虎杖苷對非酒精性脂肪肝的影響及相關(guān)分子機制探究①

劉皎皎 戴 玲 董 璐 何瑾瑜 李瀚旻

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院，西安 710003)

非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指除酒精和其他明確因素對肝造成損傷，以肝細胞內(nèi)脂肪堆積為主的一類綜合征，包括單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化[1]。其相關(guān)發(fā)病機制尚未完全闡明。有研究報道，胰島素抵抗、氧化反應、脂質(zhì)在肝臟蓄積以及炎癥反應這幾個方面與NAFLD的發(fā)病密切相關(guān)[2,3]。目前缺乏針對NAFLD有效的治療手段，臨床上主要使用胰島素增敏劑、抗氧化劑、調(diào)脂藥以及護肝藥物治療NAFLD，但治療效果不盡人意，并且臨床及實驗發(fā)現(xiàn)部分藥物會產(chǎn)生明顯的毒副作用，對患者自身傷害較大。而中醫(yī)藥治療NAFLD具有多角度、多層次、多途徑、多靶點，且療效穩(wěn)定持久，毒副作用較小等優(yōu)勢，已成為目前研究的熱點[4]。

虎杖苷是一種多酚、非黃酮類植物抗毒素，在虎杖、葡萄和花生中的含量較高。研究報道，虎杖苷具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、誘導細胞凋亡以及抗心血管疾病等作用[5]?；⒄染哂星鍩?、破瘀及利濕等功效，自古以來常用來治療肥胖、黃疸、脅痛等疾病[6]，虎杖苷作為中藥虎杖的主要活性成分之一，在降脂、保護肝細胞等方面具有重要的效果。目前，研究表明虎杖苷能夠降低大鼠體重、血脂，且能改善肝功能異常，在治療非酒精性脂肪肝治療中顯現(xiàn)初步的療效[7，8]，而本實驗旨在進一步闡明其相關(guān)機制，為臨床使用虎杖苷治療NAFLD奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物與試劑 健康的雄性SD大鼠42只，體重180～200 g，SPF級，由陜西省中醫(yī)醫(yī)院實驗動物中心提供，動物許可證號：SCXK(陜)2013-003。虎杖苷(>98%，HPLC，購自南京廣潤生物制品有限公司，批號：GR-133-131018)；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、微量丙二醛(MDA)測定試劑盒、血糖測定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；大鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自上海江林生物科技有限公司。PPAR-α一抗(Abcam,ab8934)、LXR-α一抗(Abcam,ab176323)、SREBP-1c一抗(Abcam,ab28481)，羊抗兔二抗(cell signaling technology,#5151)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與分組 大鼠稱重后分籠喂養(yǎng)，正常喂養(yǎng)1周后隨機分為5組：正常組(A組，9只)、模型組(B組，9只)、虎杖苷劑量組1[C1組，8只，50 mg/(kg·d)]、虎杖苷劑量組2[C2組，8只，100 mg/(kg·d)]以及虎杖苷劑量組3[C3組，8只，200 mg/(kg·d)]。5組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。A組給予標準飼料，其他4組大鼠給予高脂飼料，造模期間實驗動物自由進食和飲水，動物房保持安靜，自然采光，溫度保持25℃左右。喂養(yǎng)持續(xù)8周后，從A組和B組中隨機挑選1只大鼠，取肝臟做病理切片，驗證模型組大鼠非酒精性脂肪肝的形成。依據(jù)《NASH 臨床研究網(wǎng)病理工作組指南》內(nèi)容對肝組織病理學和形態(tài)學進行評價[9]，并對NAS積分進行統(tǒng)計學分析。

1.2.2給藥 A組和B組給予生理鹽水灌胃，5 ml/次。C1、C2、C3組分別以50、100、200 mg/(kg·d)的虎杖苷混懸液灌胃，持續(xù)4周。

1.2.3檢測指標 ①造模后第12周當晚大鼠禁食不禁水，次日腹腔注射麻醉，腹動脈取血10 ml，離心分離血清，-20℃保存。迅速提取肝臟稱重，生理鹽水沖洗后在肝右葉邊緣1 cm處橫切2塊肝組織，一塊用中性福爾馬林固定，進行HE染色后觀察病理學改變，另一塊用來制備組織勻漿。②按照試劑盒說明書測定GST、SOD及MDA含量。③提取組織勻漿中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行實時定量PCR檢測炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和白細胞介素-6(IL-6)表達水平。PCR擴增引物序列為TNF-α上游引物：5′-ATGAGCACAGAAAGCATGATG-3′，下游引物：5′-TACAGGCTTGTCACTCGAATT-3′；IL-6上游引物：5′-TTGCCGAGTAGACCTCATAGTGACC-3′，下游引物：5′-CAAGAGACTTCCAGCCAGTTGC-3′。④按照試劑盒說明書，采用酶法測定血清血糖(FBG)，采用放射免疫方法測定空腹胰島素水平(FNS)。并計算胰島素抵抗指數(shù)(IRI)=FBF×FNS/22.5；胰島素敏感指數(shù)(ISI)=1/(FBG×FNS)。⑤提取肝組織蛋白，采用Western blot方法檢測PPAR-α、LXR-α、SREBP-1c蛋白的表達。

2 結(jié)果

2.1肝臟大體性狀和病理觀察 A組大鼠肝臟包膜光滑完整，表面顏色呈暗紅色，光潤，邊緣銳利，切面細顆粒感，無油膩感。B組大鼠肝臟呈棕黃色，無光澤，表面細小顆粒感，邊緣鈍。虎杖苷組大部分顏色暗紅，潤澤，切面無油膩感。C1及C2組大鼠肝臟呈淡黃色，切面油膩感。

A組肝細胞小葉結(jié)構(gòu)清晰，胞漿均質(zhì)紅染，小靜脈、膽管和匯管區(qū)小動脈結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，肝竇清晰可見，肝細胞胞漿粉染，顆粒大小均勻。模型組肝細胞腫脹，多數(shù)肝細胞內(nèi)可見大小不等的脂滴空泡，部分肝細胞呈氣球樣變，肝索排列紊亂。C3組有明顯改善，其脂肪滴與模型組相比明顯減少，如圖1。同時， 對肝組織病理學和形態(tài)學進行評價后，各組NAS 積分情況如表1所示，虎杖苷能降低NAFLD大鼠模型的NAS積分，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，表明虎杖苷對NAFLD具有一定的治療作用。

2.2虎杖苷對各組大鼠肝組織氧化應激的影響 結(jié)果如表2所示，與A組比較，B組SOD和GST含量均顯著性降低，而MDA顯著性升高。與B組比較，虎杖苷各劑量組中SOD和GST含量顯著性升高，而MDA顯著性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3虎杖苷對各組大鼠TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響 與A組比較，B組TNF-α、IL-6 mRNA表達均顯著性增加，給予虎杖苷后，大鼠肝臟中TNF-α、IL-6 mRNA表達明顯降低。與B組比較，C2及C3組TNF-α表達顯著性降低，C1、C2及C3組IL-6表達顯著性降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，如圖2。

圖1 各組大鼠肝組織HE染色(×400)Fig.1 HE staining of liver tissue of each group of rats(×400)

2.4虎杖苷對各組大鼠體內(nèi)IR的影響 如表3所示，與A組比較，B組FBG、FNS及IR顯著性升高，而ISI顯著性降低。與B組比較，C2及C3組FBG、FNS及IR顯著性降低，而ISI顯著性升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5虎杖苷對各組大鼠PPAR-α、LXR-α、SREBP-1c蛋白表達的影響 結(jié)果如圖3所示，與A組比較，B組PPAR-α蛋白表達顯著性降低，LXR-α、SREBP-1c蛋白表達顯著性增加，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與B組比較，C2和C3組LXR-α、SREBP-1c表達顯著性下調(diào)，而PPAR-α蛋白無明顯變化。

表1 NAS積分在各組間的比較情況Tab.1 Comparison of NAS scores between

Note：Compared with group A,1)P<0.05;compared with group B，2)P<0.05.

表2 虎杖苷對各組大鼠肝組織氧化應激的影響Tab.2 Effect of polydatin on oxidative stress in liver tissue of rats in each group

Note：Compared with group A,1)P<0.05;compared with group B，2)P<0.05.

圖2 虎杖苷對各組大鼠TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響Fig.2 Effect of polydatin on expression of TNF-α and IL-6 mRNA in each groupNote: Compared with group A,*.P<0.05;compared with group B，#.P<0.05.

表3 虎杖苷對各組大鼠體內(nèi)IR的影響Tab.3 Effect of polydatin on IR in rats

Note：Compared with group A,1)P<0.05;compared with group B,2)P<0.05.

圖3 虎杖苷對各組大鼠PPAP-α、LXR-α、SREBP-1c蛋白表達的影響Fig.3 Effect of polydatin on expression of PPAP-α,LXR-α and SREBP-1c in ratsNote: Compared with group A,*.P<0.05;compared with group B，#.P<0.05.

3 討論

NAFLD是一類與遺傳、環(huán)境和代謝相關(guān)的疾病，目前尚缺乏有效的治療藥物。NAFLD多系過食肥甘厚味，臨床多以肥胖、乏力，脅肋部隱痛或脹痛，口苦，舌苔黃、厚等為主要表現(xiàn)，屬中醫(yī)“肥胖”、“黃疸”、“肝脹”、“脅痛”等范疇[10]。而虎杖苷作為虎杖中重要的活性成分，藥理學研究表明其具有降血脂，保肝作用，但相關(guān)機制尚未闡明，因此，本研究旨在探究虎杖苷對NAFLD的影響的相關(guān)分子機制。

肝細胞內(nèi)含有大量的線粒體可以產(chǎn)生ATP，為肝細胞提供能量，并在此過程中產(chǎn)生大量的活性氧[11]。如果沒有相應的抗氧化機制，很容易引起肝細胞損傷[12]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠脂質(zhì)大量沉積，肝組織SOD、GST顯著性降低，MDA顯著性升高，因此，氧化應激在脂肪肝的形成和進展中可能發(fā)揮了重要的作用。而給予大鼠虎杖苷后，其SOD和GST的含量明顯升高，且MDA明顯降低，起到了明顯的抗氧化作用。同時劑量越大，效果越明顯。因此，虎杖苷可能是通過抗氧化作用，抑制脂質(zhì)過氧化，減輕肝臟沉積來治療NAFLD。

長期高脂飲食會導致肝臟產(chǎn)生炎癥因子，其中TNF-α可以誘導成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞產(chǎn)生粒細胞巨噬細胞集落刺激因子，介導炎癥反應、脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤等作用[13,14]。IL-6是多種炎性疾病重要的炎癥介質(zhì)[15，16]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，長期高脂飲食會導致炎癥基因如TNF-α、IL-6等表達明顯上調(diào)，而虎杖苷對其有顯著的抑制作用。因此，虎杖苷可以抑制機體炎癥反應，從而起到保護肝臟的作用。

胰島素抵抗是指機體組織對胰島素敏感性降低或胰島素信號傳導存在缺陷而導致機體對一定量的胰島素生物學效應低于正常水平的現(xiàn)象。早期研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)NAFLD患者存在胰島素抵抗[17-20]。本實驗結(jié)果表明，NAFLD模型大鼠血清血糖、胰島素、胰島素抵抗指數(shù)顯著性增加，胰島素敏感指數(shù)明顯降低，因此IR在NAFLD形成中起到了重要的作用。與模型組比較，虎杖苷C2、C3劑量組能顯著性降低胰島素抵抗指數(shù)，增加胰島素敏感指數(shù)，從病理上顯著性減輕肝細胞脂質(zhì)沉積，表明虎杖苷能夠減輕NAFLD大鼠胰島素抵抗，增加胰島素敏感性。

肝細胞內(nèi)有兩組脂肪調(diào)控基因，分別為脂肪合成基因和脂肪酸氧化基因。肝細胞脂質(zhì)合成基因受孤核受體SREBP-1c的調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)SREBP-1c高表達使肝細胞脂肪酸合成增加，導致脂肪酸和三酰甘油在肝細胞內(nèi)堆積從而形成脂肪肝，抑制SREBP-1c下調(diào)脂質(zhì)合成基因的表達[21]。脂肪酸氧化基因受孤核受體PPAR-α的調(diào)控，PPAP-α的活化可上調(diào)脂肪酸氧化基因的表達。SREBP-1c對代謝的調(diào)控是通過多個轉(zhuǎn)錄子間的相互作用實現(xiàn)的，如LXR-α等。LXR-α在肝臟呈高表達，研究發(fā)現(xiàn)LXR-α可被細胞內(nèi)升高的膽固醇水平活化，進而誘導一系列參與膽固醇吸收、轉(zhuǎn)運和分泌基因的表達[22]。本實驗研究結(jié)果表明，與對照組比較，模型組PPAR-α蛋白表達顯著性降低，LXR-α、SREBP-1c蛋白表達顯著性增加，因此，PPAR-α、LXR-α和SREBP-1c蛋白在NAFLD形成中發(fā)揮了重要作用。盡管虎杖苷各劑量組并不能上調(diào)PPAR-α的表達，但能下調(diào)LXR-α和SREBP-1c的表達，因此虎杖苷可能通過下調(diào)LXR-α表達，抑制其與RXR的結(jié)合，從而導致SREBP-1c基因表達下調(diào)。

綜上研究，虎杖苷可能是通過抗氧化作用、抑制脂質(zhì)過氧化，抑制機體炎癥反應，降低胰島素抵抗，下調(diào)脂質(zhì)合成因子SREBP-1c和LXR-α蛋白的表達，減少脂質(zhì)合成等關(guān)鍵途徑來治療NAFLD。