不同產(chǎn)地野生蘄艾的桉油精和蘆丁含量比較

董元火，曾長立，許國權(quán)，廖新安，張洪干，張文才，夏恒建，王圣軍，彭仕梅，郭雙喜

（1.江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院／湖北省漢江流域特色生物資源保護(hù)開發(fā)與利用工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056；2.湖北省蘄春縣科學(xué)技術(shù)和經(jīng)濟(jì)信息局，湖北 蘄春 435399；3.李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，湖北 蘄春 435399；4.蘄春縣中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心，湖北 蘄春 435399）

種質(zhì)資源作為生物資源的重要組成部分，是培育作物和中藥材優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是維系國家食物和藥品安全的重要保證［1］。藥用種質(zhì)資源是中藥材生產(chǎn)的源頭，種質(zhì)的優(yōu)劣對中藥材產(chǎn)量和質(zhì)量有決定性作用［1］。因此，如何從藥材生產(chǎn)的源頭抓起，通過藥用植物種質(zhì)資源研究提高中藥材質(zhì)量是一個(gè)迫切需要解決的問題。

艾（Artemisia argyi Levl.et Vant.），又名艾蒿、灸草，為菊科篙屬多年生草本植物，廣布于中國、蒙古、日本和朝鮮等國家，以湖北蘄春產(chǎn)為佳，謂之“蘄艾”［2］。蘄艾是國家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品，“蘄春四寶”之一［3］。艾（蘄艾）是《湖北省農(nóng)業(yè)發(fā)展“十三五”規(guī)劃綱要》打造的兩個(gè)省級(jí)核心大品牌之一。黃岡市政府《關(guān)于加快發(fā)展蘄艾產(chǎn)業(yè)的意見（2018）》明確提出黃岡市要打造100億蘄艾產(chǎn)業(yè)目標(biāo)。艾葉具有特殊香氣，味苦，性涼，具有顯著的平喘、鎮(zhèn)咳、祛痰、抗菌、抗過敏等作用［4］。艾葉含有揮發(fā)油、黃酮、有機(jī)酸和三萜類等多種化學(xué)成分［4］。桉油精、樟腦、龍腦、松油醇、石竹烯、側(cè)柏酮等為各產(chǎn)地艾葉揮發(fā)油的主要共有成分［5］。艾葉揮發(fā)油作為艾葉主要活性成分，已從中鑒定出近100個(gè)化學(xué)成分［6］。許俊潔等［7］從6個(gè)不同采收期蘄艾葉精油中初步鑒定了75種化合物，而桉油精是蘄艾揮發(fā)油含量較高的成分［7，8］。

艾（蘄艾）的前期研究主要涉及形態(tài)學(xué)、化學(xué)成分、藥理作用、臨床應(yīng)用、種植和生態(tài)學(xué)等方面［3-11］。近 年 來，一 些 學(xué) 者 利 用ITS2、rcbL、matK、psbA-trnH等DNA條形碼序列和葉綠體基因組高通量測序技術(shù)開展了艾草與菊科植物近緣種鑒定及系統(tǒng)關(guān)系和藥材的真?zhèn)畏治觯?2，13］。張英等［14］運(yùn)用DNA身份精準(zhǔn)鑒定技術(shù)多核苷酸多態(tài)性（MNP）標(biāo)記法開展對蘄艾的精準(zhǔn)鑒定，為準(zhǔn)確甄別蘄艾的真?zhèn)翁峁┝诵碌姆椒?。目前，關(guān)于蘄艾的研究多為栽培種，野生蘄艾的研究鮮有報(bào)道［9］。

本研究對分布于蘄春的野生蘄艾藥用有效成分桉油精和蘆丁含量進(jìn)行了測定，以期為野生蘄艾種質(zhì)資源保護(hù)和利用、新品種選育和藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

對分布于湖北省蘄春縣的野生蘄艾種質(zhì)資源開展野外調(diào)查，采用全球定位系統(tǒng)測定野生蘄艾種群所處經(jīng)緯度和海拔。記錄蘄艾種群棲息地的生境、分布特征和土壤類型。

在端午節(jié)前后，采集野外調(diào)查發(fā)現(xiàn)的不同產(chǎn)地蘄艾的葉片，曬干，除去雜質(zhì)，用于桉油精和蘆丁含量測定。

1.2 主要儀器與試劑

Agilent7890A氣相色譜儀，賽默飛U3000高效液相色譜儀，梅特勒AG285萬分之一電子天平，梅特勒AB265-S十萬分之一電子天平，金壇市科興儀器廠數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-4。

正己烷（分析純），甲醇（流動(dòng)相中用色譜純，供試品制備用分析純），桉油精對照品（批號(hào)：110788-201506；來源：中國食品藥品檢定研究院），蘆丁對照品（批號(hào)：100080-201409；來源：中國食品藥品檢定研究院）。

1.3 艾葉鑒別

取本品粉末2 g，加石油醚（60～90℃）25 mL，置水浴上加熱回流30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)诱和? mL使溶解，作為供試品溶液。另取艾葉對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)［15］，吸取上述兩種溶液各2～5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚（60～90℃）-甲苯-丙酮（10∶8∶0.5）為展開劑展開，取出，晾干，噴以1%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的主斑點(diǎn)［15］。

1.4 艾葉桉油精含量測定

按照《中國藥典》2015版（通則0521）氣相色譜法（GC），在李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司（湖北蘄春）測定艾葉桉油精含量［15］。

1.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以甲基硅橡膠（SE-30）為固定相，涂布濃度為10%；柱溫為110℃。理論板數(shù)按桉油精峰計(jì)算應(yīng)不低于1 000。

1.4.2 對照品溶液的制備 取桉油精對照品適量，精密稱定，加正己烷制成0.15 mg／mL的溶液，即得對照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 取本品艾葉粉末（過三號(hào)篩）約2.5 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入正己烷25 mL，稱定重量，加熱回流1 h，取出，放冷，再稱定重量，而后用正己烷補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

1.4.4 測定 精密吸取對照品與供試品溶液各2μL，注入氣相色譜儀，按通則0521氣相色譜法測定艾葉桉油精含量［15］。本品按干燥品計(jì)算，含桉油精不得少于0.050%［15］。

1.5 艾葉蘆丁含量的測定

按照《中國藥典》2015版（通則0512）高效液相色譜法（HPLC），以測定桑葉蘆丁含量的方法為參照［15］，在李時(shí)珍醫(yī)藥集團(tuán)有限公司（湖北蘄春）對艾葉蘆丁含量進(jìn)行測定。

1.5.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇為流動(dòng)相A，以0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相B，按表1進(jìn)行梯度洗脫，檢測波長為358 nm。理論板數(shù)按蘆丁峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000。

1.5.2 對照品溶液的制備 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含蘆丁0.1 mg的溶液，即得對照品溶液。

1.5.3 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號(hào)篩）約1 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加甲醇50 mL，加熱回流30 min，濾過，濾渣再用甲醇50 mL同法提取2次，合并濾液。減壓回收溶劑，殘?jiān)眉状既芙?，轉(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

表1 流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的梯度洗脫

1.5.4 測定 精密吸取對照品與供試品溶液各10μL，注入液相色譜儀，按通則0512高效液相色譜法測定艾葉蘆丁含量［15］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地野生蘄艾的生境及分布特征

本次調(diào)查在湖北省蘄春縣的赤龍湖、翁塹村、九棵松村和清水河村發(fā)現(xiàn)了4個(gè)野生蘄艾種群，多散生或塊狀分布于居民屋前后及田堤邊、山邊和溝渠邊（表2）。

表2 蘄春縣不同產(chǎn)地野生蘄艾的生境及分布特征

2.2 不同產(chǎn)地野生蘄艾的桉油精含量

按艾葉干燥品計(jì)算，蘄春縣赤龍湖、九棵松村、翁塹村和清水河村4個(gè)產(chǎn)地的野生蘄艾桉油精含量在0.45%～0.73%之間（表3），存在差異性，平均值為0.59%。其中，赤龍湖蘄艾桉油精含量最高，翁塹村蘄艾桉油精含量最低。

2.3 不同產(chǎn)地野生蘄艾的蘆丁含量

按艾葉干燥品計(jì)算，蘄春縣4個(gè)產(chǎn)地的野生蘄艾蘆丁含量在0～0.0182%之間（表3），平均值為0.0103%，表明野生蘄艾蘆丁含量比較低。其中，清水河村的野生蘄艾蘆丁含量最高，翁塹村野生蘄艾中未檢出蘆丁。

表3 蘄春縣不同產(chǎn)地野生蘄艾的桉油精和蘆丁的含量 （%）

3 討論與結(jié)論

中國民間有端午采艾的習(xí)俗，2010年和2015年《中國藥典》中規(guī)定艾葉在夏季時(shí)采摘［15，16］。艾葉主要活性成分是艾葉揮發(fā)油［8］。許俊潔等［7］通過提取不同采收期蘄艾精油，發(fā)現(xiàn)6月蘄艾精油含量最高，表明6月為蘄艾的最佳采收期，符合2010年《中國藥典》的規(guī)定并論證了民間端午采艾的科學(xué)性［7］。因此，本研究選擇6月9日（端午節(jié)）至6月10日采摘野生蘄艾。

作為艾葉主要活性成分的艾葉揮發(fā)油，一直被視為評(píng)價(jià)其藥材質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)。各地艾葉中含量明顯較高且普遍含有的成分有桉油精、樟腦、龍腦、松油醇（包括α-松油醇和順式-β-松油醇）、側(cè)柏酮、氧化石竹烯等［5］。研究表明蘄艾揮發(fā)油含量較高的成分是桉油精［7，8］，桉油精含量是艾葉質(zhì)量控制的重要指標(biāo)之一［17］。因此，為了更好地評(píng)價(jià)野生蘄艾的種質(zhì)資源和品質(zhì)，本研究對發(fā)現(xiàn)的野生蘄艾開展了桉油精（C10H8O）含量的測定。2015年版《中國藥典》中規(guī)定，艾葉按干燥品計(jì)算，含桉油精不得少于0.050%［15］。本研究采用《中國藥典》2015版（通則0512）氣相色譜法（GC）測定了蘄春縣赤龍湖、九棵松村、翁塹村和清水河村4個(gè)產(chǎn)地野生蘄艾的桉油精含量，結(jié)果顯 示 在0.45% ～0.73% 之 間，平 均 值 為0.59%，高于《中國藥典》2015版規(guī)定的桉油精含量［15］；其中蘄春縣赤龍湖蘄艾桉油精含量最高，其藥材品質(zhì)最好。戴衛(wèi)波等［5］采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析3個(gè)產(chǎn)地栽培蘄艾的桉油精含量分別為16.97%、20.53% 和21.3912%。同樣采用GC-MS的方法，許俊潔等［7］報(bào)道源自湖北蘄春一世緣蘄艾制品有限公司提供的栽培蘄艾在6月份的桉油精含量為24.62%。林杰等［18］測定栽培蘄艾的桉油精含量高達(dá)25%。本研究測定的4個(gè)地方野生蘄艾桉油精含量都低于上述栽培蘄艾中的含量，其原因可能是GC-MS法較GC法測定的桉油精含量高，這有待于進(jìn)一步對同一地點(diǎn)的野生蘄艾開展兩種測定方法對比分析，因此還不能斷定野生蘄艾的品質(zhì)不如栽培蘄艾。

植物界中黃酮類化合物存在廣泛，黃酮類也是艾葉的主要化學(xué)成分之一［5，19］。目前，多以蘆丁或槲皮素作為艾葉中總黃酮含量測定的對照品［19，20］。本研究按照《中國藥典》2015版（通則0512）高效液相色譜法（HPLC），以測定桑葉蘆丁含量的方法為參照［15］，對蘄春縣赤龍湖、九棵松村、翁塹村和清水河村等4個(gè)產(chǎn)地的野生蘄艾蘆丁含量進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示野生蘄艾蘆丁含量在0～0.0182%之間，平均值為0.0103%，表明野生蘄艾蘆丁含量比較低。胡吉清等［19］發(fā)現(xiàn)芹菜素對照品溶液與供試品溶液有相同的最大吸收波長，首次用芹菜素作為對照品測得艾葉總黃酮含量。蘆丁、槲皮素和芹菜素都可作為對照標(biāo)樣用于測定艾葉總黃酮含量。