電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練調(diào)控PI3K／Akt 信號(hào)通路介導(dǎo)腦缺血后血管新生相關(guān)因子的表達(dá)

姚文超 ，李夢(mèng)醒 ，劉 箐 ，童明月 ，何 鵬 ，唐 巍 *

1 安徽中醫(yī)藥大學(xué)體育部，安徽 合肥 230012；

2 安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院（康復(fù)醫(yī)學(xué)院），安徽 合肥 230012；

3 安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽 合肥230012

缺血性腦卒中是影響全球健康的主要公共衛(wèi)生問題，我國40～74 歲居民首次腦卒中標(biāo)化發(fā)病率平均每年增長(zhǎng)8.3%［1］。 腦缺血后神經(jīng)功能的恢復(fù)一直是學(xué)科領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。 研究發(fā)現(xiàn)，有效時(shí)間內(nèi)恢復(fù)缺血半暗帶區(qū)血供，重建神經(jīng)血管單元可為腦卒中恢復(fù)提供新的機(jī)會(huì)［2］。 本項(xiàng)目組致力于綜合康復(fù)手段對(duì)腦缺血大鼠神經(jīng)功能改善的研究，觀察到以針刺聯(lián)合豐富康復(fù)訓(xùn)練效果更優(yōu)［3-4］，且在改善神經(jīng)功能方面涉及血管新生相關(guān)因子的表達(dá)［5-6］，但這些因子如何影響到血管新生的具體環(huán)節(jié)尚未深入研究。 故本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上，建立右側(cè)大腦中動(dòng)脈缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠模型，擬通過觀察電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練（針康療法）在促進(jìn)腦功能恢復(fù)中對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、腦源性神經(jīng)營(yíng) 養(yǎng) 因 子 （brain-derived neurotrophic factor，BDNF）及下游轉(zhuǎn)導(dǎo)通路磷脂酰肌醇-3 激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）／蛋白激酶 B（protein kinase B，Akt）的影響，深入闡釋針康療法促進(jìn)腦缺血后血管新生的機(jī)制，以期為針康療法應(yīng)用于治療腦缺血損傷提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性 SD 大鼠 81 只，購于安徽省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［許可證號(hào) SCXK（皖）2019_002］，體質(zhì)量（300±20）g。 實(shí)驗(yàn)大鼠術(shù)前 1 周常規(guī)喂養(yǎng)，術(shù)前 12 h禁食不禁水。 實(shí)驗(yàn)遵守科技部制定的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》和安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物使用和管理委員會(huì)有關(guān)章程。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Anti-VEGF、Anti-BDNF（英國 Abcam 公司）；山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG FITC 二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；小鼠抗大鼠IgG、CD34-PE（ICO115-PE）（Santa Cruz，美國）；Anti-FLK-1、PI3K、phospho-Akt（Ser473）（美國 CST 公司）；總 RNA 提取試劑（trizol TaKaRa 公司）；RT-PCR 技術(shù)盒（TaKaRa公司）；PCR Mix（重慶升博生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器

雙極電凝器（北京貝林電子有限公司）；H-800透射電鏡、Leica RM2135 切片機(jī)、TK-218I 恒溫?cái)偲酒瑱C(jī)、包埋機(jī)（德國 Leica）；顯微鏡（日本Nikon）；DP-801 形態(tài)學(xué)顯微圖像分析系統(tǒng)（江蘇捷達(dá)科技發(fā)展有限公司）；PowerPac 1000 電泳系統(tǒng)、凝膠成像儀（美國Bio-Rad 公司）；華佗牌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）；華佗牌SDZ-V 多功能電針治療儀（江蘇省蘇州華佗醫(yī)療器械有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 模型制備及分組

將81 只實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練組（針康聯(lián)合組），每組 27 只。 參照 Zea Longa 等［7］線栓法建立 MCAO模型。 大鼠經(jīng)異氟烷（誘導(dǎo)濃度4%，維持濃度2%）吸入麻醉后，大鼠頸部正中稍靠右處做一縱行切口，逐層分離皮下組織，暴露頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈，尼龍線從頸外動(dòng)脈與頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處起始插入，稍遇阻力即停止，打結(jié)、固定。 假手術(shù)組僅作頸動(dòng)脈分離，不插線。

術(shù)后待大鼠清醒后，采用改良mNSS18 分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［8］評(píng)估神經(jīng)功能缺損程度，選取評(píng)分為2～18 分的大鼠入模型組和針康聯(lián)合組。

2.2 干預(yù)方法

選取百會(huì)、風(fēng)府、心俞（左側(cè)）和內(nèi)關(guān)（左側(cè)）4 個(gè)穴位（定位參考《大鼠穴位圖譜的研制》［9］）。 待術(shù)后4 h 即予電針治療，皮筋固定大鼠于鼠板，0.30 mm×25 mm 毫針針刺，接電針治療儀。 百會(huì)、風(fēng)府為1 組，心俞、內(nèi)關(guān)為1 組，近心端腧穴接正極，遠(yuǎn)心端腧穴接負(fù)極。 電針參數(shù)：疏密波，頻率4～20 Hz，輸出電壓 2 V，輸出電流 0.5 mA，1 次／d，時(shí)間 20 min，連續(xù)治療14 d。 造模前，將針康聯(lián)合組大鼠置于跑臺(tái)進(jìn)行適應(yīng)性跑步3 d，速度分別設(shè)置12 m／min，時(shí)間30 min／d。 術(shù)后當(dāng)日，針康聯(lián)合組給予 5 m／min、30 min／d 跑臺(tái)訓(xùn)練，術(shù)后 1～3 d 跑臺(tái)速度為 8 m／min，3 d 后調(diào)整至 12 m／min。

假手術(shù)組和模型組均同等條件抓取、固定，不給予任何治療。

2.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

2.3.1 透射電鏡觀察缺血區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu) 干預(yù)結(jié)束后取大鼠，異氟烷吸入麻醉后，斷頭取腦，冰上分離缺血側(cè)海馬組織，預(yù)冷的生理鹽水充分漂洗，取出吸干后迅速置入避光戊二醛溶液中。 雙蒸水洗2 次，逐級(jí)丙酮脫水，浸透、包埋、修塊，超薄切片機(jī)切取厚度60 nm，枸櫞酸鉛、醋酸鈾雙重染色，H-800 透射電鏡觀察神經(jīng)元結(jié)構(gòu)并攝片。

2.3.2 免疫組化法和Weidner 法觀察微血管密度（microvessel density，MVD） 同上述麻醉步驟后，0.9%氯化鈉溶液快速灌沖心臟，斷頭、取腦，4%多聚甲醛溶液保存腦組織。 48 h 后取出，行脫水、石蠟包埋、切片（厚約 4 μm）、攤片、烤片等常規(guī)步驟，添加 CD34 一抗、二抗，孵育、顯色、封片。 高倍鏡（×400 倍）觀察，以棕黃色顆粒沉積物為CD34 陽性表達(dá)。 鏡下隨機(jī)取5 個(gè)視野中CD34 陽性細(xì)胞的平均值表示微血管密度。

2.3.3 Western blot 法檢測(cè) VEGF、BDNF、PI3K、Akt的相對(duì)表達(dá)量 同上述麻醉步驟后，斷頭、冰浴下取腦缺血半暗帶組織，加入RIPA 細(xì)胞裂解液，研磨后冰上靜置，4 ℃、12 000 r／min 離心 15 min 后提取組織總蛋白質(zhì)，－80 ℃冰箱保存。 按BCA 蛋白定量試劑盒說明，測(cè)定蛋白濃度。以1∶4 比例將5×SDSPAGE 凝膠加入蛋白樣品中，沸水加熱至蛋白充分變性。 SDS-PAGE 電泳分離目的蛋白（120 V，1 h），轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，將膜轉(zhuǎn)移至含有檢測(cè)蛋白一抗的封閉液中，4 ℃孵育過夜。 TBST 液洗膜后按一抗標(biāo)簽加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育2 h，洗膜。 采用ECL 進(jìn)行顯色，壓片曝光、定影，最終進(jìn)行條帶分析。 運(yùn)用Image J 軟件分析目標(biāo)條帶灰度值，以各目的條帶蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin 表達(dá)量比值作為其相對(duì)表達(dá)量。

2.3.4 RT-PCR 法檢測(cè) VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA的相對(duì)表達(dá)水平 取部分上述-80 ℃保存的腦缺血半暗帶組織，采用Trizol 法提取總RNA 后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將反轉(zhuǎn)錄出的cDNA 保存于-80 ℃冰箱備用。熒光定量 PCR 測(cè)定 VEGF、BDNF、PI3K 及 Akt mRNA的相對(duì)表達(dá)量。 反應(yīng)步驟為：95 ℃預(yù)變性 1 min，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火 10 s，共循環(huán) 40 次。 β-actin為內(nèi)參基因，按照2-△△Ct法處理、分析數(shù)據(jù)，計(jì)算各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。 計(jì)量資料用（）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)，組內(nèi)前后比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，采用重復(fù)測(cè)量方差分析檢驗(yàn)各指標(biāo)隨時(shí)間的變化情況。 P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 3 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)比較

假手術(shù)組神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器、自噬泡、溶酶體排列清晰，細(xì)胞核飽滿、染色質(zhì)均勻，核膜完整、內(nèi)外結(jié)構(gòu)清晰。 模型組神經(jīng)元形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞空泡樣變，核糖體、自噬泡減少，線粒體腫脹、空泡，細(xì)胞核固縮、核膜皺縮間隙增寬，染色質(zhì)高度聚集，細(xì)胞邊界不清。 針康聯(lián)合組各時(shí)間點(diǎn)（3、7、14 d）神經(jīng)元胞膜趨向完整，線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、自噬泡分布均勻，仍可見部分萎縮的細(xì)胞器，但結(jié)構(gòu)及空泡樣變較模型組有較大改善。 見圖1。

3.2 3 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)MVD 計(jì)數(shù)比較

以棕黃色CD34 陽性細(xì)胞為新生血管標(biāo)記物。腦缺血區(qū)域MVD 計(jì)數(shù)在不同分組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FIntergroup＝141.762，P＜0.001），不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FTime＝81.920，P＜0.001），兩者具有明顯交互作用（FInteraction＝44.960，P＜0.001）。

控制時(shí)間因素，進(jìn)行組間比較，結(jié)果顯示，針康聯(lián)合組在 3、7、14 d 時(shí)，均高于其他 2 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），說明缺血、缺氧環(huán)境啟動(dòng)內(nèi)源性機(jī)制，誘導(dǎo)缺血半暗區(qū)微血管新生，但鑒于其自身修復(fù)能力有限，介入電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練可增加新生微血管密度計(jì)數(shù)，促進(jìn)血管再生。 控制分組因素，進(jìn)行組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，結(jié)果顯示，假手術(shù)組和模型組各時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），針康聯(lián)合組3 d 與7、14 d 比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。假手術(shù)組和模型組改變趨勢(shì)為先上升后下降，針康聯(lián)合組為持續(xù)上升趨勢(shì)，據(jù)此推斷，無外界干預(yù)刺激的情況下，新生微血管增長(zhǎng)速度比較緩慢，康復(fù)手段的早期介入，可持續(xù)、有效促進(jìn)缺血損傷后血管新生。 同時(shí)，有效時(shí)間內(nèi)治療效果與療程呈正相關(guān)性，提示適當(dāng)延長(zhǎng)療程利于腦缺血后的康復(fù)。 見圖 2、表 1。

3.3 3 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū) VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白表達(dá)比較

大鼠缺血區(qū)腦組織 VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白重復(fù)測(cè)量的方差分析，各變量在不同分組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），兩者具有明顯交互作用（P＜0.001）。

控制時(shí)間因素，進(jìn)行組間比較，針康聯(lián)合組在3、7、14 d 時(shí)的蛋白表達(dá)，均高于其他 2 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示腦卒中后的缺血、缺氧微環(huán)境，可誘導(dǎo) VEGF、BDNF、PI3K、Akt 因子的表達(dá)，參與腦缺血后神經(jīng)、血管系統(tǒng)重構(gòu)，針康療法的介入使得機(jī)體自行修復(fù)效果得以增強(qiáng)。 控制分組因素，進(jìn)行組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，結(jié)果顯示，假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組7 d 時(shí)VEGF、Akt 蛋白表達(dá)增加，與 3、14 d 比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05）； 模型組 7 d 時(shí) BDNF、PI3K 蛋白表達(dá)高于3 d 時(shí)，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）； 針 康 聯(lián) 合 組 14 d 時(shí) VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白表達(dá)增加明顯，與 3、7 d 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。假手術(shù)組和模型組呈先上升后下降趨勢(shì)，針康聯(lián)合組則持續(xù)攀升，提示在14 d 的療程范圍內(nèi)，相關(guān)因子表達(dá)在針康療法作用下，隨治療時(shí)間累積。 見圖3 和表2～5。

3.4 3 組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA 表達(dá)比較

大鼠缺血區(qū)腦組織 VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA重復(fù)測(cè)量的方差分析，各變量在不同分組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），兩者具有明顯交互作用（P＜0.001）。

控制時(shí)間因素，進(jìn)行組間比較，針康聯(lián)合組在3、7、14 d 時(shí)的 mRNA 表達(dá)，均高于其他 2 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。 在控制分組因素方面，進(jìn)行組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)比較，結(jié)果顯示，假手術(shù)組3、7、14 d時(shí) VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA 表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組 VEGF mRNA 表達(dá)7 d與14 d 時(shí)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；BDNF mRNA 表達(dá) 3 d 與 7、14 d 時(shí)比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；PI3K mRNA 表達(dá) 3 d 與 7 d時(shí)比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；針康聯(lián)合組中，VEGF、BDNF mRNA 表達(dá)，7 d 與 3、14 d 時(shí)比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；PI3K mRNA表達(dá)3 d 與7 d 比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。針康聯(lián)合組 7 d 時(shí) VEGF、BDNF、PI3K、Akt mRNA表達(dá)增加明顯，與3、14 d 比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）；各變量 mRNA 表達(dá)組別×?xí)r間均有明顯交互作用（P＜0.001）。

以上結(jié)果表明，腦缺血后機(jī)體通過上調(diào)VEGF、BDNF、PI3K、Akt 因子表達(dá)，誘導(dǎo)血管新生。 模型組和針康聯(lián)合組均呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，于7 d 時(shí)表達(dá)至峰值，說明在治療7 d 時(shí)相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)入旺盛期， 提示可選擇7 d 作為療效觀察點(diǎn)， 雖然在14 d 時(shí)有所衰減，但血管新生因子的表達(dá)及作用隨療程延長(zhǎng)而持續(xù)發(fā)揮，此與MVD 計(jì)數(shù)和相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果趨同。 見表6～9。

4 討 論

缺血性腦卒中屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，基本病機(jī)為臟腑陰陽失調(diào)，氣血逆亂，上犯于腦。 腦缺血再灌注后神經(jīng)元水腫、壞死，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器結(jié)構(gòu)和功能異常，造成神經(jīng)功能障礙。 本實(shí)驗(yàn)通過透射電鏡發(fā)現(xiàn)，模型組神經(jīng)元多見空泡樣變，線粒體腫脹，細(xì)胞核固縮，提示缺血可造成神經(jīng)元結(jié)構(gòu)損傷，模型建立成功。 同時(shí)，神經(jīng)元啟動(dòng)自身修復(fù)機(jī)制，細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于改善，但仍存在一定局限性，電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練對(duì)缺血區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)改善有積極的促進(jìn)作用。

表1 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)MVD 計(jì)數(shù)比較（）Table 1 Comparison of MVD counts in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，2） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，3） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01.

7 d 7.67±0.58 19.00±1.731）27.33±2.081）2）3）141.762，0.000 81.920，0.000 44.960，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 7.33±0.58 16.00±1.001）20.00±1.731）2）14 d 7.00±1.00 17.67±2.081）29.33±1.151）2）3）

表2 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)VEGF 蛋白的表達(dá)（）Table 2 Expression of VEGF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表2 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)VEGF 蛋白的表達(dá)（）Table 2 Expression of VEGF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，2） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，3） P＜0.01；與組內(nèi) 7 d比較，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 0.313±0.109 0.625±0.0401）3）1.175±0.0181）2）3）398.772，0.000 100.462，0.000 85.121，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.290±0.023 0.454±0.0141）0.804±0.0361）2）14 d 0.262±0.035 0.471±0.0341）4）1.391±0.0501）2）3）4）

表3 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)BDNF 蛋白的表達(dá)（）Table 3 Expression of BDNF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表3 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)BDNF 蛋白的表達(dá)（）Table 3 Expression of BDNF protein in the cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，2） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05；與組內(nèi) 7 d 比較，5） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 5) P＜0.05.

7 d 0.387±0.032 0.739±0.0121）3）1.155±0.0341）2）4）903.082，0.000 53.714，0.000 41.797，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.369±0.036 0.523±0.0141）0.927±0.0411）2）14 d 0.360±0.045 0.622±0.0421）1.556±0.1011）2）3）5）

腦卒中發(fā)生后促進(jìn)血管的生成利于神經(jīng)發(fā)生和功能恢復(fù)。 目前，諸多學(xué)者對(duì)神經(jīng)血管單元相關(guān)靶點(diǎn)開展研究［10］，認(rèn)為促進(jìn)腦缺血后血管新生，盡快恢復(fù)缺血區(qū)的血液供應(yīng)， 挽救瀕臨死亡的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞，可能成為一種保護(hù)缺血腦組織、促進(jìn)功能恢復(fù)的新手段［11-12］。

針刺治療腦卒中療效肯定，多項(xiàng)研究表明電針可促進(jìn)MCAO 大鼠血管新生相關(guān)因子表達(dá)［13-14］。病變?cè)谀X，首取督脈。 張錫純?cè)凇夺t(yī)學(xué)衷中參西錄》中指出：“神明之體藏于腦，神明之用發(fā)于心”，提出心腦相通的理論，心腦共主神明，心腦疾病可通過心腦同治進(jìn)行治療［15］。 百會(huì)為手足少陽、足太陽、足厥陰與督脈之會(huì)，有補(bǔ)神益智、開竅啟閉之功；風(fēng)府為督脈、足太陽、陽維之會(huì)穴，可通督醒腦，調(diào)動(dòng)五臟六腑之精氣；心俞屬足太陽膀胱經(jīng)，為調(diào)理“心”臟要穴；內(nèi)關(guān)為八脈交會(huì)穴之一，主陰主血，可使心、脈、血及神相互聯(lián)系，具有寧心安神之效。 依據(jù)以上理論， 本研究針刺處方選用督脈經(jīng)穴百會(huì)、風(fēng)府，輔以心俞、內(nèi)關(guān)，電針治療以醒神開竅、調(diào)督通絡(luò)。 跑臺(tái)訓(xùn)練能促進(jìn)梗死灶邊緣神經(jīng)血管單元超微結(jié)構(gòu)的修復(fù)［16-17］。電針與康復(fù)訓(xùn)練的聯(lián)合應(yīng)用，是中醫(yī)康復(fù)方法與現(xiàn)代康復(fù)技術(shù)的優(yōu)化結(jié)合［18］。 故本實(shí)驗(yàn)采用電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練治療腦缺血大鼠，具備“針康同步、整體康復(fù)”的優(yōu)勢(shì)。 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，針康聯(lián)合組細(xì)胞膜逐漸趨向完整，多數(shù)細(xì)胞器分布均勻、結(jié)構(gòu)較模型組有較大改善，治療14 d 時(shí)部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)趨于完整，損傷程度較其他時(shí)間點(diǎn)有所減輕，提示針康聯(lián)合療法可改善梗死區(qū)神經(jīng)元的壞死情況，增強(qiáng)其缺血區(qū)神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)恢復(fù)，減輕缺血缺氧所致的腦組織損傷，這與劉榮等［19］的研究結(jié)果相一致。

表4 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)PI3K 蛋白表達(dá)（）Table 4 Expression of PI3K protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表4 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)PI3K 蛋白表達(dá)（）Table 4 Expression of PI3K protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，2） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05；與組內(nèi) 7 d 比較，5） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 5) P＜0.05.

7 d 0.479±0.007 0.763±0.0061）3）1.410±0.0571）2）4）2 312.264，0.000 106.552，0.000 76.208，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.445±0.011 0.563±0.0121）1.101±0.0091）2）14 d 0.456±0.024 0.620±0.0691）1.713±0.0351）2）3）5）

表5 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)Akt 蛋白表達(dá)（）Table 5 Expression of Akt protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表5 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)Akt 蛋白表達(dá)（）Table 5 Expression of Akt protein in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01，2） P＜0.05；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，3） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，4） P＜0.01，5） P＜0.05；與組內(nèi) 7 d 比較，6） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01, 2) P＜0.05; Compared with the model group at the same time point, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 4) P＜0.01, 5) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 6) P＜0.05.

7 d 0.427±0.021 0.848±0.0131）4）1.555±0.0091）3）4）1 581.880，0.000 75.381，0.000 58.594，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 0.411±0.242 0.602±0.0211）1.205±0.0321）3）14 d 0.431±0.031 0.653±0.0472）6）1.922±0.1172）3）5）6）

表6 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 6 Relative expression of VEGF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表6 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)VEGF mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 6 Relative expression of VEGF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，2） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，3） P＜0.01；與組內(nèi) 7 d比較，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 1.00±0.10 1.52±0.061）3.44±0.121）2）3）445.845，0.000 100.343，0.000 72.631，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.09 1.38±0.191）2.28±0.201）2）14 d 1.01±0.13 1.41±0.021）4）2.35±0.161）2）4）

表7 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)BDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 7 Relative expression of BDNF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表7 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)BDNF mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 7 Relative expression of BDNF mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，3） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，4） P＜0.01，5） P＜0.05；與組內(nèi) 7 d 比較，6） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.05, 2) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 4) P＜0.01, 5) P＜0.05; Compared with the time point of 7 d in group, 6) P＜0.01.

7 d 1.00±0.06 1.34±0.062）5）3.00±0.202）3）4）427.743，0.000 13.984，0.000 10.317，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.07 1.24±0.021）2.17±0.322）3）14 d 1.01±0.12 1.28±0.021）4）2.36±0.322）3）6）

表8 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)PI3K mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 8 Relative expression of PI3K mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表8 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)PI3K mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 8 Relative expression of PI3K mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，2） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，3） P＜0.01，4） P＜0.05。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01, 4) P＜0.05.

7 d 1.01±0.11 1.36±0.071）3）2.94±0.281）2）4）918.388，0.000 9.162，0.003 4.354，0.017組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.01±0.10 1.23±0.051）2.59±0.061）2）14 d 1.01±0.13 1.29±0.051）2.61±0.071）2）

表9 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)Akt mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 9 Relative expression of Akt mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

表9 3 組各時(shí)間點(diǎn)腦缺血區(qū)Akt mRNA 相對(duì)表達(dá)量（）Table 9 Relative expression of Akt mRNA in cerebral ischemic area of three groups at each time point （）

注：與假手術(shù)組同一時(shí)間點(diǎn)比較，1） P＜0.01；與模型組同一時(shí)間點(diǎn)比較，2） P＜0.01；與組內(nèi) 3 d 比較，3） P＜0.01；與組內(nèi) 7 d比較，4） P＜0.01。Note: Compared with the sham operation group at the same time point, 1) P＜0.01; Compared with the model group at the same time point, 2) P＜0.01; Compared with the time point of 3 d in group, 3) P＜0.01; Compared with the time point of 7 d in group, 4) P＜0.01.

7 d 1.01±0.15 1.47±0.191）3.32±0.281）2）3）543.814，0.000 32.931，0.000 21.426，0.000組別假手術(shù)組模 型 組針康聯(lián)合組干預(yù)措施（F 值，P 值）時(shí)間（F 值，P 值）交互作用（F 值，P 值）n 3 3 3 3 d 1.00±0.08 1.31±0.061）2.17±0.211）2）14 d 1.00±0.08 1.34±0.091）2.57±0.201）2）4）

前期研究已證實(shí)，應(yīng)用綜合康復(fù)方法治療腦缺血，可通過上調(diào)血管新生相關(guān)因子VEGF、VEGFR2、bFGF的表達(dá)，下調(diào)血管新生抑制因子ES、TSP-1 表達(dá)，促進(jìn)血管新生；但這些因子在血管新生的具體環(huán)節(jié)中是如何作用，尚未有深入研究。VEGF 聯(lián)系眾多信號(hào)通路，在血管新生過程中發(fā)揮無可替代的作用［20］。BDNF 是一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)類因子，支持多種神經(jīng)元的存活、分化及生長(zhǎng)發(fā)育，同時(shí)可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管新生及Akt 的磷酸化，由其介導(dǎo)的血管新生與PI3K／Akt信號(hào)通路關(guān)系密切。 新血管的形成可通過內(nèi)皮細(xì)胞表面特異性標(biāo)記物來識(shí)別，主要表達(dá)于新生血管內(nèi)皮中的CD34 特異性高，重復(fù)性好，用于腦缺血后血管新生的判斷更為可靠。 因此本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)CD34 陽性細(xì)胞的表達(dá)計(jì)算MVD，用于觀察MCAO大鼠缺血區(qū)血管新生情況。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：VEGF、BDNF、PI3K、Akt 蛋白及mRNA 相對(duì)表達(dá)量和MVD 計(jì)數(shù)， 在不同分組間具有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明針康聯(lián)合療法在促血管新生相關(guān)因子、CD34 表達(dá)方面有明顯優(yōu)勢(shì)，可使表達(dá)時(shí)相前移。 各組不同時(shí)間點(diǎn)的變化趨勢(shì)差異明顯，以7 d 為重要觀察點(diǎn)，針康聯(lián)合療法的介入使機(jī)體在自行修復(fù)基礎(chǔ)上，效果得以最大化，且在有效時(shí)間內(nèi)治療效果與治療時(shí)程呈正相關(guān)。 賈藍(lán)羽等［21］研究發(fā)現(xiàn)缺血7～12 d 后可觀察到毛細(xì)血管分支的內(nèi)皮細(xì)胞24 h 開始增殖并持續(xù)至少7 d 的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)趨同。 干預(yù)措施與時(shí)間均具有明顯交互作用給予啟示，臨床治療缺血性腦卒中，康復(fù)手段的介入和有效治療時(shí)間的選取，至關(guān)重要。

本實(shí)驗(yàn)表明：電針聯(lián)合康復(fù)訓(xùn)練可通過調(diào)控腦缺血后血管新生相關(guān)因子VEGF、BDNF 的表達(dá)，激活下游PI3K／Akt 信號(hào)通路，介導(dǎo)血管新生，以促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。這在一定程度上明確了PI3K／Akt 信號(hào)通路的關(guān)鍵作用，為腦內(nèi)血管新生與神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)系，豐富腦缺血功能恢復(fù)的生物學(xué)機(jī)制研究，提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 針康聯(lián)合療法促進(jìn)腦內(nèi)血管新生機(jī)制中，有無涉及MicroRNA 信號(hào)調(diào)控尚不清楚，這也是下一步需要深入研究、探討的重要內(nèi)容。