補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑復(fù)配對(duì)桃褐腐病菌的增效作用

王曉琳 孫偉波 李朝輝 黃潔雪 鄔劼 吉沐祥

摘要：以桃褐腐病病菌（Monilinia fructicola）為供試菌，采用菌絲生長(zhǎng)速率法，測(cè)定腈苯唑、補(bǔ)骨脂種子提取物、丙硫菌唑、咯菌腈、氟啶胺和吡唑醚菌酯對(duì)桃褐腐病病菌的毒力。結(jié)果表明，5種化學(xué)殺菌劑對(duì)桃褐腐病病菌的抑制中濃度最低的是丙硫菌唑，其EC50僅為0.003 5 μg/mL，其次是腈苯唑，其EC50為0.003 8 μg/mL，抑制中濃度最高的為吡唑醚菌酯，其EC50為0.576 7 μg/mL。在離體條件下測(cè)定補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比篩選試驗(yàn)，結(jié)果表明，當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑的質(zhì)量比為10 ∶1時(shí)，EC50僅為0.010 4 μg/mL，SR值為3.744 5;比例為1 ∶1和 1 ∶5 時(shí)SR次之，分別為2.875 2和2.056 4。綜合離體試驗(yàn)結(jié)果和經(jīng)濟(jì)因素，確定補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑防治桃褐腐病病菌的最佳比例為1 ∶1。

關(guān)鍵詞：補(bǔ)骨脂種子提取物;丙硫菌唑;桃褐腐病病菌;復(fù)配;增效作用

中圖分類號(hào)： S436.621.1+3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）18-0114-05

收稿日期：2019-11-21

基金項(xiàng)目：江蘇省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：BE2018389）;國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD0201400-2）。

作者簡(jiǎn)介：王曉琳（1986—），女，遼寧營(yíng)口人，碩士，助理研究員，主要從事應(yīng)時(shí)鮮果病蟲(chóng)草害防治研究。E-mail：morethan365@126.com。

通信作者：吉沐祥，研究員，主要從事果樹(shù)植保與農(nóng)藥開(kāi)發(fā)研究。E-mail：jilvdun2800@163.com。

桃人工栽培歷史悠久，距今已有4 000多年歷史，是我國(guó)主要水果之一。桃褐腐病是由子囊菌鏈核盤(pán)菌（Monilinia spp.）侵染造成的，桃褐腐病通常發(fā)生在開(kāi)花旺盛期和采收前，危害桃樹(shù)葉片、花朵、枝條和果實(shí)，引起腐爛枯死，環(huán)境條件適宜時(shí)會(huì)在采后桃貯藏、運(yùn)輸和銷售中發(fā)生，導(dǎo)致桃果實(shí)產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響[1-2]。目前，防治桃褐腐病的主要手段是化學(xué)防治，主要?dú)⒕鷦┯腥蝾悺⒈奖溥蝾?、二甲酰亞胺類和甲氧基丙烯酸酯類等。何獻(xiàn)聲通過(guò)試驗(yàn)19種殺菌劑對(duì)桃褐腐病離體抑菌活性發(fā)現(xiàn)，啶菌唑和腈苯唑?qū)μ液指‰x體抑菌活性較為突出，10 mg/L質(zhì)量濃度下，啶菌唑和腈苯唑?qū)μ液指〔【z生長(zhǎng)抑菌率達(dá)100%[3]。紀(jì)兆林等通過(guò)采用菌絲生長(zhǎng)抑制法測(cè)定8類15種殺菌劑對(duì)桃褐腐病病菌的毒力效果發(fā)現(xiàn)，毒力作用最強(qiáng)的是咪鮮胺，其次是己唑醇[4]。周瑩等通過(guò)研究幾種殺菌劑對(duì)桃褐腐病的毒力測(cè)定及田間控制作用發(fā)現(xiàn)，甲基硫菌靈和復(fù)配殺菌劑克菌·戊唑醇對(duì)大連地區(qū)桃褐腐病病菌具有較強(qiáng)毒力[5]。由于長(zhǎng)期使用單一作用位點(diǎn)的殺菌劑，會(huì)使病原菌對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性。陳淑寧通過(guò)研究桃褐腐病病菌對(duì)甾醇脫甲基抑制劑類（DMI）殺菌劑的抗性發(fā)現(xiàn)，采自云南省的16株桃褐腐菌株中，15株對(duì)多菌靈產(chǎn)生抗性，并且和乙霉威產(chǎn)生負(fù)交互抗性[6]。

相關(guān)研究表明，利用生物農(nóng)藥或植物源殺菌劑能夠安全有效地控制植物病害。侯旭等發(fā)現(xiàn)，從桃樹(shù)根部組織中分離到的內(nèi)生拮抗真菌ZJ-4菌株對(duì)桃褐腐病病原菌的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用[7]。紀(jì)兆林等通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌菌株W10菌液及其產(chǎn)生的抗菌蛋白對(duì)貯藏期桃褐腐病有較好的抑制作用，高濃度效果更好，W10菌液和抗菌蛋白浸果處理能顯著降低貯藏期的桃自然腐爛率，與多菌靈效果相當(dāng)[8]。袁雪等從高產(chǎn)桃園土壤中分離、篩選得到特基拉芽孢桿菌菌株B-23，以1×109 CFU/mL 菌懸液處理桃果實(shí)、葉片和枝條，對(duì)桃褐腐病抑制率分別為74.5%、83.3%和60.0%[9]。補(bǔ)骨脂種子提取物是沈陽(yáng)同祥生物農(nóng)藥有限公司2019年登記的植物源農(nóng)藥，其有效成分可通過(guò)破壞病原菌的細(xì)胞膜、線粒體膜、核膜等膜系統(tǒng)和干擾細(xì)胞代謝過(guò)程而達(dá)到殺菌的目的。丙硫菌唑是拜耳公司開(kāi)發(fā)的新型廣譜三唑硫酮類殺菌劑[10]，屬甾醇脫甲基化（麥角甾醇的生物合成）抑制劑。具有選擇性、保護(hù)性、治療性和持效性等特點(diǎn)，2019年在我國(guó)的2家公司：安徽久易農(nóng)業(yè)股份有限公司和山東海利爾化工有限公司取得登記。本研究選用植物源農(nóng)藥補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑復(fù)配，明確2種藥劑的最佳配比，旨在為桃褐腐病的防治提供理論指導(dǎo)。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?供試菌株

桃褐腐病菌（M. fructicola）采自江蘇省溧水白馬基地桃園，由揚(yáng)州大學(xué)園藝與植物保護(hù)學(xué)院分離、鑒定并保存?zhèn)溆谩＞瓯４嬗隈R鈴薯蔗糖瓊脂（PDA）斜面上（4 ℃）。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)在PDA培養(yǎng)基平板上轉(zhuǎn)接1次后，于25 ℃預(yù)培養(yǎng)3 d，從菌落邊緣取直徑5 mm菌絲塊用于測(cè)定。

1.1.2?試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2019年4—6月在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.3?供試藥劑?供試藥劑詳見(jiàn)表1。

1.2?試驗(yàn)方法

1.2.1?藥液的配制及濃度設(shè)計(jì)

將試驗(yàn)藥劑用蒸餾水溶解，配制成1 000 μg/mL的母液。

桃褐腐病病菌不同藥劑單劑的濃度設(shè)計(jì)見(jiàn)表2。

補(bǔ)骨脂種子提取物、丙硫菌唑與不同配方的濃度設(shè)計(jì)見(jiàn)表3。

單劑與復(fù)配劑的濃度設(shè)計(jì)均為6個(gè)2倍稀釋的梯度濃度含藥PDA培養(yǎng)基，所有試驗(yàn)藥劑系列濃度的藥液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.2?殺菌劑對(duì)桃褐腐病病菌室內(nèi)毒力測(cè)定

25 ℃ 條件下培養(yǎng)3 d后利用十字交叉法測(cè)量各處理菌落直徑，以不含殺菌劑的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照，每處理重復(fù)4次。計(jì)算出藥劑的抑制百分率，按毒力回歸方程Y=a+bx計(jì)算藥劑抑制菌絲生長(zhǎng)的有效中濃度（EC50），作為毒力參數(shù)。計(jì)算公式為D=D1-D2。式中：D為菌落增長(zhǎng)直徑;D1為菌落直徑;D2為菌餅直徑）。I=（D0-Dt）/D0*100%。式中：I為菌絲生長(zhǎng)抑制率;D0為空白對(duì)照菌落增長(zhǎng)直徑;Dt為藥劑處理菌落增長(zhǎng)直徑。

1.2.3?殺菌劑對(duì)桃褐腐病病菌的最佳配比離體試驗(yàn)篩選

采用機(jī)率值分析法計(jì)算每個(gè)殺菌劑對(duì)靶標(biāo)菌菌絲生長(zhǎng)的有效抑制中濃度，并通過(guò)下面公式計(jì)算混合藥劑的增效系數(shù)（SR）。

EC50（Exp）=a+baEC50（A）+bEC50（B）;

SR=EC50（Exp）EC50（Obs）。

式中：字母a代表藥劑A在混合藥劑中所占的比例;字母b代表藥劑B在混合藥劑中所占的比例;EC50 （Obs）為實(shí)際測(cè)定的混合藥劑對(duì)病原菌的抑制中濃度;EC50（Exp）為混合藥劑對(duì)病原菌的理論抑制中濃度。通過(guò)上面2個(gè)公式計(jì)算得每個(gè)設(shè)定比例的配方的SR值，SR>1.5說(shuō)明2種藥劑復(fù)配具有增效作用，0.5≤SR≤1.5說(shuō)明2種藥劑之間復(fù)配具有相加作用，SR<0.5表明2種藥劑為拮抗作用[11]。

2?結(jié)果與分析

2.1?室內(nèi)抑菌活性測(cè)定

2.1.1?不同種類殺菌劑對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

從表4可以看出，當(dāng)腈苯唑?yàn)?0.006 25～0.200 00 μg/mL時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為85.53%～100%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物為0.375～12.000 μg/mL時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為42.76%～67.43%;當(dāng)丙硫菌唑?yàn)?.006 25～0.200 00 μg/mL時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為88.49%～100%;當(dāng)咯菌腈為 0.062 5～2.000 0 μg/mL時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為67.76%～100%;當(dāng)氟啶胺為 0.031 25～1.000 00 μg/mL時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為65.78%～100%;當(dāng)吡唑醚菌酯為0.375 ～12.000 μg/mL 時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為57.04%～100%。

不同殺菌劑對(duì)桃褐腐病病菌的毒力測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5，對(duì)桃褐腐病病菌抑制中濃度最低的是丙硫菌唑，其次是腈苯唑。6種單劑的活性（EC50）分別為丙硫菌唑（0.003 5 μg/mL）>腈苯唑（0.003 8 μg/mL）>氟啶胺（0.042 2 μg/mL）>咯菌腈（0.084 0 μg/mL）>吡唑醚菌酯（0.576 7 μg/mL）>補(bǔ)骨脂種子提取物（1.679 2 μg/mL）。

2.1.2?補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑?qū)μ液指〔【z生長(zhǎng)的抑制作用

從表6可以看出，當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物為0.375～12.000 μg/mL時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為22.54%～8350%;當(dāng)丙硫菌唑?yàn)?.003 125～0.100 000 μg/mL時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為56.40%～100%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比10 ∶1的濃度為0.006 25～0.200 00 μg/mL 時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為42.12%～99.33%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比為5 ∶1的濃度為0003 125～0.100 000 μg/mL 時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為6.31%～85.77%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比1 ∶1的濃度為 0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為44.91%～99.02%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比1 ∶5的濃度為0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為64.24%～100%;當(dāng)補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑配比1 ∶10的濃度為0001 562 5～0.050 000 0 μg/mL 時(shí)，對(duì)桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率為65.52%～100%。

將表4中篩選的補(bǔ)骨脂種子提取物和丙硫菌唑進(jìn)行復(fù)配，采用Wedley法確定其最佳配比（表7）。由毒力回歸曲線方程、抑制中濃度和SR值可以得出補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑的比例在10 ∶1時(shí)，SR值最大，為3.74，此時(shí)EC50為0.010 4 μg/mL。比例在1 ∶1、1 ∶5和1 ∶10時(shí)SR值比較大，分別為2875 2、2.056 4和1.979 7，所以根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果和從價(jià)格方面考慮，推薦補(bǔ)骨脂種子提取物與丙硫菌唑以1 ∶1復(fù)配。

3?討論

目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)已進(jìn)入新時(shí)代，從關(guān)注作物自身安全轉(zhuǎn)為保障整個(gè)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)加工系統(tǒng)的可持續(xù)性，尋找新的高效、低毒和環(huán)境相容性好的殺菌劑是當(dāng)前研究的趨勢(shì)，一些中草藥提取物具有殺菌作用，對(duì)人體和環(huán)境無(wú)危害，增加了對(duì)水果食用的安全性。植物源殺菌劑指的是從具有殺菌、抑菌活性的天然植物的某些部位提取有效成分，將其分離純化然后經(jīng)過(guò)加工得到的藥劑。關(guān)麗杰等通過(guò)液體培養(yǎng)方法研究補(bǔ)骨脂提取物對(duì)蘋(píng)果腐爛病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用發(fā)現(xiàn)，當(dāng)補(bǔ)骨脂提取物濃度為 80 mg/L 時(shí)，對(duì)蘋(píng)果腐爛病病菌菌絲干質(zhì)量的抑制率達(dá)98.3%[12]。關(guān)麗杰等采用菌絲生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)法，研究補(bǔ)骨脂提取物對(duì)黃瓜炭疽病病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制中濃度（EC50）為62.973 mg/L，孢子萌發(fā)的抑制中濃度為8.213 mg/L[13]。本試驗(yàn)通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定補(bǔ)骨脂種子提取物抑制桃褐腐病病菌菌絲生長(zhǎng)的EC50為1.679 2 μg/mL。相比于傳統(tǒng)的三唑類殺菌劑，丙硫菌唑在化學(xué)結(jié)構(gòu)中引入硫酮結(jié)構(gòu)，殺菌譜更廣，內(nèi)吸性更好，持效期更長(zhǎng)。據(jù)相關(guān)報(bào)道，丙硫菌唑?qū)π←湷嗝共14]、人參菌核病[15]、水稻惡苗病[16]、梨樹(shù)褐斑病、黑星病、白粉病[17] 等有很好的防治效果，在桃褐腐病上的防治應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究6種殺菌劑對(duì)桃褐腐病病菌的毒力測(cè)定結(jié)果表明，抑制中濃度最低的是丙硫菌唑，5種化學(xué)農(nóng)藥單劑的活性（EC50）分別為丙硫菌唑（0.003 5 μg/mL）>腈苯唑（0.003 8 μg/mL）>氟啶胺（0.042 2 μg/mL）>咯菌腈（0.084 0 μg/mL）>吡唑醚菌酯（0.576 7 μg/mL）。

藥效增效復(fù)配可以完善植物源活性物質(zhì)與活性成分研究的技術(shù)體系，突破植物源農(nóng)藥產(chǎn)品劑型單一、多為單劑的現(xiàn)狀，推動(dòng)及促進(jìn)我國(guó)植物源農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。本研究通過(guò)試驗(yàn)和綜合經(jīng)濟(jì)因素得出，補(bǔ)骨脂種子提取物和丙硫菌唑殺菌劑以 1 ∶1 的比例混合，在離體條件下對(duì)桃褐腐病病菌具有增效作用，為有效的防治桃褐腐病提供了依據(jù)，以便更好地為農(nóng)業(yè)服務(wù)，其在田間的實(shí)際防治效果還有待進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。

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