，且造成超過(guò)50%（＞50 萬(wàn)）患者的死亡［1］，造成大腸癌高死亡率的原因是大多數(shù)患者在診斷時(shí)已是晚期且伴有轉(zhuǎn)移不適合手術(shù)。 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大腸癌最常見(jiàn)和最早出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移方式，大腸癌淋巴管新生是其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其復(fù)發(fā)的主要因素和機(jī)制［2］，其發(fā)生機(jī)制涉及多個(gè)癌基因和抑癌基因的表達(dá)及長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，LncRNA）表觀遺傳學(xué)調(diào)控等，是一個(gè)多基因、多途徑、多步驟的協(xié)同積累過(guò)程［3］。 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-C（VEGF-C）是目前公認(rèn)最主要的促淋巴血管生成因子，而抑制大腸癌細(xì)胞VEGF-C 的表達(dá)，可抑制其淋巴管新生，進(jìn)而防止大腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［4-5］。 長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ANRIL（LncRNA-ANRIL）是長(zhǎng)度為3.8 kb 的一種LncRNA，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［6］。最新研究表明，在結(jié)直腸癌患者中LncRNA-ANRIL 顯著過(guò)表達(dá)，且ANRIL 高表達(dá)患者的5 年生存率明顯低于ANRIL 低表達(dá)患者，有趣的是還發(fā)現(xiàn)ANRIL 高表達(dá)的患者也有較高的VEGF-C 表達(dá)， 因此推測(cè)LncRNA-ANRIL 可通過(guò)調(diào)控促淋巴管新生關(guān)鍵因子VEGF-C 的表達(dá)促進(jìn)大腸癌淋巴管新生，從而導(dǎo)致大腸癌淋巴管轉(zhuǎn)移［3］。

片仔癀（Pien Tze Huang，PZH）對(duì)多種惡性腫瘤的臨床療效顯著，且無(wú)明顯毒副作用［7］。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PZH 可通過(guò)抑制VEGF-C 信號(hào)通路抑制大腸癌淋巴管新生，同時(shí)通過(guò)調(diào)控多條信號(hào)通路，誘導(dǎo)大腸癌細(xì)胞凋亡，抑制大腸癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和血管新生等［4，8-10］，但其作用機(jī)制仍未闡明，以及未見(jiàn)從LncRNA-ANRIL 方面探討PZH 抑制腫瘤淋巴管新生的報(bào)道。 因此，本文在此基礎(chǔ)上研究PZH 抑制LncRNA-ANRIL 介導(dǎo)大腸癌淋巴管新生的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥物和細(xì)胞株

PZH 由漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供（批號(hào)：1808087）；人大腸癌 HCT-116 細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞（HLEC），購(gòu)自廣州吉尼歐生物科技有限公司，細(xì)胞均保存于福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心液氮中。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

RPMI1640 培養(yǎng)基（批號(hào)：C11875500BT）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：10099141）、0.25% EDTA-胰酶（批號(hào)：25200072），購(gòu)自美國(guó) Life 公司；青-鏈霉素混合液（雙抗，批號(hào)：sv30010）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)：SH30256.01B），購(gòu)自美國(guó) Hyclone 公司；ECM 培養(yǎng)基（批號(hào)：28475）、P／S 溶液（批號(hào)：27670）、ECGS（批號(hào)：27888）、FBS（批號(hào)：27849），購(gòu)自 Scien Cell生物技術(shù)公司；CCK-8（批號(hào)：k1018-1），購(gòu)自美國(guó)APExBIO 公司；結(jié)晶紫粉末（批號(hào)：C8470），購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Transwell 小室（批號(hào)：3422），購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；管腔形成試劑盒（批號(hào)：ECM625），購(gòu)自德國(guó) Merck Millipore 公司；聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：23227）、SYBRTMSelect Master Mix 試劑（批號(hào)：4472908）、Lipofectamine RNAiMAX 轉(zhuǎn)染試劑（批號(hào)：13778-030），購(gòu)自美國(guó) Thermo 公司；Super ECL Star（超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒）（批號(hào)：S-6009），購(gòu)自中國(guó)宇恒生物公司；細(xì)胞裂解液（Pierce RIPA Buffer，批號(hào)：AR0102-100），購(gòu)自中國(guó)博士德生物工程有限公司；磷酸酶抑制劑（PhosStop，批號(hào)：4906837001 ） 、 蛋 白 酶 抑 制 劑 （Cocktail， 批 號(hào)4693124001），購(gòu)自瑞士Roche 公司；苯甲基磺酰氟（PMSF，批號(hào)：ST506），購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；SDS-PAGE 配膠試劑盒（批號(hào)：CW0022M），購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；β-actin（批號(hào)：60008-1-Ig）、GAPDH 抗體（批號(hào)：60004-1-lg）、VEGF-C 抗體（批號(hào)：22601-1-AP）、二抗（鼠抗）（批號(hào)：SA00001-1）和二抗（兔抗）（批號(hào)：SA00001-2），均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，批號(hào)：RR047A），購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；Si-NC 和Si-ANRIL 的序列，購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司。

1.3 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱（美國(guó) Thermo 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備公司）；倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica儀器有限公司）；Countes?全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Life 公司）；連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀（奧地利TECAN公司）；電泳儀、電泳槽、小型轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad 公司）；7500 Fast 熒光定量PCR儀（美國(guó) ABI 公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥物及試劑的配制

PZH 在研缽中研成細(xì)粉末后，用PBS 配制成25 mg／mL 溶液，超聲溶解 30 min，用 0.45 μL 孔徑的濾膜過(guò)濾，經(jīng)高壓滅菌后于-20 ℃貯存?zhèn)溆谩?RPMI 1640 完全培養(yǎng)基含10% FBS 和1%雙抗，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?ECM 完全培養(yǎng)基含5%FBS 和1%P／S溶液、1%ECGS，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116 細(xì)胞用RPMI1640 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞單層貼壁生長(zhǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化，后加入2 mL 的完全培養(yǎng)基終止消化后，1 000 r／min 離心 3 min，棄上清收集沉淀細(xì)胞，用完全培養(yǎng)基重懸制成新細(xì)胞懸液后傳代。HLEC 于ECM 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，按1.0×105個(gè) ／mL 接種到 6 孔板中（2 mL／孔），此時(shí)培養(yǎng) 基為轉(zhuǎn)染后收集的腫瘤培養(yǎng)上清（tumor culture su-pernatants，TSNs）， 分為 Si-NC 組、Si-ANRIL 組、Si-NC+PZH（0.25 mg／L）組，每組 3 個(gè)重復(fù)。

2.3 細(xì)胞活力檢測(cè)

HCT-116 細(xì)胞按 1.5×105個(gè) ／mL 接種于 96 孔板中（100 μL／孔），當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到 50%～60%時(shí)，吸走孔中原培養(yǎng)基，每孔加入100 μL 含有不同濃度 PZH（終濃度分別為 0、0.25、0.50、0.75 mg／mL）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入 100 μL 濃度為 0.5 mg／mL MTT 溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸棄 MTT 溶液，每孔加入 100 μL DMSO 后，置于酶標(biāo)儀（波長(zhǎng)570 nm）測(cè)光密度（A）值。 HCT-116 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA 36 h 后，棄掉培養(yǎng)基，按照說(shuō)明書將CCK-8 溶液加入到每孔中，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，在 450 nm 波長(zhǎng)下測(cè) A 值。 HLEC 按1.0×105個(gè) ／mL接種于 96 孔板中（100 μL／孔），在TSNs 中培養(yǎng) 24 h后，CCK-8 檢測(cè)細(xì)胞活力，操作步驟同上，每個(gè)濃度做6 個(gè)復(fù)孔。

細(xì)胞活力（%）＝實(shí)驗(yàn)組 A 值／對(duì)照組A 值×100%

2.4 RT-qPCR 檢測(cè) LncRNA-ANRIL 的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HCT-116 細(xì)胞按1.0×105個(gè)／mL接種于 6 孔板中（2 mL／孔），待細(xì)胞匯合度達(dá)到50%～60%時(shí)，將細(xì)胞分成對(duì)照組和PZH 組，PZH 組每孔加入不同濃度 PZH（0.25、0.50、0.75 mg／mL）溶液后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加RNAiso Plus 1 mL提取RNA，每組做3 個(gè)復(fù)孔。 NanoDrop1000 核酸檢測(cè)儀對(duì)RNA 的濃度進(jìn)行測(cè)定，應(yīng)用PrimeScriptTMmiRNA RT-qPCR kit 進(jìn)行 Poly（A）加尾反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。 RT-qPCR 反應(yīng)體系 10 μL，即 cDNA 溶液2 μL，SYBRTMSelect Master Mix 5 μL，PCR Forward Primer （10 μmol／L） 0.8 μL，DEPC 2.2 μL，于 7500 Fast PCR 儀進(jìn)行RNA 表達(dá)分析。 通過(guò)閾值分析比較，采用循環(huán)數(shù)（Ct）法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。定量采用 2-ΔΔCt法，GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算 LncRNA-ANRIL 的相對(duì)表達(dá)量。HCT-116 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA 后檢測(cè)LncRNA-ANRIL 表達(dá)操作步驟同上。 LncRNAANRIL 正向引物：5’-CCGCTCCCCTATTCCCCTTA-3’，反向引物：5’-CCTGATTGGCGGATAGAGCA-3’；GAPDH 正 向 引 物 ：5’-GGAGCGAGATCCCTCCAA AAT-3’，反向引物：5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCA TGG-3’。

2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-116 細(xì)胞按1.5×105個(gè)／mL接種于 6 孔板中（2 mL／ 孔），培養(yǎng) 24 h 后，用Lipofectamine RNAi MAX 轉(zhuǎn)染試劑沉默LncRNAANRIL 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染體系如下：6 孔板終體積為1 mL，Si-NC 和 Si-ANRIL 的濃度為 50 nmol／L，2.5 μL／孔，加于 6 孔板，Lipofectamine RNAi MAX 3 μL／孔。于轉(zhuǎn)染后6 h 換成RPMI1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染36 h后做后續(xù)檢測(cè)：① 倒置顯微鏡對(duì)細(xì)胞的形態(tài)變化進(jìn)行觀察并拍照；② RT-qPCR 檢測(cè)LncRNA-ANRIL 表達(dá)；③CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力；④Western blot 檢測(cè)細(xì)胞促淋巴管新生因子VEGFC 蛋白表達(dá)。 Si-NC 序列：正向 5’-UUCUCCGAAC GUGUCACGUTT-3’，反向 5’-ACGUGACACGUUCG GAGAATT-3’；Si-ANRIL 序列：正向 5’-GCAUAUG UCUUUCUGGUAUTT-3’，反向 5’-AUACCAGAAA GACAUAUGCTT -3’。細(xì)胞活力檢測(cè)做6 個(gè)重復(fù)，其余做3 個(gè)重復(fù)。

2.6 Western blot 實(shí)驗(yàn)

采用 Western blot 法，將不同濃度 PZH 干預(yù)HCT-116 細(xì)胞24 h 后和HCT-116 細(xì)胞敲減LncRNA-ANRIL 后的細(xì)胞裂解、變性，上樣量為每孔50 μg蛋白，電泳條件：10 min 30 V、30 min 80 V、60 min 120 V，轉(zhuǎn)膜條件：40 min 100 V。 5%的脫脂奶粉封閉 1 h 后，加入 VEGF-C 抗體、GAPDH 抗體或 βactin 抗體，于4 ℃搖床孵育過(guò)夜，然后加入第二抗體室溫孵育1 h 后，TBST 漂洗3 次，用超敏化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑，在Bio-Rad 化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行成像。

2.7 腫瘤培養(yǎng)上清的制備

HCT-116 細(xì)胞分為 Si-NC、Si-ANRIL、Si-NC+PZH 3 組，細(xì)胞轉(zhuǎn)染同前所述，分別于轉(zhuǎn)染后6 h 換成RPMI1640 完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，于6 h 后再次換液，其中Si-NC+PZH 組更換為含PZH 0.25 mg／mL的培養(yǎng)基，再繼續(xù)孵育24 h 后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即腫瘤培養(yǎng)上清，以3 000 r／min 離心15 min，去除細(xì)胞碎片及雜質(zhì)后用于培養(yǎng)HLEC。

2.8 Transwell 小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲能力

① 遷移實(shí)驗(yàn)：HLEC 用TSNs 干預(yù)培養(yǎng)24 h 后，吸棄各孔溶液，分別進(jìn)行消化，用不含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按每孔0.2 mL 含5×104個(gè)細(xì)胞種于Transwell 上室，下室加入 0.7 mL 完全 ECM 培養(yǎng)基后，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中；9 h 后上室和下室分別用0.2 mL 和0.7 mL 4%多聚甲醛固定15 min，吸棄4%多聚甲醛后，用結(jié)晶紫染色液染色20 min，吸棄結(jié)晶紫，用棉簽小心擦去Transwell 上室的細(xì)胞，最后在倒置顯微鏡拍照。 ② 侵襲實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種至有Matrigel 基質(zhì)膠的Transwell 上室，其余操作步驟同遷移實(shí)驗(yàn)操作步驟。 每組均做3 個(gè)重復(fù)遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。

2.9 管腔形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞管腔形成能力

預(yù)先鋪好基質(zhì)膠于48 孔板中，基質(zhì)膠用稀釋液按照 1∶9 稀釋，100 μL／孔鋪膠，放于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱凝 1～2 h。HLEC 用 TSNs 干預(yù)培養(yǎng) 24 h 后，重新消化、離心、重懸、計(jì)數(shù)以 5×105／mL 接種于預(yù)鋪好的培養(yǎng)板中，3～5 h 拍照，隨機(jī)選取3 個(gè)視野，采集圖像。 每組做3 個(gè)重復(fù)。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度PZH 抑制大腸癌細(xì)胞HCT-116 的活力、LncRNA-ANRIL 及 VEGF-C 的表達(dá)

MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，PZH（0.25、0.50、0.75 mg／mL）組的細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）。 PZH 組抑制率分別為（18.46±3.84）%、（36.43±3.49）%、（54.09±2.03）%，見(jiàn)圖 1A。 RT-qPCR 結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，PZH 可降低HCT-116 中 LncRNA-ANRIL 的表達(dá)（P＜0.01），見(jiàn)圖1B，以上結(jié)果均呈濃度依賴性。Western blot 結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，PZH（0.25、0.50、0.75 mg／mL）組可下調(diào)HCT-116 細(xì)胞中VEGF-C 的蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖1C。

3.2 LncRNA-ANRIL 沉默對(duì)大腸癌細(xì)胞活力和VEGF-C 蛋白表達(dá)的影響

HCT-116 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 SiRNA 后，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：Si-ANRIL 組 LncRNA-ANRIL 表達(dá)［（0.50±0.18）%］顯著低于 Si-NC 組［（1.07±0.34）%］（P＜0.05），見(jiàn)圖 2A。 倒置顯微鏡觀察結(jié)果顯示：Si-ANRIL 組細(xì)胞密度明顯較Si-NC 組少，見(jiàn)圖 2B。 CCK-8 檢測(cè)結(jié)果顯示：Si-ANRIL 組的細(xì)胞活力顯著低于 Si-NC 組（P＜0.01），見(jiàn)圖 2C。Western blot 分析結(jié)果顯示，沉默LncRNA-ANRIL后可明顯下調(diào)促淋巴管新生因子VEGF-C 的蛋白表達(dá)，見(jiàn)圖2D。

圖 1 PZH 抑制 HCT-116 細(xì)胞活力、LncRNA-ANRIL 和VEGF-C 蛋白的表達(dá)Figure 1 PZH inhibited proliferation of HCT-116 cells，and expression of LncRNA-ANRIL and VEGF-C

3.3 PZH 對(duì) LncRNA-ANRIL 介 導(dǎo) 的 HLEC 活力的影響

HLEC 培養(yǎng)于 TSNs 中，CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與 Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組的細(xì)胞活力顯著降低（P＜0.01），2 組抑制率分別為（8.07±1.89）%和（10.87±4.10）%，見(jiàn)圖 3。

3.4 PZH 對(duì) LncRNA-ANRIL 介 導(dǎo) HLEC 遷 移能力的影響

HLEC 培養(yǎng)于TSNs 中，遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組 和 Si-NC+PZH 組的遷移數(shù)量顯著減少，2 組的遷移率分別為（83.06±3.70）%、（71.77±8.50）%，見(jiàn)圖 4。

圖2 LncRNA-ANRIL 沉默抑制HCT-116 細(xì)胞活力及VEGF-C 蛋白表達(dá)（×200）Figure 2 Silencing LncRNA-ANRIL inhibits cell viability and protein expression of VEGF-C in HCT-116 cells （×200）

圖3 PZH 對(duì)LncRNA-ANRIL 介導(dǎo)的HLEC 活力的影響Figure 3 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated HLEC viability

3.5 PZH 對(duì) LncRNA-ANRIL 介導(dǎo) HLEC 侵襲能力的影響

HLEC 培養(yǎng)于TSNs 中，侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組的侵襲數(shù)量顯著減少（P＜0.01），分別為（67.39±5.75）%和（57.25±1.26）%，見(jiàn)圖 5。

3.6 PZH 對(duì) LncRNA-ANRIL 介導(dǎo) HLEC 管腔形成能力的影響

HLEC 培養(yǎng)于TSNs 中，管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與 Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組的管腔形成數(shù)量顯著減少（P＜0.01），見(jiàn)圖6。

4 討 論

大腸癌作為我國(guó)發(fā)病率第4 位、死亡率第5 位的惡性腫瘤，每年發(fā)病例數(shù)約28.2 萬(wàn)，每年死亡病例約 13.61 萬(wàn)，嚴(yán)重危害國(guó)人生命健康［11］。以手術(shù)為主的綜合治療是目前大腸癌治療的主要手段，但仍有50%的患者在根治術(shù)5 年內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［12］，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大腸癌最常見(jiàn)和最早出現(xiàn)的轉(zhuǎn)移方式，而淋巴管新生是其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及其復(fù)發(fā)的主要因素和機(jī)制［2］。 淋巴管新生主要指在某些病理狀態(tài)時(shí)，淋巴內(nèi)皮細(xì)胞受趨化因子作用而遷移至局部組織，然后在內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作用下增殖形成新的淋巴管，包括淋巴內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和管腔形成等過(guò)程［4，13］。

LncRNA-ANRIL 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤增殖、侵襲和遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其可通過(guò)上調(diào)VEGF-C 的表達(dá)促進(jìn)大腸癌淋巴管新生，從而導(dǎo)致大腸癌淋巴管轉(zhuǎn)移［14-15］。如SUN等［3］研究發(fā)現(xiàn)LncRNA-ANRIL 在大腸癌中高表達(dá)，且其增高與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)；通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)LoVo 和HCT116 中ANRIL 的高表達(dá)，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞遷移和侵襲活性明顯降低，同時(shí)也可以抑制人淋巴內(nèi)皮細(xì)胞的管腔形成能力和侵襲能力；此外，在小鼠模型中，ANRIL 下調(diào)后，腫瘤生長(zhǎng)率和腫瘤大小降低，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率降低，LMVD 和VEGF-C、VEGFR-3 和 LYVE-1 的表達(dá)。 結(jié)果表明下調(diào)LncRNA-ANRIL 可抑制大腸癌淋巴管生成和轉(zhuǎn)移。

圖4 PZH 對(duì)LncRNA-ANRIL 介導(dǎo)HLEC 遷移能力的影響（×200）Figure 4 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated migration in HLEC （×200）

圖5 PZH 對(duì)LncRNA-ANRIL 介導(dǎo)HLEC 侵襲能力的影響（×200）Figure 5 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated invasion in HLEC （×200）

圖6 PZH 對(duì)LncRNA-ANRIL 介導(dǎo)HLEC 管腔形成能力的影響（×200）Figure 6 Effect of PZH on LncRNA-ANRIL mediated tube formation in HLEC （×200）

隨著我國(guó)現(xiàn)代化診療技術(shù)的飛速發(fā)展，針對(duì)惡性腫瘤的放化療和分子靶向藥物已廣泛應(yīng)用于臨床，但是近年來(lái)其耐藥和毒副作用也日益顯現(xiàn)，因此臨床療效確切、毒副作用小的中藥復(fù)方逐漸受到國(guó)內(nèi)外研究者的重視［16］。 PZH 是由三七、牛黃、蛇膽、麝香等多種名貴中藥材精制而成的復(fù)方制劑，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、活血化瘀、扶正祛邪的功效；在治療大腸癌等惡性腫瘤方面有明確的療效，且無(wú)明顯的毒副作用［4，9-10］。本課題組前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)PZH 可通過(guò)抑制VEGF-C信號(hào)通路抑制大腸癌淋巴管新生，然而PZH 在抑制大腸癌淋巴管新生方面的具體作用機(jī)制尚未明確。

本研究中我們用不同濃度的PZH 干預(yù)大腸癌細(xì)胞 HCT-116，MTT 實(shí)驗(yàn)表明 PZH 可抑制 HCT-116 細(xì)胞的活力，RT-qPCR 顯示 PZH 可顯著下調(diào)LncRNA-ANRIL 的表達(dá)，Western blot 檢測(cè)結(jié)果表明PZH 可抑制HCT-116 細(xì)胞中促淋巴管新生關(guān)鍵因子VEGF-C 蛋白的表達(dá)，以上結(jié)果提示PZH 抗腫瘤淋巴管新生可能與調(diào)控LncRNA-ANRIL 和VEGF-C的表達(dá)相關(guān)。 進(jìn)一步通過(guò)觀察HCT-116 細(xì)胞LncRNA-ANRIL 沉默后對(duì)其細(xì)胞活力、形態(tài)及對(duì)促淋巴管新生關(guān)鍵因子VEGF-C 蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示LncRNA-ANRIL 沉默后可顯著降低HCT-116 細(xì)胞密度、活力及VEGF-C 蛋白表達(dá)，證實(shí)了LncRNA-ANRIL 對(duì)VEGF-C 表達(dá)的調(diào)控作用。在此基礎(chǔ)上我們又收集了HCT116 細(xì)胞LncRNA-ANRIL 沉默和加入PZH 后的TSNs 對(duì)HLEC進(jìn)行干預(yù)培養(yǎng)，并觀察其對(duì)HLEC 活力、遷移能力、侵襲能力和管腔形成能力的影響。 研究結(jié)果顯示：與Si-NC 組比較，Si-ANRIL 組和 Si-NC+PZH 組顯著抑制了HLEC 的活力、遷移和侵襲、管腔形成能力，表明PZH 具有抑制LncRNA-ANRIL 介導(dǎo)大腸癌淋巴管新生的作用。 綜上所述，PZH 抑制大腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的機(jī)制，與其抑制LncRNA-ANRIL 表達(dá)進(jìn)而降低VEGF-C 表達(dá)，從而抑制大腸癌淋巴管新生有關(guān)。