不同劑量三參飲改善干燥及NOD小鼠頜下腺PD-1及PD-L1高表達(dá)情況①

陳月月 汪 悅 錢冬晨 何 靜 郭 亮 徐媚媚 胡 偉 徐 蕾

(南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，南京 210001)

干燥綜合征是以口干、眼部干燥等為主要表現(xiàn)，伴多系統(tǒng)損害的系統(tǒng)性自身免疫性疾病[1-4]。在我國(guó)其發(fā)病率高，臨床表現(xiàn)較白種人嚴(yán)重[1，2]?，F(xiàn)有的治療方法以免疫抑制劑及生物毒性藥物為主，臨床效果有限，價(jià)格昂貴，常伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。相較于西醫(yī)，中醫(yī)治療長(zhǎng)期臨床效果穩(wěn)定、副作用少、價(jià)格經(jīng)濟(jì)。因此，干燥綜合征的中醫(yī)治療逐漸被臨床接受。文獻(xiàn)報(bào)道，pSS是在多因素的作用下引起機(jī)體 CD4+T 細(xì)胞異?；罨?，釋放多種細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)；同時(shí)，活化的CD4+輔助性 T 細(xì)胞又可促進(jìn) B 淋巴細(xì)胞分化為漿細(xì)胞，分泌大量病理性自身抗體，導(dǎo)致外分泌腺和腺外器官的損傷。研究顯示PD-1 信號(hào)的異常與類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化及系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)，已成為免疫性研究的熱點(diǎn)[4]。Kobayashi等[5]表明，PD-1/PD-L1通路功能受損可能與抑制淋巴細(xì)胞衰竭有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致pSS。pSS患者體內(nèi)存在 PD-1、PD-L1和sPD-1 的異常表達(dá)，且 PD-1 和sPD-1 與疾病活動(dòng)度及疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示PD-1和sPD-1 或許可作為pSS診斷的臨床免疫新指標(biāo)[6-8]。PD-1/PD-L1共刺激信號(hào)異?？赡軈⑴c了pSS 的免疫病理損傷進(jìn)程，其具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。國(guó)家級(jí)名中醫(yī)劉永年教授提出了流津潤(rùn)燥法治療干燥綜合征理論。該理論提出，部分患者多不欲飲或渴不多飲，或見浮腫便溏，或有脈絡(luò)瘀滯之象。該類患者體內(nèi)并不完全缺乏水液，乃是津液輸布障礙所致，證屬津液失布。南京市名中醫(yī)徐蕾教授在該理論基礎(chǔ)上開發(fā)出“三參飲”濃煎劑，臨床取得了滿意療效。該方由玄參、麥冬、沙參、女貞子、知母、桔梗、紫丹參、木賊草、生甘草等10味藥物組成。在治療上根據(jù)病理變化的先后、側(cè)重的不同而靈活施治，將流津潤(rùn)燥寓于補(bǔ)氣、溫陽、活血、解毒之中，可使氣旺津充，瘀去絡(luò)通，津液輸布暢達(dá)，燥證得解。

目前，臨床上缺乏系統(tǒng)性研究三參飲對(duì)于干燥綜合征患者療效的研究，對(duì)治療劑量尚無相應(yīng)臨床研究數(shù)據(jù)供參考。因此，本研究觀察了不同劑量三參飲治療干燥綜合征患者的療效。同時(shí)，通過監(jiān)測(cè)不同劑量三參飲治療后干燥綜合征動(dòng)物模型頜下腺中PD-1 及PD-L1表達(dá)[6，7]，進(jìn)一步探求三參飲作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 自2013年4月至2018年4月，在我院就診的原發(fā)性干燥綜合征患者共110例，年齡18～75歲，在取得患者及家屬知情同意后進(jìn)入本研究，本研究已通過我院倫理委員會(huì)審查。此后將患者，隨機(jī)分為3組，在正規(guī)西醫(yī)治療同時(shí)，輔以不同劑量的三參飲，分為高劑量組[4.20 ml/(kg·d)]、中劑量組[2.10 ml/(kg·d)]和低劑量組[1.05 ml/(kg·d)][9]。患者根據(jù)劑量每日服用1劑，分3次口服，共4周。

高劑量組、中劑量組及低劑量組患者分別為38例(男20例，女18例)、35例(男17例，女18例)、37例(男19例，女18例)；各組平均年齡分別為(40.4±6.4)歲、(42.0±5.7)歲、(41.2±6.1)歲。

1.2病例入選標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]： (1)存在1項(xiàng)或以上的如下的口腔癥狀，包括持續(xù)3個(gè)月以上每日均感到口干，腮腺反復(fù)或出現(xiàn)持續(xù)的腫大(成人后)，無法在無飲水情況下吞咽干性食物。(2)存在1項(xiàng)或以上的如下的眼部癥狀，包括持續(xù)3個(gè)月每日均感到無法忍受的眼干，眼部有磨砂感或自覺眼中反復(fù)有沙子進(jìn)入，每日均需次數(shù)在3次或以上使用人工淚液對(duì)眼部進(jìn)行濕潤(rùn)。(3)存在1項(xiàng)或以上的如下的眼部體征，包括SchirmerⅠ試驗(yàn)陽性，角膜染色陽性。(4)組織學(xué)檢查提示有1個(gè)及以上的下唇腺病理淋巴灶。(5)存在1項(xiàng)或以上的如下的頜下腺受損指標(biāo)，包括唾液流率≤1.5 ml/15 min，腮腺造影陽性，頜下腺放射性核素檢查陽性。(6)自身抗體檢測(cè)提示抗SSA或抗SSB陽性。

在排除頭、頸部、面部放療史、AIDS、淋巴瘤、HBV、結(jié)節(jié)病、GVH病、使用抗乙酰膽堿藥物情況后，并在無任何潛在疾病的情況下，在包含了(4)和/或(6)條的情況下，滿足了4點(diǎn)或以上上述診斷后可診斷干燥綜合征；此外，若滿足了(3)～(6)點(diǎn)中的任意3點(diǎn)，亦可診斷為原發(fā)性干燥綜合征。

1.2.2中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]患者需符合燥痹、氣陰兩虛證。首先，燥痹需有：(1)可有稟賦不足，陰液失充等，女性多見。(2)主癥：以少津、口干、少淚、眼干為主要癥狀。(3)次癥：伴有皮膚干燥、少汗、咽干、關(guān)節(jié)疼痛、氣短、胸悶等癥狀。(4)舌質(zhì)呈紅色或絳紅色，可有裂痕，或花剝；脈細(xì)數(shù)或弦細(xì)數(shù)，或細(xì)澀。(5)輔助檢查：提示淺表性角膜炎、角膜內(nèi)有小血管形成，可伴有云翳或者潰瘍；舌細(xì)帶唾液缺如，頜下腺在按摩后無唾液分泌，無腮腺腫大；血紅蛋白減少、白細(xì)胞減少、嗜酸性粒細(xì)胞或淋巴細(xì)胞百分比輕度增高，血沉增快；白蛋白降低、球蛋白增高；抗SSA抗體、抗SSB抗體陽性，抗核抗體陽性，類風(fēng)濕因子陽性，IgG、IgM增高；下唇小頜下腺組織活檢，提示2級(jí)以上。若具備1項(xiàng)及以上主癥，3項(xiàng)或以上次癥，綜合舌、脈情況以及相應(yīng)輔助檢查結(jié)果可確診。其次，氣陰兩虛證需有：神疲、乏力，懶言，頭暈?zāi)垦?，心悸、胸悶，氣短，面色淡白或面色萎黃，唇、甲色淡，手、足麻木等證。

1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn) 繼發(fā)性干燥綜合征；原發(fā)性干燥綜合征但已有嚴(yán)重多臟器損害者；長(zhǎng)期使用免疫抑制劑等藥物；嚴(yán)重的心、腦血管疾病、肝、腎、血液系統(tǒng)等疾病，影響患者生存情況的嚴(yán)重疾病患者；妊娠、哺乳婦女；體質(zhì)過敏、對(duì)治療藥物過敏者；長(zhǎng)期藥物、酒精濫用者，吸毒者。

1.3觀察評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.3.1臨床表現(xiàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1.1干燥綜合征包括眼部和口咽部主要癥狀評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[9]輕度(2分)患者口咽部癥狀表現(xiàn)為津少咽干較輕，少量飲水即可緩解，唇紅而干；眼干不適，灼熱而癢， 少淚，偶有瞬目，每日點(diǎn)人工淚液1～3次即可。

中度(4分)患者口咽部癥狀表現(xiàn)為津少咽干較著，需經(jīng)常飲水，吃干食覺不適， 有時(shí)口舌潰瘍，起皺皮，唇赤而干；眼部癥狀表現(xiàn)為眼干不適，灼熱而癢、澀痛或刺痛，但可忍受，少淚，頻繁瞬目， 每日點(diǎn)人工淚液4～6次。

重度(6分)患者口咽部癥狀為咽干津燥嚴(yán)重，頻繁飲水， 干食難下，而湯水沖服， 常有口舌裂潰瘍，起皺皮 如皸裂，唇暗紅干或裂；眼部則患者常感眼內(nèi)異物不適感，干澀灼熱癢痛、刺痛難忍，淚極少或無淚，頻繁瞬目，每日點(diǎn)人工淚液 6 次以上。

1.3.2干燥綜合征次要臨床表現(xiàn)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[9]輕度(1分)患者偶有輕度疲勞感，伴偶發(fā)低熱；鼻腔略有干燥；舌紅少津，或舌略有紫氣；偶有腮腺或頜下腺腫伴壓痛，2周內(nèi)可消退；皮膚輕度干燥有輕度癢感；大便干燥，排便不暢， 一般1日1次；患者關(guān)節(jié)邊緣或觸及韌帶時(shí)重壓，患者稱有壓痛，被動(dòng)活動(dòng)不受限。此外，女性患者陰道輕度干燥，但不影響性交。

中度(2分)的患者則表現(xiàn)為有疲勞感，活動(dòng)后疲勞感明顯，靜息時(shí)亦有乏力疲勞感；常有低熱，每次持續(xù)時(shí)間小于15日；鼻腔癥狀表現(xiàn)為干燥明顯，有燥熱感，偶有少量鼻血；舌紅苔少或少量剝脫，或有紫氣紫點(diǎn)；常有腮腺或頜下腺腫，伴痛、壓痛，2周以上不能消退；皮膚干燥起屑、瘙癢不適；大便干結(jié)不暢，一般2～3日1次；重壓患者關(guān)節(jié)，患者稱有痛，且皺眉頭表示不適，被動(dòng)活動(dòng)輕度受限；女性患者陰道干燥，對(duì)性交有一定影響。

重度(3分)的患者疲勞感明顯，靜息時(shí)亦有疲勞感；常有低熱，持續(xù)時(shí)間大于15日；患者鼻腔干燥灼熱，常有鼻血， 血量較多；舌干紅無苔或較多剝脫， 舌暗紅或紫氣或紫斑；腮腺或頜下腺腫大疼痛不消，甚或伴發(fā)熱；皮膚干燥有裂、瘙癢明顯，皮屑多；大便干結(jié)難解，3 日以上 1 次，常需用瀉藥幫助排便；重度壓痛，重壓患者稱有壓痛，且退縮逃脫，被動(dòng)活動(dòng)嚴(yán)重受限；女性患者陰道干燥，性交非常困難。

1.4臨床療效評(píng)估方法 臨床療效根據(jù)療效指數(shù)[10]及治療后臨床表現(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)估，以此鑒定三參飲臨床療效。

療效指數(shù)=100%×(治療前臨床表現(xiàn)評(píng)分-治療后臨床表現(xiàn)評(píng)分)/治療前臨床表現(xiàn)評(píng)分[10]。

緩解明顯患者其臨床癥狀及體征基本消失(療效指數(shù) 95%)；緩解較顯著患者臨床癥狀及體征改善明顯(95%>療效指數(shù) 70%)；有一定效果指患者癥狀和體征有好轉(zhuǎn)(70%>療效指數(shù) 30%)；無臨床效果患者則表現(xiàn)為癥狀、體征無改善，甚至有所加重(療效指數(shù)<30%)[10]。

1.5三參飲治療期間不良反應(yīng)評(píng)估 根據(jù)三參飲臨床治療期間的不良反應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，可以了解該治療安全性，為今后臨床應(yīng)用提供安全性評(píng)價(jià)指標(biāo)[10]。

根據(jù)受試者主觀感受、是否影響治療進(jìn)程以及對(duì)受試者健康所造成的客觀后果等方面，將不良反應(yīng)的嚴(yán)重程度分為以下3種[10]：(1)輕度不良反應(yīng)：受試者可忍受，不影響治療，不需要特別的處理，對(duì)受試者康復(fù)無影響。(2)中度不良反應(yīng)：受試者難以忍受，需要撤藥或做特殊處理，對(duì)受試者康復(fù)有直接影響。(3)重度不良反應(yīng)：危及受試者生命，致死或致殘，需立即撤藥或做緊急處理。

1.6采用干燥綜合征模型鼠評(píng)估頜下腺上PD-1及PD-L1表達(dá)檢測(cè) 取6～7周雄性NOD小鼠[11，12]共40只，購(gòu)于北京維通利華公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào):SCXK(京)2011-0011。將小鼠隨機(jī)分4組，分別為空白對(duì)照組(Control group,CG)、低劑量組(Low-does group,LG)、中等劑量組(Middle-dose group,MG)及高劑量組(High-dose group,HG)，按照人鼠等效計(jì)量，分別予以6.7 ml/(kg·d)，13.3 ml/(kg·d)，26.7 ml/(kg·d)三參飲灌胃，持續(xù)4周。心臟采血，后將小鼠脫頸處死，并取頜下腺組織生理鹽水沖洗后固定在10%福爾馬林溶液中，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片。而后將頜下腺的石蠟切片進(jìn)行常規(guī)的脫蠟、脫水處理，并予雙蒸餾水沖洗從而暴露抗原，而后予以過氧化氫處理，而后行免疫組化分析，予以二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精染細(xì)胞核。陰性對(duì)照采用正常小鼠IgG代替一抗，余操作相同。免疫組化中所用抗體來自美國(guó)Ebioscience公司。結(jié)果根據(jù)McCarthy半定量方法根據(jù)在頜下腺中的染色強(qiáng)度分為：無染色：0分；弱陽性染色：1分；中度陽性染色：2分；強(qiáng)陽性染色：3分。

2 結(jié)果

2.1臨床效果 主要癥狀評(píng)價(jià):三參飲可以明顯改善患者口咽部及眼部的干燥情況；予以高劑量的三參飲治療患者其臨床癥狀改善更加明顯。詳見表1。

2.2次要癥狀評(píng)價(jià) 三參飲輔助治療前后次要癥狀均明顯改善，同時(shí)，高劑量組中改善明顯。詳見表2。

2.3總體療效評(píng)價(jià) 高劑量組患者治療總體療效明顯改善，總體有效率明顯增高，且組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

2.3不良反應(yīng)發(fā)生情況 治療過程中無不良反應(yīng)發(fā)生。

2.4干燥綜合征模型小鼠(NOD小鼠)評(píng)估頜下腺上PD-1及PD-L1表達(dá)檢測(cè) 干燥綜合征模型小鼠頜下腺標(biāo)本免疫組化切片提示予以三參飲治療后PD-1及PD-L1表達(dá)相較于空白對(duì)照組降低(詳見表4，圖1、2)。予以Mann-W hitney U檢驗(yàn)，提示Z=-2.872，P<0.05，即予以高劑量三參飲治療，PD-1及PD-L1降低程度較低劑量組顯著。詳見表4。

表1 各組間治療前后主要癥狀評(píng)價(jià)Tab.1 Improvement of main clinical symptoms in different group

Note：There is a significant difference between before and after treatment,1)P<0.05;the significant difference could be found among different groups,2)P<0.05.

表2 各組間治療前后次要癥狀評(píng)價(jià)Tab.2 Evaluation of secondary symptom evaluation improvement

Note：There is a significant difference between before and after treatment,1)P<0.05；the significant difference could be found among different groups,2)P<0.05.

表3 各組間治療前后總體評(píng)價(jià)Tab.3 Conclusion evaluation after treatment

Note：The significant difference could be found among different groups,1)P<0.05.

圖1 治療后小鼠頜下腺PD-1的表達(dá)(IHC,×400)Fig.1 Expression of PD-1 in mice′s submandibular glands after treatment (IHC,×400 )Note: A.CG;B.LG;C.MG;D.HG.

圖2 治療后小鼠頜下腺PD-L1的表達(dá)(IHC,×400)Fig.2 Expression of PD-1 in mice′s submandibular glands after treatment (IHC,×400 ) Note: A.CG;B.LG;C.MG;D.HG.

表4 不同劑量三參飲治療后PD-1及PD-L1表達(dá)情況Tab.4 Expression of PD-1 and PD-L1 in submandibular gland after treatment

Note：The significant difference could be found among different groups,1)P<0.05.

3 討論

干燥綜合征是以累及外分泌腺(頜下腺、淚腺等)為主，以高度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)為主要特征的系統(tǒng)性自身免疫性疾病，分原發(fā)性及繼發(fā)性，臨床表現(xiàn)多樣，以口干、眼部干燥等為主要表現(xiàn)[1]?，F(xiàn)對(duì)治療多使用免疫抑制劑和生物制劑行全身性藥物治療[1-3]。相比于西醫(yī)，中醫(yī)治療長(zhǎng)期臨床效果穩(wěn)定、副作用少、價(jià)格經(jīng)濟(jì)；因此，逐漸被臨床接受。

根據(jù)《內(nèi)經(jīng)》對(duì)燥癥以及燥邪傷人的論述，如口干、眼睛干燥、刺痛、皮膚干燥、伴有乏力、關(guān)節(jié)及周身疼痛等癥狀；現(xiàn)大多數(shù)中醫(yī)學(xué)家將其歸為燥癥的范疇，并提出津液虧損、陰虛致燥為該疾病的基本中醫(yī)病理基礎(chǔ)[4，5，13-15]。目前中醫(yī)治療上，多以達(dá)到潤(rùn)燥、活血、生津、養(yǎng)陰為主。

本研究通過不同劑量的三參飲對(duì)干燥綜合征患者進(jìn)行輔助治療，患者臨床癥狀明顯改善；高劑量組患者臨床癥狀改善更加明顯，提示三參飲有明顯臨床效果。

此外，目前認(rèn)為干燥綜合征作用機(jī)制與CD4+T細(xì)胞及B細(xì)胞的非正常激活有關(guān)[8]。PD-1及PD-L1作為負(fù)性共刺激因子，除可誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡外，還可以阻止T細(xì)胞對(duì)白介素-2及干擾素-γ的分泌；二者的表達(dá)水平與系統(tǒng)性自身免疫性疾病密切相關(guān)。已有研究表明，通過治療，干燥綜合征患者除癥狀改善外，血液及唇腺組織中的PD-1及PD-L1表達(dá)也可顯著降低[8]。此外，該研究通過對(duì)干燥綜合征鼠模型，予以不同劑量三參飲治療，比較小鼠頜下腺PD-1及PD-L1表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)予以三參飲治療小鼠其頜下腺中與自身免疫性疾病相關(guān)的PD-1及PD-L1表達(dá)量降低，該降低程度與治療劑量呈正比。提示三參飲可能通過調(diào)節(jié)機(jī)體系統(tǒng)免疫發(fā)揮作用，該結(jié)果對(duì)研究三參飲作用機(jī)制提供方向。