藥用植物草珊瑚快速繁殖體系的建立

李林軒 梁瑩 覃犇 谷筱玉 韋范 韋坤華

摘要：對草珊瑚（Sarcandra glabra）進行組織培養(yǎng)快速繁殖技術研究，建立草珊瑚的快速繁殖體系。結果表明，草珊瑚外植體的最佳消毒滅菌方法為使用75%乙醇消毒30 s，再用無菌水涮洗1遍，然后置于0.1%HgCl2溶液（加1～2滴表面活性物質(zhì)吐溫-80）浸泡消毒8～9 min，用無菌水浸洗2次，每次浸洗5 min。草珊瑚不定芽誘導的最適培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA;草珊瑚叢生芽繼代增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA。誘導草珊瑚生根的最適宜培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA。草珊瑚試管苗移栽的最佳基質(zhì)為泥炭土+蛭石，比例為1 ∶1。

關鍵詞：草珊瑚;繁殖;叢生芽;生根;外植體消毒;不定芽誘導;培養(yǎng)基

中圖分類號： S567.23+9.043文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0072-05

收稿日期：2019-09-25

基金項目：國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（編號：CARS21）;廣西創(chuàng)新驅動發(fā)展專項資金（編號：桂科AA18242040）;廣西科技計劃（編號：桂科AD17129044）;廣西科技基地和人才專項（編號：桂科AD1850002、桂科2017AD19001）;“廣西八桂學者”專項（編號：桂藥創(chuàng)2019007;桂藥創(chuàng)2019005）;桂林市科技計劃項目重大專項（編號：20180102-4）。

作者簡介：李林軒（1986—），男，廣西全州人，碩士，高級工程師，從事中藥資源保護與開發(fā)利用研究。E-mail：175153419@qq.com。

通信作者：韋坤華，博士，研究員，主要從事藥用植物生物技術研究。E-mail：divinekh@163.com。

草珊瑚[Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai]別稱腫節(jié)風、九節(jié)茶，為金粟蘭科草珊瑚屬多年生草本植物，整株入藥，具有清熱涼血、祛風通絡、活血消斑等功效，用于治療血熱紫斑、紫癜、風濕痹痛、跌打損傷等癥[1]。此外，草珊瑚也是瑤族用藥的重點品種，是“五虎”“九?！薄笆算@”“七十二風”等瑤藥老班藥中的風藥品種之一。在廣西壯瑤地區(qū)，人們廣泛使用草珊瑚進行清熱涼血，散淤消腫，祛風通絡[2]。鑒于草珊瑚的良好療效，為了更好地開發(fā)和利用中藥草珊瑚資源，筆者對草珊瑚優(yōu)良植株進行組織培養(yǎng)快繁技術研究，以利于草珊瑚野生資源的保護和優(yōu)良植株性狀的保持，為草珊瑚遺傳改良提高有效藥用成分打好基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

樣品采集自種植于廣西藥用植物園科研基地內(nèi)的健壯無病蟲害草珊瑚植株，原植物經(jīng)廣西藥用植物園韋坤華研究員鑒定為金粟蘭科植物草珊瑚[Sarcandra glabra （Thunb.） Nakai]，選取其嫩芽為外植體，于天氣晴朗的上午取樣。

1.2?試驗方法

1.2.1?外植體消毒

試驗以嫩芽芽尖作為外植體進行初代誘導，首先將草珊瑚芽尖洗凈，用75%乙醇滅菌30 s，再用無菌水沖洗1遍，將洗干凈的草珊瑚芽尖置于0.1%HgCl2溶液（加1～2滴表面活性物質(zhì)吐溫-80）浸泡消毒5～10 min，用無菌水浸洗2次，每次浸洗5 min，用無菌紙將試驗材料表層的水分吸干，然后接種到MS培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件如下：平均光照強度2 000 lx，光照時間12 h/d，溫度（25±3） ℃。

1.2.2?不定芽誘導

草珊瑚不定芽的誘導采用正交試驗設計，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）、IAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）、6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）進行外源激素篩選，以獲得最佳的不定芽誘導條件，每個處理10瓶，每瓶4個外植體，培養(yǎng)30 d后記錄不定芽的誘導情況，比較不同處理對不定芽誘導的影響。

1.2.3?叢生芽繁殖

草珊瑚叢生芽繁殖優(yōu)化試驗是在MS培養(yǎng)基中進行，采用正交試驗設計，添加 6-BA（1.0、1.5、2.0 mg/L）、IBA（0.1、0.2、0.4 mg/L）、AC（0、0.3、0.5 mg/L）3種外源激素，篩選不同外源激素對草珊瑚叢生芽繁殖的影響因子，30 d后觀察叢生芽的生長情況，統(tǒng)計增殖倍數(shù);芽增殖倍數(shù)=（30 d后芽數(shù)-接種時芽數(shù)）/接種時芽數(shù)[3]，通過叢生芽生長情況與增殖倍數(shù)指標來優(yōu)化繁殖培養(yǎng)基。

1.2.4?生根培養(yǎng)

以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基篩選出草珊瑚組培苗生根最佳培養(yǎng)基配方。采用正交試驗設計，在1/2MS培養(yǎng)基中添加IBA（0.2、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L）和AC（0、0.3、0.5 g/L）進行試驗，每個處理10瓶，每瓶10個單芽，30 d后記錄生根率與生根數(shù)平均值，其中生根率=生根株數(shù)/接種總數(shù)×100%，生根數(shù)平均值=總生根數(shù)/接種總數(shù)×100%[4]，篩選草珊瑚試管苗生根效果最好的培養(yǎng)基。

1.2.5?煉苗及移栽

將生長旺盛、根系發(fā)達的草珊瑚試管苗移入常溫室內(nèi)放置，擰松瓶蓋馴化2 d后，打開蓋子讓草珊瑚試管苗與空氣完全接觸再馴化 3 d，期間定時向瓶內(nèi)的小苗噴霧以保持小苗葉片水分充足。馴化后，從瓶內(nèi)取出幼苗，洗凈根部培養(yǎng)基，移入到黃沙、蛭石、泥炭、泥炭+蛭石（1 ∶1）、泥炭+黃沙（1 ∶1）5種不同基質(zhì)上，適度遮陰，并保持相對濕度在85%以上，30 d后統(tǒng)計不同基質(zhì)中組培苗的成活率[5]。

2?結果與分析

2.1?消毒時間篩選

為了確定消毒劑0.1% HgCl2消毒時間對外植體消毒效果的影響，對5、6、7、8、9、10 min 6個時間的消毒效果進行比較研究，接種15 d后對試驗對象的污染率與成活率進行統(tǒng)計與分析，結果見表1。

由表1可知，草珊瑚消毒效果受其消毒時間影響明顯，隨著消毒時間的延長，草珊瑚污染率明顯下降。根據(jù)試驗結果，5 min內(nèi)草珊瑚的消毒效果不理想，污染率為100%;當消毒時間增加到8 min時;消毒效果較好，成功率高達85%，而消毒時間延長到10 min時，消毒效果最好，污染率為0。但是，除了考慮污染率外，植物外植體消毒還需綜合考慮其存活率。根據(jù)試驗結果，隨著消毒時間的增加，成活率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢，其中成活率在 8 min 時最好，達到90%。綜合考慮不同消毒時間對草珊瑚外植體的污染率與成活率，當消毒時間為8 min時，消毒效果最佳。

2.2?不定芽誘導培養(yǎng)基篩選

將消毒后的芽尖接入不定芽誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7 d左右草珊瑚顏色逐漸變成乳黃色，其不定芽切口處開始增大并疏松，15 d左右在接觸培養(yǎng)基的基部長出不定芽，20 d時草珊瑚不定芽逐漸長出翠綠色葉片并且成簇生長，30 d統(tǒng)計增殖不定芽數(shù)，結果與分析見表2和表3。根據(jù)統(tǒng)計結果，當6-BA濃度保持在1.0～1.5 mg/L的低濃度水平，不定芽數(shù)量隨著濃度增加而增加，不定芽粗壯、顏色新鮮翠綠;但當6-BA濃度高于1.5 mg/L水平時，不定芽數(shù)量隨著濃度的增加反而逐漸下降，不

定芽有玻璃化現(xiàn)象且顏色變?yōu)辄S綠色，表明低濃度6-BA有利于草珊瑚不定芽的誘導，但高濃度對不定芽的誘導有抑制作用。根據(jù)試驗結果，草珊瑚不定芽誘導的最佳培養(yǎng)基應為A2B2C3，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.5 mg/L NAA，以此培養(yǎng)基為基質(zhì)獲得的不定芽、粗壯、顏色呈翠綠色（圖1）。

2.3?叢生芽繼代

以0.5～1.0 cm的不定芽單芽為試驗材料，對草珊瑚叢生芽繁殖培養(yǎng)基進行優(yōu)化篩選（表4、表5）。結果顯示，6-BA、IBA、AC 3種激素的影響順序為A（6-BA）>B（IBA）>C（AC），其中6-BA對叢生芽繁殖有極顯著影響，IBA產(chǎn)生顯著影響，AC對草珊瑚叢生芽繁殖影響不顯著。根據(jù)數(shù)據(jù)分析可見，3個因素的濃度對草珊瑚叢生芽增殖倍數(shù)的影響均具有先升高再降低的趨勢。6-BA濃度為1.5 mg/L、IBA濃度為0.3 mg/L時草珊瑚叢生芽增殖倍數(shù)最高（10.4），且芽苗為翠綠色，長勢較快，質(zhì)量也較好，有利于后期誘導草珊瑚生根。因此，根據(jù)上述試驗結果分析得出，草珊瑚叢生芽增殖的最適培養(yǎng)基應為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA。 重復試驗發(fā)現(xiàn)在此培養(yǎng)基上叢生芽增殖頻率高，增值倍數(shù)達到最高值108，此時叢生芽的質(zhì)量也比其他處理好（圖2）。

2.4?叢生芽誘導生根試驗

為了篩選獲得最佳的生根培養(yǎng)基，使用IBA、NAA和活性炭（AC）3個水平設計正交試驗，將生長旺盛的單芽莖段接入草珊瑚生根培養(yǎng)基中，30 d后，統(tǒng)計草珊瑚生根率（表6、表7）。結果可知，3個因素對草珊瑚生根率的影響順序為A（IBA）>B（NAA）>C（AC），IBA對草珊瑚試管苗的生根率具有極顯著的影響（56.814），NAA對其生根率具有顯著影響（16.489），但AC對草珊瑚生根率無顯著影響（0.302）。IBA、NAA對草珊瑚生根率的影響呈現(xiàn)出在低濃度時促進生根，而在高濃度時抑制生根。當IBA濃度在0.5～1.0 mg/L、NAA濃度在0.1～0.3 mg/L濃度范圍時，草珊瑚試管苗生根率隨著濃度的上升而提高，但高于此濃度，生根率反而逐漸下降。經(jīng)過重復驗證，在1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA生根培養(yǎng)基上的生根率最高，達到100%（如圖3），因此，草珊瑚組培苗生根的最適宜培養(yǎng)基為1/2MS+1.0 mg/L IBA+0.3 mg/L NAA。

2.5?試管苗的移栽

將試管苗的根洗凈并移植到5種不同的基質(zhì)上，分別為已消毒的黃沙、蛭石、泥炭、泥炭+蛭石（1 ∶1）、泥炭+黃沙（1 ∶1），適度遮陰，并保持一定的濕度，30 d后統(tǒng)計生根率，結果見表9。在5種不同的基質(zhì)處理中，草珊瑚試管苗都能成活，但成活率有較大差異。結果顯示，成活率高低的順序依次為泥炭+蛭石（1 ∶1）>泥炭+黃沙（1 ∶1）>黃 沙> 蛭石>泥炭。因此，泥炭+蛭石（1 ∶1）是移栽試管苗的最佳基質(zhì)，移栽30 d后成活率為96%（圖4）。

3?結論與討論

在植物組織培養(yǎng)中對試驗材料滅菌消毒取得無菌材料是至關重要的，本試驗對草珊瑚莖尖持續(xù)消毒滅菌處理在6～10 min范圍內(nèi)都能獲得無菌材料，滅菌時間為8 min，能夠到達最佳消毒滅菌效果，成功率為85%，滅菌時間高于或者低于8 min都不利于無菌材料的獲得。

組織培養(yǎng)中添加的生長調(diào)節(jié)劑，是誘導植物生芽、生根的關鍵因素，同時也是植物組織培養(yǎng)快速生長所必需[6]。在組織培養(yǎng)快速繁殖中，不同植物所需的生長調(diào)節(jié)劑的類型和濃度也不同[7-8]。本試驗通過對草珊瑚不定芽誘導、叢生芽繁殖及生根培養(yǎng)基進行L9（34）正交試驗優(yōu)化篩選，從而建立草珊瑚組培苗快速繁殖體系。6-BA是植物組織培養(yǎng)領域中非常重要的激素，可以促進植物細胞分裂、側芽生長等[9]，并且對在草珊瑚不定芽誘導和叢芽誘導增殖具有極顯著影響，當6-BA濃度為 15 mg/L 時效果最佳，如果濃度過高，則會抑制草珊瑚生長，這與王愛勤等在研究6-BA濃度對蘆薈組培苗增殖時發(fā)現(xiàn)高濃度6-BA會對蘆薈增殖產(chǎn)生抑制的研究結果[10]相一致。NAA具有促進細胞分裂與擴大、誘導形成不定根等作用[11]，NAA對草珊瑚不定芽誘導生根有著顯著作用，低濃度NAA（低于0.3 mg/L）與生根率呈正相關關系，但大于0.3 mg/L，兩者就會出現(xiàn)負相關，表明NAA濃度過高會抑制叢生芽生根。植物可以自身形成的內(nèi)源生長素IBA，既可以促進植物細胞分裂和細胞生長，又可誘導不定根形成[12]。IBA對草珊瑚不定根誘導具有極顯著影響，低濃度IBA對草珊瑚不定根誘導具有促進作用，但高濃度具有抑制作用。試驗結果還表明，適宜的激素與生長素配比對草珊瑚不定根誘導與叢生芽增殖均具有良好的促進作用，其中 6-BA與IAA、NAA的聯(lián)合應用能促進不定芽的誘導，6-BA 與IBA的聯(lián)合應用能促進草珊瑚叢生芽的增殖，而IBA與NAA的聯(lián)合應用能促進草珊瑚試管苗生根。

草珊瑚試管幼苗移植在不同基質(zhì)上的成活率也有一定差異，成活效果順序為泥炭+蛭石（1 ∶1）>泥炭+黃沙（1 ∶1）>黃沙>蛭石>泥炭。因此，草珊瑚試管苗移植到泥炭 ∶蛭石=1 ∶1的基質(zhì)中最好。

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