程皖燕,王紅娟,陳 歡,付亞寧,王 安,劉 勇,侯宏衛(wèi),胡清源*
1. 安徽大學(xué)物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院,合肥市經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)九龍路111 號(hào) 230601 2. 國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心,鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)翠竹街6 號(hào) 450001 3. 中國科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院,合肥市蜀山湖路350 號(hào) 230031
煙堿是一種具有較強(qiáng)致癮性的物質(zhì),存在于煙草制品中[1]。煙堿偏好與大腦內(nèi)獎(jiǎng)賞和決策等神經(jīng)生物學(xué)系統(tǒng)密不可分。煙氣能夠抑制免疫系統(tǒng)發(fā)揮作用,煙堿作為煙氣中的主要成分之一,可能通過中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響免疫系統(tǒng)[2]。然而,近些年的一些研究表明煙堿可能是一種具有抗炎作用的“消炎藥”,對(duì)膿血癥等炎癥疾病具有緩和作用[3]。但目前針對(duì)煙堿與神經(jīng)炎癥相關(guān)作用的研究還較少。
海馬組織是與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的標(biāo)志性腦區(qū)[4],分布了大量的小膠質(zhì)細(xì)胞,能夠?qū)χ袠猩窠?jīng)系統(tǒng)損傷做出反應(yīng),釋放大量細(xì)胞因子。有報(bào)道稱煙堿能夠通過激活免疫細(xì)胞上的α7 煙堿乙酰膽堿受體(Nicotinic acetylcholine receptor,nAChR)減少促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生,進(jìn)而改善神經(jīng)退行性疾病的認(rèn)知功能,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[5-6]。細(xì)胞因子是一種主要由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞分泌并具有廣泛生物活性的小分子蛋白質(zhì)[7],主要包括白細(xì)胞介素、趨化因子和其他與炎癥反應(yīng)相關(guān)的細(xì)胞因子等。其中白細(xì)胞介素類細(xì)胞因子在傳遞信息、激活與調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其中,白細(xì)胞介素(Interleukin,IL)-1α、IL-5、IL-6、IL-10 和IL-18 水平與煙堿攝入密切相關(guān),有文獻(xiàn)報(bào)道稱吸入煙堿會(huì)導(dǎo)致肺部IL-1αmRNA 水平上調(diào)[8],刺激人內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)IL-6[9],或者抑制過敏原誘導(dǎo)的肺部IL-5 水平升高[10]等。趨化因子是一類能夠介導(dǎo)神經(jīng)炎癥并且在神經(jīng)系統(tǒng)生理學(xué)包括神經(jīng)元遷移、細(xì)胞增殖以及突觸活動(dòng)中發(fā)揮重要作用的細(xì)胞因子,其中生長相關(guān)癌基因/角細(xì)胞趨化(Growth-related oncogene/keratinocyte chemoattractant,GRO/KC)、巨噬細(xì)胞炎性蛋白(Macrophage inflammatory protein,MIP)-1α和受激活調(diào)節(jié)正常T 細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(Regulated upon activation normal T cell expressed and secreted factor,RANTES)是3 種較為常見的趨化因子,文獻(xiàn)報(bào)道機(jī)體炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致這3 種趨化因子水平顯著升高(p<0.05)[11-13]。此外,腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α)在炎性反應(yīng)和免疫應(yīng)答中也發(fā)揮了重要作用[14-15]。條件位置偏好(Conditioned place preference,CPP)是藥物研究中廣泛使用的動(dòng)物嗜好性評(píng)價(jià)模型,目前建立CPP獲得模型的煙堿劑量主要在0.06~0.80 mg/kg 范圍內(nèi)。為全面探究煙堿對(duì)神經(jīng)炎癥的作用,本研究中采用文獻(xiàn)范圍內(nèi)低和較高的煙堿劑量即0.2 和0.6 mg/kg 分別構(gòu)建了大鼠CPP 獲得、消退和重建模型,應(yīng)用Bio-Plex 懸液芯片技術(shù)考察了兩種煙堿劑量下不同給藥階段大鼠海馬組織中23 種炎癥相關(guān)細(xì)胞因子水平的變化,旨在為研究物質(zhì)偏好不同階段神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞因子表達(dá)變化提供方法參考。
大鼠[SPF 級(jí),鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,許可證號(hào):SCXK(豫)2015-0004]。
煙堿(國家煙草質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心提供);生理鹽水(河南科倫藥業(yè)有限公司);水合氯醛(揚(yáng)州奧鑫助劑公司);Western 及IP 細(xì)胞裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo 公司);23 種細(xì)胞因子檢測試劑盒(美國Bio-Rad 公司),23 個(gè)細(xì)胞因子分別為粒細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor,G-CSF),粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor,
GM-CSF),GRO/KC,干擾素g(Interferon gamma,IFN-g),IL-1α,IL-1β,IL-2,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-10,IL-12p70,IL-13,IL-17A,IL-18,單核細(xì)胞趨化 蛋 白 1(Monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1),巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Macrophage colony-stimulating factor,M-CSF),MIP-1α,MIP-3α,RANTES,TNF-α,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)。
RD1111-CPP 裝置(上海多毅實(shí)業(yè)有限公司,合格證號(hào):DOiTCPP20160226004);JXFSTPRP-48組織研磨儀(上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司);3-30K 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國Sigma 公司);ULT2586-6-W48 冰箱(-80 ℃,美國Thermo 公司);SpectraMax?M5 多功能酶標(biāo)儀(美 國Molecular Devices 公司);Bio-Plex 200 蛋白質(zhì)懸液芯片機(jī)(美國Bio-Rad 公司)。
1.2.1 大鼠煙堿CPP 獲得、消退和重建模型的建立
(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇:選擇約7 周齡,體質(zhì)量為(200±20)g 的SD 雄性大鼠,實(shí)驗(yàn)開始前進(jìn)行為期5 d 的CPP 基準(zhǔn)值測試,根據(jù)測試結(jié)果剔除在白箱中停留時(shí)間超過在黑箱、白箱和中間箱中停留總時(shí)間50%及不足10%的大鼠。
(2)CPP 獲得階段:篩選大鼠并隨機(jī)分為4 組,3 組實(shí)驗(yàn)組共18 只,1 組對(duì)照組共6 只。以皮下注射的方式對(duì)大鼠進(jìn)行給藥,對(duì)實(shí)驗(yàn)組在奇數(shù)日給煙堿,在偶數(shù)日給生理鹽水;對(duì)對(duì)照組均注射生理鹽水,每兩天為一個(gè)給藥周期。在較長時(shí)間的煙堿作用下即第7 次給藥周期后成功構(gòu)建大鼠煙堿CPP 獲得模型,第7 次測試后從實(shí)驗(yàn)組中隨機(jī)選6只大鼠,處死并取出海馬組織于-80 ℃保存。
(3)CPP 消退階段:每天對(duì)實(shí)驗(yàn)組剩余大鼠和對(duì)照組大鼠僅注射生理鹽水。戒斷4 d 后實(shí)驗(yàn)組大鼠的煙堿偏好消除,第4 天測試后從實(shí)驗(yàn)組剩余大鼠中隨機(jī)選6 只大鼠,處死并取出海馬組織于-80 ℃保存。
(4)CPP 重建階段:對(duì)剩余實(shí)驗(yàn)組大鼠注射煙堿,次日注射生理鹽水,仍以2 d 為一個(gè)給藥周期,對(duì)照組則每天只注射生理鹽水。僅3 次給藥周期即相對(duì)短時(shí)間的煙堿作用后將剩余大鼠處死,并取出海馬組織于-80 ℃保存。
1.2.2 海馬組織總蛋白提取
向海馬組織中加入組織裂解液,用組織勻漿機(jī)將組織打碎,4 ℃條件下放置0.5~1.0 h,離心7 min(10 000 r/min,4 ℃),吸取上清液,于-80 ℃保存。
1.2.3 蛋白濃度測定
使用PierceTMBCA Protein Assay Kit 測定蛋白濃度[16]。
1.2.4 樣品檢測
將已處理的蛋白樣本從-80 ℃冰箱中取出,用樣品稀釋液將蛋白樣品稀釋8倍。應(yīng)用蛋白懸液芯片檢測煙堿給藥不同階段23種細(xì)胞因子的水平[17]。
1.2.5 數(shù)據(jù)處理
通過IBM SPSS Statistics 21 軟件分別對(duì)0.2 和0.6 mg/kg 煙堿劑量下CPP 獲得、消退和重建階段23 種細(xì)胞因子的表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析(One-way analysis of variance,ANOVA),p<0.05 表示組間具有顯著性差異。采用Graphpad prism 6 軟件展示不同階段存在顯著差異的細(xì)胞因子水平的變化趨勢。
以0.2 和0.6 mg/kg 煙堿劑量分別成功構(gòu)建大鼠CPP 獲得、消退和重建模型,通過Bio-Plex 懸液芯片技術(shù)對(duì)兩種煙堿劑量下生理鹽水對(duì)照組,以及CPP 獲得、消退和重建共4 組大鼠海馬中23 種細(xì)胞因子水平同時(shí)進(jìn)行了檢測。檢測結(jié)果顯示:IL-4、MIP-3α、G-CSF 和VEGF 這4 種細(xì)胞因子的水平低于最低檢測限,其他19 種細(xì)胞因子的檢測結(jié)果如表1 所示。通過對(duì)生理鹽水對(duì)照組,以及CPP 獲得、消退和重建組大鼠海馬中19 種細(xì)胞因子的表達(dá)量進(jìn)行ANOVA 分析,發(fā)現(xiàn)任意兩組間IL-1β、IL-2、IL-7、IL-12p70、IL-13、IL-17A、MCP-1、M-CSF、GM-CSF 和IFN-g 共10 種細(xì)胞因子水平均無顯著差異(p>0.05),不同組間IL-1α、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18、GRO/KC、MIP-1α、RANTES 和TNF-α共9 種細(xì)胞因子有顯著差異(p<0.05)。將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與文獻(xiàn)中有報(bào)道的細(xì)胞因子水平進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)報(bào)道生理鹽水處理組大鼠海馬中IL-1α、IL-6 和IL-18 水平分別在30、500 和3 500 pg/mL 左右[18],未經(jīng)任何處理大鼠海馬中IL-1β和TNF-α水平分別在60 和400 pg/mL 左右[19],與本實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果基本一致。
9 種有顯著差異表達(dá)的細(xì)胞因子主要包括白細(xì)胞介素、趨化因子和其他細(xì)胞因子,以下分別將0.2 和0.6 mg/kg 煙堿劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段9 種細(xì)胞因子的表達(dá)量進(jìn)行分類分析。
2.2.1 白細(xì)胞介素
圖1 所示分別為兩種煙堿給藥劑量下,5 種有顯著差異表達(dá)的白細(xì)胞介素在煙堿偏好模型不同階段的變化趨勢。其中圖1a~圖1e 分別表示白細(xì)胞介素IL-1α、IL-5、IL-6、IL-10、IL-18 的變化趨勢。
如圖1a 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段IL-1α水平分別有升高、下降和升高的變化趨勢,其中消退和重建階段IL-1α水平均顯著低于獲得組(p<0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段IL-1α水平分別有升高、下降和持續(xù)下降的變化趨勢,其中重建組IL-1α水平顯著低于獲得組(p<0.05)。根據(jù)文獻(xiàn)[20]報(bào)道,IL-1α具有神經(jīng)保護(hù)作用,在10、25 和50 ng/mL 的IL-1α作用下,小鼠胚胎皮層細(xì)胞存活率顯著升高(p<0.05)。在本研究中的煙堿給藥劑量下,煙堿能夠促進(jìn)IL-1α的表達(dá),在一定程度上可能具有神經(jīng)保護(hù)作用,但在戒斷后該作用消失。此外,在低煙堿劑量下重建煙堿嗜好模型,可以恢復(fù)煙堿對(duì)IL-1α表達(dá)的促進(jìn)作用;而較高劑量下重建煙堿嗜好模型,不可逆轉(zhuǎn)戒斷對(duì)IL-1α水平的影響。
表1 煙堿偏好模型不同階段19 種細(xì)胞因子的表達(dá)量(±s)Tab.1 Expression of 19 cytokines at different stages of nicotine preference model
表1 煙堿偏好模型不同階段19 種細(xì)胞因子的表達(dá)量(±s)Tab.1 Expression of 19 cytokines at different stages of nicotine preference model
0.2 mg·kg-1 0.6 mg·kg-1對(duì)照組16.35±3.58 51.84±2.21 726.13±423.22 28.62±5.03 3 446.33±170.40 30.30±13.21 13.21±2.34 34.29±8.55 461.47±16.70 604.63±516.61 44.37±38.78 73.27±30.91 28.17±17.26 91.04±131.99 65.99±31.90 51.44±37.70 2.94±0.81 12.92±8.75 120.53±58.52 IL-1α IL-5 IL-6 IL-10 IL-18 GRO/KC MIP-1α RANTES TNF-α IL-2 IL-1β IL-17A IL-7 IL-12p70 IL-13 MCP-1 M-CSF GM-CSF IFN-g獲得21.02±7.27 52.69±2.21 664.58±217.58 33.80±13.83 3 323.29±149.14 16.71±6.68 15.38±6.28 26.17±6.88 449.87±34.22 441.60±187.30 39.21±58.15 52.82±10.84 25.15±6.14 36.88±45.89 68.43±63.11 38.08±24.56 3.58±1.72 6.78±4.55 93.68±11.32消退15.03±3.63 54.26±0.98 624.10±161.95 35.05±10.42 3 259.92±163.24 23.22±12.22 9.89±4.12 28.72±7.23 460.17±49.22 438.10±145.02 21.91±24.73 69.09±11.99 22.52±9.19 81.66±45.77 65.86±9.83 39.30±33.97 1.61±2.07 8.13±3.32 89.61±12.68重建15.58±1.53 52.64±1.57 621.79±94.02 37.48±10.38 3 359.65±118.30 17.26±12.25 12.80±1.55 23.55±4.48 514.06±72.17 450.53±228.29 12.04±22.81 57.33±6.508 18.85±7.25 41.13±24.50 67.39±14.22 33.71±27.52 1.19±1.37 5.55±6.01 94.13±15.05獲得19.25±2.36 54.54±2.22 667.99±102.68 33.89±7.49 3 319.87±124.87 14.46±7.20 14.76±3.51 33.58±5.95 489.72±71.56 497.55±191.99 55.88±31.52 71.29±17.45 26.84±8.88 92.20±49.82 87.52±15.15 34.79±40.42 4.66±1.49 11.93±4.98 100.18±15.70消退17.12±1.85 53.35±2.07 600.57±261.49 36.84±6.61 3 376.23±202.28 18.76±10.69 12.98±3.16 30.67±3.66 473.02±46.93 504.23±242.45 67.46±29.62 79.85±15.66 27.76±4.70 83.92±32.41 79.18±30.13 46.01±33.50 2.29±1.345 12.00±5.62 93.01±13.36重建14.74±2.64 51.45±3.61 518.26±120.80 27.90±6.40 3 366.43±81.74 14.30±3.26 11.10±2.63 24.91±4.824 452.92±35.06 369.99±90.63 19.67±22.26 58.59±9.80 20.51±5.13 53.19±15.01 66.35±17.37 16.79±28.17 2.15±1.873 8.09±3.19 92.79±9.30
圖1 煙堿偏好模型不同階段5 種白細(xì)胞介素水平變化Fig.1 Variations of five interleukins’levels at different stages of nicotine preference model
如圖1b 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段IL-5 水平分別有升高、持續(xù)升高和下降的變化趨勢,其中,消退階段IL-5 水平顯著高于對(duì)照組(p<0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段的IL-5 水平均與對(duì)照組無顯著差異(p>0.05)。IL-5 是調(diào)節(jié)造血細(xì)胞產(chǎn)生及活性的細(xì)胞因子,IL-5 的生物學(xué)活性在機(jī)體穩(wěn)態(tài)條件下作用不大,而在緊急造血和免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用,通常在感染和免疫過程中大量產(chǎn)生[21],Tilp 等[10]證實(shí)過敏原能夠誘導(dǎo)肺部中IL-5 的水平升高。目前針對(duì)IL-5 的研究集中于一些以嗜酸性粒細(xì)胞為主要免疫效應(yīng)細(xì)胞的疾病中,主要考察其在支氣管中水平的變化,在腦部的研究較少。從本研究中可以發(fā)現(xiàn),低和較高劑量煙堿攝入均不會(huì)誘導(dǎo)IL-5的過表達(dá),大鼠海馬組織未產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。此外,在低劑量煙堿下,戒斷會(huì)影響海馬組織區(qū)穩(wěn)態(tài),引起IL-5 水平升高,可以通過再次給煙堿恢復(fù)。
如圖1c 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段IL-6 水平分別有下降、持續(xù)下降和不變的趨勢,其中,消退階段IL-6 水平顯著低于對(duì)照組(p<0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段IL-6 水平持續(xù)保持下降,且消退和重建階段IL-6 水平均顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。IL-6 是一種兼促炎和抗炎雙重作用的細(xì)胞因子[22],在慢性炎性疾病中,IL-6 主要發(fā)揮促炎作用。Bao 等[23]研究表明煙堿能夠抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的促炎因子IL-6 的表達(dá),從而發(fā)揮抗炎作用。還有研究表明,海馬組織中神經(jīng)元的壞死與腦脊液中IL-6 水平上升有關(guān)[24],煙堿能夠通過抑制促炎因子IL-6 的表達(dá)發(fā)揮心肌保護(hù)作用[25]。本研究結(jié)果表明,低和較高劑量煙堿均不會(huì)誘導(dǎo)大鼠海馬中IL-6 的表達(dá)升高而產(chǎn)生炎癥反應(yīng);相反,在煙堿偏好模型的不同階段,IL-6 的表達(dá)量均有不同程度的下降趨勢,提示煙堿可能通過抑制促炎因子IL-6 的表達(dá),從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
如圖1d 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段IL-10 水平有持續(xù)升高的趨勢,但與對(duì)照組相比均無顯著差異(p>0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段IL-6 水平分別有升高、持續(xù)升高和下降的趨勢,其中消退階段IL-10水平顯著高于對(duì)照組(p<0.05)。IL-10 是一種具有抗炎作用的細(xì)胞因子,主要是通過抑制巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞將抗原呈遞給T、B 淋巴細(xì)胞且抑制其產(chǎn)生促炎癥因子,減少過度和失控的炎癥效應(yīng)造成的組織損傷[26]。目前有研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)中IL-10 的表達(dá)增加,發(fā)揮抗炎作用,有助于大腦炎癥恢復(fù)[27],Li等[28]發(fā)現(xiàn)芒柄花黃素通過刺激大腦皮層中IL-10的表達(dá)抑制炎癥反應(yīng),發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。此外,IL-10 能夠通過平衡體內(nèi)促炎因子水平發(fā)揮抗炎作用[23]。本研究中發(fā)現(xiàn)低和較高劑量煙堿能夠促進(jìn)IL-10 的表達(dá),在一定程度上可能具有神經(jīng)保護(hù)作用,在較高劑量下,戒斷后可能引起機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)過表達(dá)IL-10;隨后繼續(xù)給煙堿,應(yīng)激反應(yīng)消失,IL-10 水平恢復(fù),與對(duì)照組無顯著差異(p>0.05)。
如圖1e 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段IL-18 水平分別有下降、持續(xù)下降和升高的變化趨勢,其中消退階段IL-18 水平顯著低于對(duì)照組(p<0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段IL-18 水平分別有下降、升高和下降的變化趨勢,每一階段IL-18 水平均與對(duì)照組無顯著差異(p>0.05)。IL-18 是一種促炎癥細(xì)胞因子,有研究表明100 ng/mL IL-18 能夠有效抑制海馬組織的長時(shí)程增強(qiáng)(Long-term potentiation,LTP),對(duì)學(xué)習(xí)和記憶形成產(chǎn)生影響[29]。Bossù等[30]報(bào)道LPS通過促進(jìn)海馬組織中IL-18 的過表達(dá),抑制神經(jīng)元細(xì)胞的分化或誘導(dǎo)其死亡,引起持續(xù)性認(rèn)知障礙,針對(duì)阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease,AD)的研究表明1 和10 μmol/L 煙堿均能顯著增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞的活力,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[31]。此外,抑制IL-18的表達(dá)可抑制全身性炎癥反應(yīng)[32]。本研究結(jié)果表明,低和較高劑量煙堿能夠抑制IL-18 的表達(dá),在一定程度上可能具有神經(jīng)保護(hù)作用;此外,低劑量下戒斷后可能會(huì)產(chǎn)生代償性適應(yīng),引起大鼠海馬中IL-18 水平持續(xù)下調(diào),并隨著煙堿的再攝入而消失。
2.2.2 趨化因子
圖2 所示分別為兩種煙堿給藥劑量下,3 種有顯著差異表達(dá)的趨化因子在煙堿偏好模型不同階段的變化趨勢。其中圖2a~圖2c 分別表示趨化因子GRO/KC、MIP-1α和RANTES 的變化趨勢。
如圖2a 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段GRO/KC 水平分別有下降、升高和下降的變化趨勢;在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3個(gè)階段GRO/KC 水平變化趨勢同0.2 mg/kg 劑量,并且趨勢更為明顯,每一階段GRO/KC 水平均顯著低于對(duì)照組(p<0.05)。GRO/KC 作為促炎癥因子,參與多種炎癥類疾病發(fā)生,背根神經(jīng)節(jié)局部發(fā)生炎癥會(huì)導(dǎo)致GRO/KC 的表達(dá)大幅度上調(diào)[33]。Smith 等[34]表明LPS 能夠促進(jìn)大鼠肺泡灌洗液中GRO/KC 的表達(dá)。此外,GRO/KC 與人體中IL-18的作用相似,有研究中將煙堿和LPS 共同作用于人的氣道上皮細(xì)胞系HBE16 細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)煙堿能顯著減少LPS 誘導(dǎo)的IL-18 蛋白的表達(dá)(p<0.05),具有一定的抗炎功能[35]。本研究中發(fā)現(xiàn)低和較高劑量煙堿均可能通過抑制炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的GRO/KC水平的升高發(fā)揮抗炎作用,戒斷后抑制作用減弱,并且可通過再次給煙堿而恢復(fù);較高劑量煙堿構(gòu)建模型時(shí),該作用比低劑量煙堿構(gòu)建模型時(shí)更為明顯。
圖2 煙堿偏好模型不同階段3 種趨化因子水平變化Fig.2 Variations of three chemokines’levels at different stages of nicotine preference model
如圖2b 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段MIP-1α水平分別有升高、下降和升高的變化趨勢,其中消退和重建階段MIP-1α水平均顯著低于獲得階段(p<0.05),重建階段MIP-1α水平顯著高于消退階段(p<0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段MIP-1α水平分別有升高、下降和持續(xù)下降的變化趨勢,且重建階段MIP-1α水平顯著低于獲得階段(p<0.05)。MIP-1α作為一種與免疫細(xì)胞緊密聯(lián)系的細(xì)胞因子,多被用于阿爾茲海默癥[36]和關(guān)節(jié)炎等炎癥類疾病發(fā)生機(jī)制的研究中[37]。有研究表明長期飲酒會(huì)引起紋狀體中MIP-1α水平顯著升高(p<0.05),戒斷24 h 后仍顯著高于對(duì)照組(p<0.05),酒精能夠持續(xù)影響紋狀體中MIP-1α的水平,并指出戒斷過程產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)是造成MIP-1α升高的主要原因[38]。在本研究結(jié)果中,低和較高劑量煙堿不會(huì)誘導(dǎo)海馬組織中MIP-1α的過表達(dá),戒斷后MIP-1α水平相較于獲得組未持續(xù)上升反而下降,可能是由于戒斷時(shí)間較長(>24 h)引起的;此外,在低劑量下消退過程中MIP-1α水平的降低可通過再次給煙堿而恢復(fù),在較高劑量作用下戒斷對(duì)MIP-1α水平的影響不可逆。
如圖2c 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段RANTES 水平分別有下降、升高和下降的變化趨勢,每一階段RANTES 水平均與對(duì)照組無顯著差異(p>0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段RANTES 水平持續(xù)保持下降,其中重建組RANTES 水平相比于對(duì)照組和獲得組分別下降了27%和25%(p<0.05)。大量研究表明,RANTES 表達(dá)的上調(diào)與多種炎癥疾病相關(guān),其中相比于健康對(duì)照組,2 型糖尿病患者血清中RANTES 水平升高[39]。Tripathy 等[13]報(bào) 道 相 比于健康對(duì)照組,AD 患者腦微血管中RANTES 的表達(dá)上調(diào),LPS 能夠誘導(dǎo)RNATES 的表達(dá)。本研究結(jié)果表明,低和較高劑量下,煙堿能夠抑制RANTES 的表達(dá),機(jī)體處于穩(wěn)態(tài),可能具有神經(jīng)保護(hù)作用;在低劑量下,戒斷后RANTES 水平的升高可通過再次給煙堿恢復(fù);在較高劑量下,戒斷后RANTES 表達(dá)受到抑制,且這種抑制作用具有持續(xù)性,不能通過短期內(nèi)再次給煙堿而扭轉(zhuǎn)。
2.2.3 TNF-α
如圖3 所示,在0.2 mg/kg 給藥劑量下,CPP 獲得、消退和重建階段TNF-α水平分別有下降、升高和持續(xù)升高的變化趨勢,其中重建階段TNF-α水平顯著高于獲得階段(p<0.05);在0.6 mg/kg 給藥劑量下,3 個(gè)階段TNF-α水平分別有升高、下降和持續(xù)下降的變化趨勢,但與對(duì)照組均無顯著差異(p>0.05)。TNF-α具有雙重作用:一方面在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、機(jī)體生理功能和抗感染等方面發(fā)揮重要作用,另一方面若持續(xù)釋放或產(chǎn)生過多時(shí)則會(huì)引起發(fā)熱休克等[15]。Mihara 等[40]表示LPS 能夠誘導(dǎo)大鼠腸間皮細(xì)胞中TNF-αmRNA 水平的升高。本研究結(jié)果表明,低和較高劑量煙堿不會(huì)誘導(dǎo)大鼠海馬中TNF-α的過表達(dá),機(jī)體處于穩(wěn)態(tài);此外,在低和較高劑量下TNF-α的變化趨勢相反,低劑量下重建階段TNF-α水平顯著升高(p<0.05)。這可能是由于重建組大鼠煙堿暴露時(shí)間較短,急性煙堿給藥可能導(dǎo)致TNF-α水平上調(diào)。
圖3 煙堿模型不同階段TNF-α水平的變化Fig.3 Variations of TNF-α level at different stages of nicotine preference model
①應(yīng)用懸液芯片技術(shù)同時(shí)檢測了煙堿偏好模型不同階段大鼠海馬組織中23 種炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子水平,其中9 種細(xì)胞因子水平有顯著差異(p<0.05),包括5 種白細(xì)胞介素,3 種趨化因子和TNF-α;②在低和較高劑量下,煙堿能夠促進(jìn)IL-1α和IL-10 的 表 達(dá),抑 制IL-6、IL-18、GRO/KC 和RANTES 的表達(dá);③大鼠海馬組織中GRO/KC 水平易受煙堿影響,單一煙堿作用會(huì)降低促炎癥因子GRO/KC 的表達(dá),在獲得-消退階段該降低作用減弱,在消退-重建階段該降低作用再次恢復(fù)至獲得階段,該細(xì)胞因子可能參與了煙堿的潛在抗炎作用機(jī)制。