動物膽汁及膽汁酸的合成、測定及藥理作用的研究進(jìn)展

王鑫 陳曉 時海波 楊恒 張新笑 徐為民 鄒燁 王道營 苗穎

摘要：動物膽汁作為藥物使用已有幾千年的歷史，伴隨科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，動物膽汁中活性成分膽汁酸的研究也逐步深入，本文介紹了不同動物膽汁的主要膽汁酸成分，尤其是鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸及其藥理作用。就膽汁酸的分離提純方法、理化性質(zhì)及測定方法展開討論，并對鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的藥理作用展開綜述。

關(guān)鍵詞：膽汁酸;鵝去氧膽酸;熊去氧膽酸;制備與提純;藥理作用

中圖分類號： R284;R285文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0036-08

收稿日期：2019-09-06

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項（編號：CARS-41）;國家自然科學(xué)基金（編號：31901612）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號：CX（18）1006];江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20180300）。

作者簡介：王?鑫（1994—），男，江蘇南通人，碩士研究生，研究方向為動物源副產(chǎn)物綜合利用及高值化開發(fā)。E-mail：937411786@qq.com。

通信作者：鄒?燁，博士，副研究員，研究方向為動物源副產(chǎn)物綜合利用及高值化開發(fā)。E-mail：zouye@jaas.ac.cn。

膽汁味苦黏稠，pH值約為7.4，具有明目、消腫、清熱解毒等功效[1]。動物膽汁作為藥物使用已有數(shù)千年，《中華本草》和《本草綱目》中都記錄了幾十種動物膽汁，包含畜類動物豬、牛、羊，禽類動物雞，及其他動物如熊、蛇、兔等的膽汁。不同動物的膽汁化學(xué)成分不同，其主要成分是50%～70%的膽汁酸，除膽汁酸外還含有一些膽色素、脂類、黏蛋白、無機(jī)物、氨基酸、常量元素及微量元素。膽汁的主要生理功能來自于膽汁酸，為了更好地利用動物膽汁的藥用價值，國內(nèi)外研究者對其化學(xué)成分及藥理作用做了大量的研究[2]。近年來膽汁酸被充分應(yīng)用于醫(yī)療食品等行業(yè)，消費者對膽汁酸制品的需求也越來越大。因此，動物膽汁酸的分離提純方法及藥理作用的研究就顯得格外重要，如何高效廉價地得到動物膽汁酸也是相關(guān)科研人員一直研究的問題。

1?動物膽汁研究

膽汁在傳統(tǒng)中醫(yī)藥的應(yīng)用有很長的歷史，其主要應(yīng)用于預(yù)防疾病。研究人員為了充分利用現(xiàn)有的動物膽汁資源，對不同動物膽汁中的膽汁酸和膽紅素等物質(zhì)進(jìn)行化學(xué)分析，相關(guān)科研人員對于膽汁的藥理活性研究也在逐步加深。

目前對于禽類動物膽汁研究最為廣泛的是雞膽汁。雞膽汁呈墨綠色，有一定的黏性，能夠溶于水。臨床上雞膽汁具有瀉肺火利肺氣、清熱解毒明目、溶解膽結(jié)石、促進(jìn)消化吸收的功能，也可用于治療瘧疾、百日咳。雞膽汁的主要成分為膽汁酸（膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸等），另外雞膽汁中還含有鉀、鈉、鈣、鎂等金屬元素，以及一些氨基酸[3]。

畜類動物膽汁中對豬膽、羊膽、牛膽研究較多。豬膽是豬科動物的膽汁，豬膽汁性苦味寒，具有止咳平喘、清肝膽熱、通便解毒的功能，通常用于導(dǎo)腸通便，清肝明目[4]。以豬膽汁作為原料經(jīng)過干燥等加工過程而生產(chǎn)的豬膽粉的主要成分是豬去氧膽酸。羊膽汁是綿羊或者山羊的膽汁，具有清肝明目、清熱解毒、潤肺抗菌的作用?，F(xiàn)代化學(xué)分析表明，羊膽汁中含有膽酸鹽、水分、色素、無機(jī)鹽、蛋白質(zhì)等[5]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)通常將羊膽汁臨床應(yīng)用于抗炎、抑菌、治療肺結(jié)核，也用于治療喉頭紅腫、肝熱目赤、黃疸等疾病。牛膽汁是常見?？苿游锼；蛘唿S牛的膽汁。它具有解毒消腫、利膽通腸、清肝明目的作用，臨床應(yīng)用于治療消化不良及便秘，促進(jìn)脂肪消化，鎮(zhèn)靜或麻醉中樞神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，水分、色素、無機(jī)鹽、膽固醇、脂肪和膽酸鹽是牛膽汁的主要成分[6]。

文獻(xiàn)表明，科研人員對熊、蛇、兔等其他動物的膽汁也有相關(guān)的研究。熊膽汁是除了畜類、禽類膽汁外被科研人員研究最多的膽汁，是熊科動物黑熊或棕熊的膽汁。熊膽作為藥源最早記錄于唐朝的《新修本草》中，是我國四大珍稀動物藥材之首。經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，熊膽汁中主要有效成分是熊去氧膽酸，此外熊膽汁中還含有膽酸、鵝去氧膽酸、膽固醇、膽紅素和許多無機(jī)鹽離子[7]。蛇膽汁的主要成分是膽汁酸、膽色素、膽固醇、氨基酸、無機(jī)鹽和磷等。根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，蛇膽的多種藥理效應(yīng)和生理功能來源于膽汁酸，?；悄懰崾谴蠖鄶?shù)蛇膽的主要成分[8]。近年來，我國兔子養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)展迅速，產(chǎn)生了大量的兔膽汁。這些兔膽資源通常作為廢料被丟棄從而造成巨大的浪費，同時對環(huán)境造成了一定的污染，為了實現(xiàn)資源的有效利用，降低對環(huán)境的污染，許多研究人員將注意力轉(zhuǎn)向兔膽汁的利用與開發(fā)。經(jīng)研究表明，兔膽汁的主要成分為膽酸、去氧膽酸、鵝去氧膽酸、膽色素等[9]。

2?膽汁酸研究

膽汁酸的結(jié)構(gòu)是以膽烷酸為母核，根據(jù)膽烷酸取代基位置和數(shù)目的不同構(gòu)成了不同結(jié)構(gòu)的膽汁酸[10]。膽汁酸對動物的代謝有很大作用[11]，在動物體內(nèi)通常以鈉鹽或者鉀鹽的形式存在，按其結(jié)構(gòu)可以分為兩大類：游離型膽汁酸和結(jié)合型膽汁酸[12]。結(jié)合型膽汁酸的形成是由于氨基化合物與膽酸結(jié)合在一起，主要是甘氨酸（Gly）和?；撬幔═au）與游離型膽汁酸結(jié)合而形成的。而根據(jù)來源的不同膽汁酸又可以分為初級膽汁酸、次級膽汁酸和三級膽汁酸。初級膽汁酸（primary bile acid）由膽固醇直接合成，包含膽酸、鵝去氧膽酸以及相應(yīng)的結(jié)合型膽汁酸;次級膽汁酸（secondary bile acids）是初級膽汁酸經(jīng)過腸道菌酶的催化，脫去羥基轉(zhuǎn)化而成，次級膽汁酸包括去氧膽酸和石膽酸;三級膽汁酸（tertiary bile acid）是次級膽汁酸經(jīng)過肝臟和腸道的重吸收作用后所得的產(chǎn)物，熊去氧膽酸就是典型的三級膽汁酸。膽汁酸的結(jié)構(gòu)通式見圖1、表1。膽汁酸有很多種，其中較為重要的是膽酸、鵝去氧膽酸、熊去氧膽酸等。在動物膽汁中，鵝去氧膽酸通常不以游離態(tài)存在，而是與?；撬岷透拾彼嵝纬山Y(jié)合物而存在。當(dāng)人或動物的肝發(fā)生病變時，體內(nèi)以結(jié)合態(tài)存在的鵝去氧膽酸會轉(zhuǎn)化為游離態(tài)[13]。大多數(shù)動物膽汁內(nèi)都不含有熊去氧膽酸，但其良好的生物活性及藥理作用吸引了眾多研究者的關(guān)注。下面著重介紹一下鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸的研究進(jìn)展。

2.1?鵝去氧膽酸

2.1.1?鵝去氧膽酸的理化性質(zhì)

鵝去氧膽酸，化學(xué)名為3α，7α-二羥基-5-β-膽烷酸，分子式 C24H40O4，其結(jié)構(gòu)見圖2。鵝去氧膽酸的分子量為 392.56，味苦，無臭，呈白色針狀結(jié)晶，屬于酸性化合物。鵝去氧膽酸幾乎不溶于水、石油醚和苯等，微溶于三氯甲烷，易溶于甲醇、乙醇、冰乙酸，熔點為 167～171 ℃，比旋光度為10°～13°，是大多數(shù)動物膽汁的主要膽汁酸。鵝去氧膽酸是一種甾體化合物，包含一個剛性的甾環(huán)和一個5碳的脂肪側(cè)鏈，共24個碳原子，順式稠合甾核的A環(huán)和B環(huán)而形成一個凹腔，位于3位和7位上的一個α羥基都指向凹面，與側(cè)鏈上的羥基組合形成α面，從而表現(xiàn)出親水性;而3個疏水的甲基則指向另一面，形成了憎水的β面，由此產(chǎn)生了水/脂雙親特性[14]。

2.1.2?鵝去氧膽酸的制備與提純

目前市場上的鵝去氧膽酸來源有以下2種，一是從動物膽汁中提取，二是化學(xué)合成?？捎糜谥苯犹崛※Z去氧膽酸的動物膽汁有豬膽汁、雞膽汁和鴨膽汁，但絕大部分從動物膽汁中提取的鵝去氧膽酸都是以雞膽汁為原料[15]。提取方法主要是樹脂法、超臨界萃取法、有機(jī)溶劑提取法和沉淀法。化學(xué)合成法通常以膽酸、去氧膽酸和豬去氧膽酸為原料。

樹脂法是一種利用大孔樹脂來提取鵝去氧膽酸的方法。Wan等通過使用大孔樹脂吸附層析法分離純化出鵝去氧膽酸，首先將鴨膽汁用氫氧化鈉皂化，再加入氯化鈣使膽汁中的鵝去氧膽酸形成鵝去氧膽酸的鈣鹽，使用碳酸鈉沉淀鈣離子，得到了游離的鵝去氧膽酸[15]。通過大孔樹脂HZ-802純化，用50%和60%的乙醇梯度洗脫，最終得到了純度為99%、熔點為160～170 ℃的鵝去氧膽酸。該方法因為具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保等優(yōu)點已經(jīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。席曉志等使用價格便宜、能重復(fù)利用且對鵝去氧膽酸有強(qiáng)吸附力的大孔樹脂D101優(yōu)化了鵝去氧膽酸的提取和純化工藝，使用活性炭將鵝去氧膽酸粗提物回流脫色2 h，45%乙醇溶解上樣，用55%和75%的乙醇洗脫得到鵝去氧膽酸[16]。

超臨界萃取是一種新技術(shù)，因它具有選擇性好、清潔、高效等優(yōu)點而被使用到鵝去氧膽酸的提取分離。該方法不但有效地保存了原料中的活性成分，且綠色環(huán)保無污染[17]。由于超臨界萃取法提取鵝去氧膽酸全程不適用有機(jī)溶劑，因此得到的鵝去氧膽酸不會產(chǎn)生有機(jī)溶劑的殘留，防止了提取過程中對人體有害物質(zhì)的滯留和對環(huán)境的污染。Scalia等以牛膽汁為原料，利用超臨界CO2萃取技術(shù)，增加了去氧膽酸的溶解性，去除了脂肪酸膽固醇等雜質(zhì)，實現(xiàn)了膽汁酸的提取和分離[18]。

有機(jī)溶劑提取法獲得鵝去氧膽酸的原理是使用活性炭脫色，再用有機(jī)溶劑加熱提取，再經(jīng)過濾得到鵝去氧膽酸。我國研究人員曾利用乙醇作為有機(jī)溶劑，后有研究者開始使用三氯甲烷。馮娜使用鴨膽膏為原料，使用乙酸乙酯作為提取溶劑，溫度為78 ℃，濃縮固液比為3.5，時間為1 h，獲得了提取率為80.2%的鵝去氧膽酸[19]。此方法工藝簡單，制取時間短，但試驗過程中會使用大量有機(jī)溶劑，成本較高且會造成一定的環(huán)境污染。若使用有機(jī)溶劑循環(huán)應(yīng)用技術(shù)則能在一定程度上降低生產(chǎn)成本以滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。

沉淀法提取鵝去氧膽酸的原理是利用其與金屬陽離子相結(jié)合會形成沉淀，通常是鈣鹽或鋇鹽。但鋇鹽含有毒性對人體有害，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此使用氯化鈣代替氯化鋇。曹榮安等用氯化鈣提取法從豬膽汁中提取了鵝去氧膽酸，為動物膽汁的提取純化及加工生產(chǎn)開辟了一條切實可行的新途徑[20]。Hu等用鴨膽膏來代替?zhèn)鹘y(tǒng)方法的雞膽汁為原料，研究了鈣鹽法提取鵝去氧膽酸的新工藝，采用正交試驗確定了每100 g鴨膽膏配以甲醇 1 000 mL，20%氯化鈣500 mL，過氧化氫520 mL，60%冰乙酸600 mL的最佳提取條件，所得鵝去氧膽酸的收率為30%[21]。該工藝簡單，適合工業(yè)化生產(chǎn)，能提高畜禽副產(chǎn)品的利用率。

化學(xué)合成鵝去氧膽酸通常是利用還原12位羰基或C11烯烴加氫的方法制備鵝去氧膽酸。以膽酸甲酯為原料，通過Fieser法氧化為羰基化合物，再與對甲苯磺酰肼反應(yīng)后用NaBH4還原水解后得到鵝去氧膽酸。張飛等利用豬去氧膽酸為原料，經(jīng)甲酯化、消去、Oppenauer氧化、6，7位脫氫、環(huán)氧化、催化氫化、3位選擇性還原等反應(yīng)得到鵝去氧膽酸，總產(chǎn)率26%，有較高的應(yīng)用價值[22]。

樹脂法、超臨界萃取、有機(jī)溶劑萃取、沉淀法等直接從動物膽汁中提取鵝去氧膽酸的方法使得鵝去氧膽酸制備方法更加多樣。有機(jī)溶劑提取法和沉淀法在生產(chǎn)過程中可能會產(chǎn)生毒性物質(zhì)而對于環(huán)境產(chǎn)生污染，也會造成生產(chǎn)成本的提高，如需工業(yè)化生產(chǎn)，須要進(jìn)一步研究。而超臨界萃取和樹脂法具有經(jīng)濟(jì)、高效、環(huán)保的優(yōu)點，更適用于工業(yè)化生產(chǎn)。化學(xué)合成法的發(fā)明解決了動物的膽汁來源有限、難以滿足醫(yī)療需求的問題，應(yīng)用價值較高。

2.2?熊去氧膽酸

2.2.1?熊去氧膽酸的理化性質(zhì)

熊去氧膽酸，化學(xué)名3α，7β-二羥基-5β-膽甾烷-24-酸，分子式C24H40O4，分子量392.57，是鵝去氧膽酸的同分異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)見圖3。熊去氧膽酸呈白色粉末，味苦、無臭，不溶于水、三氯甲烷，易溶于冰乙酸、乙醇、氫氧化鈉等。熔點為200～201 ℃，比旋光度為59～62°。熊去氧膽酸的主要特征在3位α羥基、5位β氫和7位β羥基，其中7位β羥基是區(qū)分熊去氧膽酸與鵝去氧膽酸的唯一特征。

2.2.2?熊去氧膽酸的制備與提純

熊去氧膽酸的制備方法有3種：從熊膽汁中提取、化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化法[23]。最初，我國制備熊去氧膽酸的途徑是從黑熊的膽汁中分離出熊去氧膽酸，主要是人工養(yǎng)殖的黑熊，利用活熊膽汁引流法，現(xiàn)已使用無管引流。但是此方法步驟繁雜，制備周期長且來源有限，無法滿足工業(yè)生產(chǎn)的需要，而且熊是國家二級保護(hù)動物，不利于野生珍稀動物物種的延續(xù)。所以現(xiàn)研究人員已把目光轉(zhuǎn)向化學(xué)合成和生物轉(zhuǎn)化法。

化學(xué)合成法是現(xiàn)在工業(yè)生產(chǎn)鵝去氧膽酸的主要方式，通常以膽酸、豬膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸和一些非膽酸類甾體化合物為原料。Ferrari等將膽酸甲酯化乙酰化3位和7位羥基后得到3α，7α- 二乙酰-12α-羥基膽酸甲酯、氧化12位羥基還原酮基，水解3，7，24位酯基得到鵝去氧膽酸，再氧化7位羥基還原7位酮基得到了熊去氧膽酸[24]。He等以廉價易得的膽酸為原料合成熊去氧膽酸，同時研究了甲磺酸酯類化合物的關(guān)鍵消元反應(yīng)條件，確定了最佳溶劑、堿和反應(yīng)溫度。豬去氧膽酸具有價格便宜、來源廣泛等優(yōu)點，具備很大的研發(fā)前景[25]。王鐘麟等使用豬膽汁中的豬膽酸為原料，經(jīng)過甲酯化反應(yīng)、3，6，7位羥基三乙?；磻?yīng)、選擇性水解、Jones氧化、碳酸氫鈉水解得到 6α- 羥基-3，7-二酮基-5β膽酸烷甲酯，再經(jīng)甲磺酰氯反應(yīng)、碘化鈉-鋅粉還原、鋰-液氨得到了熊去氧膽酸[26]。豬去氧膽酸與熊去氧膽酸的差異僅在6，7位羥基，且豬去氧膽酸廉價易得，因此竇倩等以豬去氧膽酸為原料，經(jīng)過酯化反應(yīng)、選擇性氧化、環(huán)氧化和脫保護(hù)等過程，以夏皮羅（Shapiro）反應(yīng)為關(guān)鍵步驟合成了熊去氧膽酸，產(chǎn)率為258%[27]。然后又對該方法進(jìn)行優(yōu)化，使用硅基保護(hù)、Rubuttom氧化、Clemmensen還原縮短了反應(yīng)過程，最終產(chǎn)率288%。鵝去氧膽酸也是化學(xué)法合成熊去氧膽酸的重要原料，盧茂芳等利用鵝去氧膽酸，經(jīng)過氧化和還原反應(yīng)得到了熊去氧膽酸，并對其工藝進(jìn)行改進(jìn)，在氧化過程以N-溴琥珀酰亞胺（NBS）為氧化劑使用次氯酸鈉代替Jounes試劑后減少了毒性，簡化了后處理且提高了熊去氧膽酸的收率[28]。除了膽酸類物質(zhì)，一些非膽酸類甾體化合物也能夠合成熊去氧膽酸，韓興春等以黃酮體為原料，經(jīng)過乙酰化反應(yīng)、NBS加溴并消除得到6，7位脫氫物，再以單過氧鄰苯二甲酸氧化雙鍵環(huán)、鈀碳催化加氫、硼氫化鈉還原、Wittig反應(yīng)、二氧化鉑催化加氫7步反應(yīng)合成鵝去氧膽酸區(qū)，再經(jīng)氧化和還原反應(yīng)合成了熊去氧膽酸[29]。

近年來，利用生物轉(zhuǎn)化法合成熊去氧膽酸的報道越來越多。酶法和微生物發(fā)酵等方法均可用于熊去氧膽酸的制備。隨著固定化細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，研究人員開始將生物法制備熊去氧膽酸的研究方向從單酶系統(tǒng)轉(zhuǎn)向多酶系統(tǒng)。伴隨著帶有輔酶的多酶系統(tǒng)細(xì)胞包埋技術(shù)的突破，使固定化細(xì)胞合成熊去氧膽酸的設(shè)想成為可能。來自梭狀芽孢桿菌的7α羥基類固醇脫氫酶（7α-HSDHs）、7β羥基固醇脫氫酶（7β-HSDHs）、12α羥基類固醇脫氫酶（12α-HSDH）等脫氫酶能夠參與到鵝去氧膽酸的酶法合成中，有報道首次利用Clostridium absonum固定化細(xì)胞得到了熊去氧膽酸，膽酸轉(zhuǎn)化率不高[30-31]。到目前為止，微生物或酶法合成熊去氧膽酸的工藝還不成熟，生產(chǎn)成本高，還未能實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)。

這3種制備方法，從熊膽汁中提取熊去氧膽酸來源稀少，難以滿足市場的需求且有違對動物的保護(hù)，逐漸被淘汰。化學(xué)合成法主要以動物膽酸為原料，但這些方法中存在著反應(yīng)試劑昂貴、操作不便、分離困難、步驟多及收率較低等問題，今后應(yīng)該著重研究使用廉價易得的動物膽酸為原料，步驟簡單、收率高的合成路線。生物轉(zhuǎn)化法的發(fā)展，使得許多研究人員把它和化學(xué)合成法相結(jié)合，目前有把酶法、微生物發(fā)酵法與化學(xué)合成法結(jié)合的趨勢。

3?膽汁酸物性的測定方法

膽汁酸常用的測定方法有紫外可見分光光度法（UV-vis）、紅外光譜法（IR）、薄層色譜法（TLC）、核磁共振氫譜（1HNMR）、高效液相色譜（HPLC）、質(zhì)譜法（MS）等[32]。

3.1?紫外分光光度法

用UV-vis測定膽汁酸，該方法儀器使用簡單、成本較低、操作簡便，但樣品處理時間較長。劉永貴等使用UV-vis法在605 nm處測定蛇膽中膽酸的含量，并且以此作為判斷蛇膽品質(zhì)的優(yōu)劣指標(biāo)，此方法簡便有效[33]。趙啟苗等用UV-vis法，以膽南星中的鵝去氧膽酸為指標(biāo)，檢測波長379 nm，建立了膽南星總膽酸含量的測定方法。此方法操作簡便、重復(fù)性好、準(zhǔn)確度高，適用于評價膽南星的質(zhì)量[34]。

3.2?紅外光譜法

紅外光譜法是一種快速無損檢測技術(shù)，但是定量分析有較大誤差。李文龍等利用近紅外漫反射光譜分析了熊膽粉的提取物，比較不同光譜的預(yù)處理對建模結(jié)果的影響，確定了模型所用的最佳潛變量個數(shù)[35]。用此方法建立了鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸含量的定量校正模型，通過此模型可以對熊膽粉提取物進(jìn)行快速準(zhǔn)確的定性定量分析。Li等利用近紅外光譜建立了一種熊膽粉水解過程的監(jiān)測方法，在水解過程中使用近紅外光譜儀對樣品進(jìn)行采集和測定，建立了TUDCA、TCDCA、UDCA、CDCA的定量校準(zhǔn)模型，可快速測定新批次的樣品[36]。此方法大大減少了樣品分析的工作量，能快速分析出結(jié)果，有利于對熊膽粉水解過程的理解與控制。

3.3?薄層色譜法

TLC能檢測膽汁酸的含量及鑒別雜質(zhì)，佟愛東等使用TLC法建立熊去氧膽酸相關(guān)物質(zhì)檢查方法[37]。此方法能較好地分離鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸，熊去氧膽酸可能含有的各種相關(guān)物質(zhì)的斑點清晰可見，適用于熊去氧膽酸的質(zhì)量控制。陳蓉等將甲醇作為提取溶劑，用硅膠高效薄層板（G）、顯色劑10%硫酸乙醇溶液、展開劑異辛烷-乙酸乙酯-冰醋酸（體積比15 ∶7 ∶6），于460 nm處進(jìn)行薄層定量掃描，建立了同時測定珠黃散中膽酸、去氧膽酸、豬去氧膽酸、鵝去氧膽酸含量的方法。此方法重復(fù)性好、專屬性強(qiáng)、測定結(jié)果精確[38]。范艷美等運(yùn)用TLC法對從豬膽粉中提取的豬去氧膽酸進(jìn)行薄層分析，確定了提取物中含有豬去氧膽酸，此方法準(zhǔn)確有效，重復(fù)性好[39]。

3.4?核磁共振氫譜

1HNMR可以識別出參與分子間相互作用的特定質(zhì)子，此方法具有無損性，不會破壞樣品的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)，試驗方法多樣，適合研究樣品中的復(fù)雜成分。Matsuok等利用核磁共振氫譜從分子間相互作用的角度對?；敲撗跄懰徕c（NaTDC）、?；切苊撗跄懰徕c（NaTUDC）、?；蛆Z膽酸鈉（NaTCDC）、?；悄懰徕c（NaTC）4種膽汁酸鹽形成的膠束進(jìn)行了比較和測定，研究表明NaTC和其他3種膽汁酸鹽不同，其膠束在溶液中仍然是小的初級結(jié)構(gòu)[40]。劉雙等用核磁共振氫譜圖測定了由豬去氧膽酸合成的異熊去氧膽酸結(jié)構(gòu)，確定了所合成化合物的結(jié)構(gòu)與異熊去氧膽酸結(jié)構(gòu)一致[41]。

3.5?質(zhì)譜與高效液相色譜

MS被廣泛應(yīng)用于復(fù)雜組分的分離與鑒定，有很高的靈敏度，是生物樣品研究的有效工具。HPLC具有強(qiáng)大的分離能力，因分離效率高時間短、柱效高、檢測靈敏度短、流動相可控等優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)含量的測定。Mostafa等用高效液相色譜法同時測定熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸混合物及片劑中熊去氧膽酸的含量[42]。Wang等用高效液相色譜法對7種膽汁酸樣品和膽汁酸進(jìn)行化學(xué)成分分析及體外細(xì)胞毒性的測定，證明了牛膽汁可能是肝癌治療中熊膽的潛在替代品[43]。高旭等采用HPLC-MS/MS法同時測定了牛黃提取物及不同來源所得牛黃提取物中的膽酸、甘氨膽酸、甘氨石膽酸、石膽酸、牛磺脫氧膽酸鈉5種膽酸的含量，比較了不同提取方法對這5種膽汁酸含量的影響[44]。

除上述方法外，還有光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡、熔點測定等用于測定膽汁酸。

4?藥理作用及臨床應(yīng)用

4.1?鵝去氧膽酸的藥理作用及臨床應(yīng)用

鵝去氧膽酸在各種不同動物的膽汁中廣泛存在，是雞、鴨、鵝等家禽膽汁的主要成分。鵝去氧膽酸能抑制3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-COA）還原酶的活性，擴(kuò)大膽汁酸池以便于膽固醇通過微膠粒狀態(tài)溶解，減少膽固醇的合成，抑制膽固醇的排泄和降低小腸中膽固醇的重吸收作用而達(dá)到溶解膽固醇型結(jié)石的功效[45]。魏松以100位膽結(jié)石患者為研究對象，對觀察組病患的常規(guī)治療藥物搭配鵝去氧膽酸治療，觀察對照組及觀察組B超結(jié)果的變化及臨床反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)搭配鵝去氧膽酸治療的觀察組的總治療率為92.0%，顯著高于僅用常規(guī)藥物治療的對照組[46]。

鵝去氧膽酸能夠減少全身血液和組織中的NO含量，抑制炎癥的加劇。NO會導(dǎo)致毛細(xì)血管的擴(kuò)張，使?jié)B透性增加，從而導(dǎo)致炎癥。鵝去氧膽酸可增加小鼠皮膚毛細(xì)血管通透性、對小鼠耳殼炎癥和甲醛性足腫脹等表現(xiàn)出了很好的抗炎作用，鵝去氧膽酸能夠抑制絕大多數(shù)急慢性炎癥。

鵝去氧膽酸也能夠增加器官組織中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的含量，松弛氣管平滑肌，擴(kuò)張支氣管，從而達(dá)到鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰的作用。趙紅霞按 0.15 g/kg 和0.225 g/kg的劑量對小鼠進(jìn)行灌胃，利用競爭性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法進(jìn)行檢測，灌胃給藥鵝去氧膽酸后的小鼠器官組織中的cAMP含量顯著提高，產(chǎn)生了極顯著的鎮(zhèn)咳、平喘、祛痰的作用[47]。

鵝去氧膽酸對革蘭氏陽性菌有明顯的抑菌作用，但對格蘭氏陰性菌抑菌效果不明顯。錢桂敏等構(gòu)建了膽道內(nèi)源膽汁酸缺乏的大鼠模型，給模型大鼠灌服鵝去氧膽酸，發(fā)現(xiàn)鵝去氧膽酸能顯著降低腸道內(nèi)芽孢桿菌屬、丹毒菌屬及紅椿菌屬的含量[48]。Shi等研究了鵝去氧膽酸對大腸桿菌的殺滅效果，培養(yǎng)3個月的處理組相比對照組有很好的抑制效果，表明鵝去氧膽酸能夠很好地抑制大腸桿菌活性[49]。經(jīng)研究，鵝去氧膽酸還可以顯著增加熱應(yīng)激小鼠肝臟的抗氧化能力，緩解熱應(yīng)激小鼠的肝臟氧化損傷[50]。

目前鵝去氧膽酸的應(yīng)用主要集中在溶解膽固醇型結(jié)石上，對其分子水平的研究及其他藥效的應(yīng)用較少[51]。目前為止，關(guān)于鵝去氧膽酸作用機(jī)理的研究還不多，須要相關(guān)科研人員進(jìn)一步研究。

4.2?熊去氧膽酸的藥理作用及臨床應(yīng)用

熊去氧膽酸能增加膽汁酸的分泌，促進(jìn)肝腸循環(huán)[52]，改變膽汁的成分，降低膽汁中膽固醇酯及膽固醇的含量，使結(jié)石中的膽固醇逐漸溶解，因此醫(yī)學(xué)上用熊去氧膽酸來溶解膽結(jié)石中的膽固醇，預(yù)防肝硬化。劉彤等以2014—2017年的243例膽囊結(jié)石病患為樣本，按數(shù)字隨機(jī)表分為對照組和觀察組，對觀察組的病人除給予常規(guī)治療外口服熊去氧膽酸膠囊。結(jié)果表明，觀察組92.62%的總有效率明顯高于對照組的81.82%[53]。因此，熊去氧膽酸能有效緩解膽固醇型結(jié)石的癥狀，縮小結(jié)石的直徑。

熊去氧膽酸還能激活蛋白激酶C和鈣離子形成的信號網(wǎng)絡(luò)以及有分裂活性的蛋白激酶，以此來增強(qiáng)膽汁淤積于肝細(xì)胞時的分泌能力，降低血液和肝細(xì)胞中內(nèi)源性疏水膽酸的濃度，防止膽汁在肝膽淤積。張瑩等利用熊去氧膽酸對重度妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積患者進(jìn)行治療，顯著改善了患者肝功能及膽汁淤積所致的臨床癥狀[54]。

體外研究表明，熊去氧膽酸能夠顯著減弱乙醇對肝細(xì)胞的毒性，且能夠改善非乙醇性肝病的患者的血清指標(biāo)[55]。熊去氧膽酸是一種無毒的親水性膽汁酸，能通過競爭性抑制的方式減少回腸內(nèi)毒性內(nèi)源性膽酸的吸收。熊去氧膽酸還能通過競爭方式取代細(xì)胞器和細(xì)胞膜上的毒性膽酸分子，防止膽管和肝細(xì)胞受到毒性膽酸的損害。

熊去氧膽酸因其藥理作用被廣泛應(yīng)用于原發(fā)性膽汁肝硬化（PBC）、膽囊纖維化肝?。–F）、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥（ICP）、原發(fā)性硬化性膽囊炎（PSC）及非乙醇性脂肪肝（NAFLD）等疾病，有極高的臨床使用價值。

5?結(jié)束語

膽汁酸因其良好的生理活性越來越受到人們的關(guān)注，鵝去氧膽酸和熊去氧膽酸因其溶解膽結(jié)石、保護(hù)肝臟、止咳平喘、消炎抗菌等功效被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療食品等工業(yè)。然而還有一些問題尚未解決，目前的研究主要集中在膽汁酸制備提純技術(shù)的優(yōu)化上，膽汁酸的微生物合成方法技術(shù)還不成熟，如需工業(yè)化生產(chǎn)需降低成本，如何以廉價易得的原料制得膽汁酸需要相關(guān)研究人員進(jìn)一步研究。紫外分光光度法、薄層色譜法、紅外光譜法、核磁共振氫譜、高效液相色譜和質(zhì)譜等均可用于膽汁酸物性的測定，應(yīng)根據(jù)樣品的實際情況選擇合適的測定方法。伴隨著新技術(shù)的不斷突破，相信會有更多的新技術(shù)應(yīng)用于膽汁酸的定性定量測量，為膽汁酸的研究提供技術(shù)支撐。

參考文獻(xiàn)：

[1]姜姣姣，楊?鵬，時新剛，等. 動物膽汁的成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品，2017，19（3）：227-230.

[2]Hofmann A F，Hagey L R. Key discoveries in bile acid chemistry and biology and their clinical applications：history of the last eight decades[J]. Journal of Lipid Research，2014，55（8）：1553-1595.

[3]張?青. 雞膽汁的藥理作用及應(yīng)用[J]. 食品與藥品，2005，7（2）：18-19.

[4]石?巖，魏?鋒，馬雙成. 豬膽藥用研究進(jìn)展及質(zhì)量控制概況[J]. 中國中藥雜志，2018，43（4）：637-644.

[5]辛永濤，李衛(wèi)民，高?英. 預(yù)處理方法對羊膽汁中膽酸含量的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（20）：30-32.

[6]白萬富，鞠愛華，楊?乾. 牛膽汁的化學(xué)成分及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2008，23（2）：149-151.

[7]袁?斌，任穎龍，馬?莉，等. 膽汁酸類成分替代中藥熊膽的藥性分析[J]. 中國中藥雜志，2014，39（4）：738-743.

[8]Zheng T J，Cheng X L，Wan L C，et al. Differentiation of various snake bile derived from different genus by high-performance thin-layer chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry[J]. Journal of AOAC International，2019，102（3）：708-713.

[9]譚文敏，任東波，何忠梅. 兔膽化學(xué)成分和藥理作用的研究進(jìn)展[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016（1）：39-40，45.

[10]Alrefai W A，Gill R K. Bile acid transporters：structure，function，regulation and pathophysiological implications[J]. Pharmaceutical Research，2007，24（10）：1803-1823.

[11]Trauner M，Claudel T，F(xiàn)ickert P，et al. Bile acids as regulators of hepatic lipid and glucose metabolism[J]. Digestive Diseases，2010，28（1）：220-224.

[12]李炎桂，王海軍，賈?赟，等. 動物膽類中藥化學(xué)成分研究概述[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2019，40（7）：115-119.

[13]de Aguiar V T Q. Tarling E J，Edwards P A. Pleiotropic roles of bile acids in metabolism[J]. Cell Metabolism，2013，17（5）：657-669.

[14]Posa M，Kuhajda K. Hydrophobicity and haemolytic potential of oxo derivatives of cholic，deoxycholic and chenodeoxycholic acids[J]. Steroids，2010，75（6）：424-431.

[15]Wan J F，He J M，Cao X J. A novel process for preparing pure chenodeoxycholic acid from poultry bile[J]. Journal of Industrial and Engineering Chemistry，2012，18（1）：65-71.

[16]席曉志，郭莎莎，曹?慧，等. 鵝去氧膽酸的大孔樹脂純化工藝優(yōu)化及其降血脂活性[J]. 現(xiàn)代食品科技，2018，34（8）：123-129.

[17]馬雪梅，劉敦華. 超臨界流體萃取技術(shù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J]. 現(xiàn)代食品，2018（17）：161-163.

[18]Scalia S，Williams J R，Shim J H，et al. Supercritical fluid extraction of bile acids from bovine bile raw materials[J]. Chromatographia，1998，48（11/12）：785-789.

[19]馮?娜. 鴨膽膏中鵝去氧膽酸提取及熊去氧膽酸合成[D]. 天津：天津科技大學(xué)，2018：43.

[20]曹榮安，李良玉，張麗萍. 豬膽汁中鵝去氧膽酸提取工藝的研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2011，32（4）：12-15.

[21]Hu X Z，Na F，Zhang J Q. Study on the factors influencing the extraction of chenodeoxycholic acid from duck bile paste by calcium salt method[J]. Journal of Applied Chemistry，2018（4）：1-6.

[22]張?飛，趙靜國，趙蒙浩. 鵝去氧膽酸與熊去氧膽酸的合成工藝研究[J]. 化學(xué)與生物工程，2014，31（1）：47-50.

[23]Tonin F，Arends I W. Latest development in the synthesis of ursodeoxycholic acid （UDCA）：a critical review[J]. Beilstein Journal of Organic Chemistry，2018，14（1）：470-483.

[24]Ferrari M，Zinetti F. Process for preparing high purity ursodeoxycholic acid：US9206220[P]. 2015-12-08.

[25]He X L，Wang L T，Gu X Z，et al. A facile synthesis of ursodeoxycholic acid and obeticholic acid from cholic acid[J]. Steroids，2018，140：173-178.

[26]王鐘麟，姜立中，周維善. 豬去氧膽酸化學(xué)-Ⅳ從豬去氧膽酸立體選擇性合成熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的新法[J]. 中國科學(xué)，1991，21（7）：660-665.

[27]竇?倩，閆?鵬，劉志玲，等. 熊去氧膽酸的合成[J]. 化學(xué)通報，2018，81（8）：720-726.

[28]盧茂芳，尹偉成，王福東，等. 熊去氧膽酸的合成工藝改進(jìn)[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2015，46（10）：1058-1059.

[29]韓興春，卓?超，吳達(dá)俊. Wittig反應(yīng)在天然產(chǎn)物合成中的應(yīng)用[J]. 合成化學(xué)，2001，9（3）：199-207.

[30]Eggert T，Bakonyi D，Hummel W. Enzymatic routes for the synthesis of ursodeoxycholic acid[J]. Journal of Biotechnology，2014，191：11-21.

[31]Xuan Z，F(xiàn)an D D，Hua X F，et al. Large-scale production of ursodeoxycholic acid from chenodeoxycholic acid by engineering 7α- and 7β-hydroxysteroid dehydrogenase[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering，2019，42（9）：1537-1545.

[32]Sharma K R. Review：bile acid analysis[J]. PharmaInter Science Publishers，2012，3（2）：28-34.

[33]劉永貴，袁?琪. 蛇膽的成分分析及臨床應(yīng)用[J]. 湖北中醫(yī)雜志，2017，39（3）：54-55.

[34]趙啟苗，單國順，陳江寧，等. 膽南星質(zhì)量評價方法初探[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志，2017，23（6）：28-31.

[35]李文龍，劉紹勇，薛東升，等. 近紅外漫反射光譜法快速測定熊膽粉提取物中熊去氧膽酸和鵝去氧膽酸的含量[J]. 中國藥學(xué)雜志，2010，45（19）：1500-1503.

[36]Li W L，Cheng Z W，Qu H B. Monitoring of the hydrolysis process of bear bile powder using near infrared spectroscopy and chemometrics[J]. Measurement，2016，88：18-26.

[37]佟愛東，勞瑞珍，李思源. 薄層色譜法檢查熊去氧膽酸的有關(guān)物質(zhì)[J]. 藥物分析雜志，2012，32（9）：1654-1657.

[38]陳?蓉，陳?偉，顧炳仁. TLCS同時測定珠黃散中4種膽汁酸含量[J]. 中國執(zhí)業(yè)藥師，2016，13（7）：7-11.

[39]范艷美，賈夢杰，劉培培，等. 豬膽粉中豬去氧膽酸的提取、鑒定和含量測定[J]. 廣州化工，2017，45（15）：148-150.

[40]Matsuoka K，Atsushi Y. Study on micelle formation of bile salt using nuclear magnetic resonance spectroscopy[J]. Journal of Oleo Science，2017，66（10）：1129-1137.

[41]劉?雙，汪鋼強(qiáng)，劉張坤，等. 由豬去氧膽酸合成異熊去氧膽酸的新方法[J]. 有機(jī)化學(xué)，2013，33（10）：2216-2219.

[42]Mostafa A K，Mansour F R. Simultaneous determination of ursodeoxycholic acid and chenodeoxycholic acid in pharmaceutical dosage form by HPLC-UV detection[J]. Journal of AOAC International，2017，100（1）：59-64.

[43]Wang N，F(xiàn)eng Y B，Tang N X，et al. Chemical and biological analysis of active free and conjugated bile acids in animal bile using HPLC-ELSD and MTT methods[J]. Experimental and Therapeutic Medicine，2011，2（1）：125-130.

[44]高?旭，張?靜. HPLC-MS/MS法測定不同產(chǎn)地牛黃中膽汁酸成分[J]. 食品工業(yè)，2019，40（3）：181-184.

[45]Jones R D，Lopez A M，Ernest Y T，et al. Impact of physiological levels of chenodeoxycholic acid supplementation on intestinal and hepatic bile acid and cholesterol metabolism in Cyp7a1-deficient mice[J]. Steroids，2015，93：87-95.

[46]魏?松. 鵝去氧膽酸治療膽石癥的療效分析[J]. 中國民族民間醫(yī)藥，2013，22（12）：121.

[47]趙紅霞. 鵝去氧膽酸的提純及其免疫、鎮(zhèn)咳、化痰、平喘作用研究[D]. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2002：23.

[48]錢桂敏，齊莉莉，范哲于. 鵝去氧膽酸對大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)及腸道功能的影響[J]. 核農(nóng)學(xué)報，2018，32（11）：2267-2273.

[49]Shi H J，Ying L，Bo W，et al. Protoscolicidal effects of chenodeoxycholic acid on protoscoleces of Echinococcus granulosus[J]. Experimental Parasitology，2016，167：76-82.

[50]王守開，孫克誠，張?樂，等. 鵝去氧膽酸調(diào)控Nrf2通路緩解熱應(yīng)激小鼠肝臟損傷的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2019（4）：117-120.

[51]Fiorucci S，Distrutti E. Chenodeoxycholic acid：an update on its therapeutic applications[J]. Handb Exp Pharmacol，2019，256：265-282.

[52]Zhang Y J，Jiang R Q，Zheng X J，et al. Ursodeoxycholic acid accelerates bile acid enterohepatic circulation[J]. British Journal of Pharmacology，2019，176（16）：2848-2863.

[53]劉?彤，李?楠，李?棟，等. 消石利膽膠囊聯(lián)合熊去氧膽酸治療膽囊結(jié)石臨床研究[J]. 中國藥業(yè)，2019，28（8）：30-32.

[54]張?瑩，王?紅. 熊去氧膽酸與地塞米松聯(lián)合應(yīng)用對重度妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥患者的臨床治療效果、血清SIRT1/NF-κB p65信號通路及炎癥因子的影響[J]. 中國婦幼保健，2019，34（14）：3216-3220.

[55]何?濤，石曉東. 熊去氧膽酸治療非酒精性脂肪肝的臨床價值分析[J]. 中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育，2018，33（10）：130-132.