一株青枯菌拮抗細(xì)菌M26的篩選、鑒定及其發(fā)酵條件優(yōu)化

陳丹丹，李圓圓，齊素敏，冉新炎，韓廣泉，陶寧，王麗榮

（山東碧藍(lán)生物科技有限公司／泰安市植物微生態(tài)制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000）

番茄（Solanum lycopersicum L.）是管狀花目茄科番茄屬一年或多年生草本植物，為我國(guó)主要的蔬菜之一。番茄營(yíng)養(yǎng)豐富，其含有的番茄紅素具有抗氧化、清除自由基、延遲衰老和抗癌的功效［1］，具有很大的經(jīng)濟(jì)效益。隨著番茄種植面積的不斷擴(kuò)大，番茄青枯病也越來越嚴(yán)重。番茄青枯病是由青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）引起的一種常見的維管束系統(tǒng)性病害之一，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可造成植株死亡，導(dǎo)致番茄嚴(yán)重減產(chǎn)甚至絕收［2］。

利用生防菌防治番茄土傳病害是一種有應(yīng)用前景的防治措施［3］。芽孢桿菌（Bacillus）是一類研究較多的生防細(xì)菌，當(dāng)前用于防治青枯病的芽孢桿菌有解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）［4-6］、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［7，8］、短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）［9］、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）［10］、耐寒短桿芽孢桿菌（Brevibacterium frigoritolerans）［11］、特基拉芽孢桿菌（B.tequilensis）［11］、多 粘 芽 孢 桿 菌（Paenibacillus polymyxa）［12］等。美國(guó)迄今已有1個(gè)解淀粉芽孢桿菌FZB42和3個(gè)枯草芽孢桿菌GB03、MB1600、QST713獲得商品化生產(chǎn)許可［13］。

本試驗(yàn)篩選到一株抑制青枯雷爾氏菌的細(xì)菌M26，通過16S rRNA基因序列、形態(tài)學(xué)和生理生化特征分析，確定其為解淀粉芽孢桿菌，并對(duì)其發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為開發(fā)該菌株成為青枯病生防菌提供參考，同時(shí)豐富了防治青枯病的微生物資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株：青枯雷爾氏菌，購(gòu)買自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心；其他菌株由山東碧藍(lán)生物科技有限公司菌種保藏中心保存。

供試培養(yǎng)基：芽孢培養(yǎng)基（YB）：葡萄糖2 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g，氯化鈉5 g，水1 L，pH＝7.0，固體培養(yǎng)基（YA）加瓊脂粉15 g；青枯培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖5 g，酵母提取物0.2 g，牛肉提取物3 g，氯化鈉0.5 g，七水硫酸鎂1.5 g，水1 L，pH ＝7.0，固體培養(yǎng)基加瓊脂粉15 g和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）100μL；2%營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，水1 L，pH值為7.2～7.4，瓊脂粉20 g，1%NA培養(yǎng)基加瓊脂粉10 g。所有培養(yǎng)基121℃滅菌30 min備用。

主要試劑和儀器：葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、氯化鈉等，均為分析純?cè)噭?；天根?xì)菌基因組DNA提取試劑盒；PCR引物，由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司合成；HBI芽孢桿菌生化鑒定條，由青島海博生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；BIO-RAD PCR儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品（上海）有限公司；OLYMPUS CX31型顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；DYY-6C型電泳儀，北京市六一儀器廠；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；TANON-1600全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析系統(tǒng)，上海天能科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 拮抗菌的初篩 菌液的制備：將青枯菌接種于青枯液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r／min搖床培養(yǎng)48 h后備用；將保存的拮抗菌接種到Y(jié)B培養(yǎng)基中，37℃、180 r／min搖床培養(yǎng)24 h后備用。

初篩方法：采用平板孔擴(kuò)散法。底層為20 mL的2% NA培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后加入1 mL的青枯菌和5 mL的1% NA培養(yǎng)基搖勻，等液體干透后用打孔器（直徑9 mm）距離中心3 cm打4個(gè)孔，每孔中加100μL的生防菌液，每個(gè)處理重復(fù)3次，抑菌圈直徑按十字交叉法進(jìn)行測(cè)量。

1.2.2 拮抗菌的復(fù)篩 從初篩結(jié)果中選取抑菌效果比較好的菌株進(jìn)行復(fù)篩，方法如1.2.1，選出抑制效果最好的1株細(xì)菌。

1.2.3 拮抗菌的鑒定 利用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取拮抗菌DNA，使用細(xì)菌16S rRNA通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（50μL）：DNA模板2 μL，Mix 25μL，27F 1μL，1492R 1μL，ddH2O 21 μL。PCR擴(kuò)增程序：95℃4 min；94℃30 s，52℃80 s，72℃90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃8 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序后的拼接結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST相似序列檢索比對(duì)，采用MEGA 6.0軟件進(jìn)行多序列同源性分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

形態(tài)學(xué)和理化特征試驗(yàn)：將拮抗菌接種于YA培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面、凹凸度、透明度等，并進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色［14］，具體方法參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》［15］。

1.2.4 發(fā)酵條件優(yōu)化 （1）種子液制備：將復(fù)篩得到的拮抗菌接種至YB培養(yǎng)基中，37℃、180 r／min培養(yǎng)24 h待用。

（2）發(fā)酵條件優(yōu)化：按照1／15（V／V）的接種量接種于YB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，分別檢測(cè)不同溫度（25、30、35、45、55℃）、不同pH值（5、6、7、8、9）、不同NaCl含量（0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）、不同轉(zhuǎn)速（150、180、210 r／min）、不同裝載量（15%、25%、40%、50%）下600 nm的光密度值，每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件包單因素方差分析法（oneway ANOVA）中的Duncan’s多重比較檢驗(yàn)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和差異顯著性檢驗(yàn)（P＜0.05），利用Microsoft Excel 2010軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌的篩選

選取保存的40株菌進(jìn)行純化，編號(hào)為M1、M2、… 、M40。有5株細(xì)菌對(duì)青枯雷爾氏菌有較強(qiáng)的抑制作用，抑制結(jié)果如表1所示。其中菌株M26對(duì)青枯雷爾氏菌具有很強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑達(dá)14.34 mm，復(fù)篩平均抑菌圈直徑達(dá)15.22 mm。經(jīng)過連續(xù)多次試驗(yàn)后抑菌效果穩(wěn)定（圖1），所以對(duì)菌株M26進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 5株細(xì)菌對(duì)青枯雷爾氏菌的抑菌圈直徑 （mm）

2.2 M26菌株16S rRNA基因序列分析

電泳結(jié)果（圖2）顯示，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度在1 500 bp左右。測(cè)序結(jié)果顯示M26菌株16S rRNA基因的序列長(zhǎng)度為1 453 bp，與電泳結(jié)果一致。M26與Bacillus amyloliquefaciens strain BA31（MG548650）相似性達(dá)到99.79%。系統(tǒng)進(jìn)化樹也顯示M26與B.amyloliquefaciens strain BA31（MG548650）在同一系統(tǒng)分支上（圖3）。因此，初步鑒定M26為解淀粉芽孢桿菌。

圖1 M26菌株對(duì)青枯雷爾氏菌的抑制效果

圖2 M26菌株16S rRNA PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖譜

圖3 基于16S rRNA基因序列構(gòu)建的M26及相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 菌株M26的形態(tài)和生理生化特征

菌株M26在YA培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)24 h后，菌體呈桿狀，有莢膜和芽孢；菌落為乳白色，呈圓形，直徑在0.35～0.45 cm，表面有褶皺，中心部分凸起，邊緣為鋸齒狀，不透明，不產(chǎn)生色素。部分生理生化特征見表2，與B.amyloliquefaciens的生理生化特征［16，17］最為接近。

表2 M26菌株的生理生化特征

2.4 菌株M26的發(fā)酵條件優(yōu)化

由圖4可知，菌株M26在25～55℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，25℃和35℃的差異不顯著，但是在25℃時(shí)生長(zhǎng)最好（圖4 A）；在25℃條件下，M26在pH值5～9范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，在pH＝7下生長(zhǎng)最好（圖4 B）；在25℃、pH＝7條件下，M26在NaCl含量為0～2%的條件下均能生長(zhǎng)，0.5%NaCl含量下生長(zhǎng)最好（圖4 C）；在25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量下，180 r／min下OD600顯著低于150 r／min和210 r／min，在150 r／min條件下生長(zhǎng)最好（圖4 D）；在上述優(yōu)化條件下，裝載量為40%下生長(zhǎng)的最好（圖4 E）。綜上可知：解淀粉芽孢桿菌M26在25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量、轉(zhuǎn)速為150 r／min、40%裝載量條件下生長(zhǎng)的最好。

圖4 不同發(fā)酵條件下菌株M26的生長(zhǎng)情況

3 討論與結(jié)論

解淀粉芽孢桿菌可通過產(chǎn)生抗生素、抗菌蛋白或多肽等活性物質(zhì)抑制植物病原菌、真菌、病毒和線蟲［18-20］。其易于生產(chǎn)，對(duì)環(huán)境友好，是一類重要的生防資源［21］。有研究表明：解淀粉芽孢桿菌對(duì)番茄青枯菌有很強(qiáng)的拮抗作用［22，23］；枯草芽孢桿菌、解淀粉桿菌和地衣芽孢桿菌能夠抑制青枯病的發(fā)生，且枯草芽孢桿菌抑菌能力最強(qiáng)，可使感染率降低80%［24］；解淀粉芽孢桿菌BS2004、SQY162和SQRT3對(duì)番茄青枯病的防治效果在70%以上，最高可達(dá)到81.25%，且均能夠促進(jìn)番茄植株生長(zhǎng)［25-27］。

解淀粉芽孢桿菌與枯草芽孢桿菌的親緣性很高，對(duì)人體及其它生物無害，因此被廣泛應(yīng)用于飼料、植物病害防治及果蔬保鮮中［28］。本研究對(duì)菌株M26的發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，在45℃生長(zhǎng)最差，而在35℃和25℃均生長(zhǎng)良好。符可芯等［17］的研究表明，解淀粉芽孢桿菌在高于45℃時(shí)菌體生長(zhǎng)放緩，OD值下降，且在55℃的OD值高于25℃的，與本研究結(jié)果不一致，可能是解淀粉芽孢桿菌菌株的差異性所造成的。劉芳等［21］的研究表明，隨著溫度的升高，枯草芽孢桿菌BZJN1的芽孢數(shù)減少，45℃時(shí)降到最低，與本研究結(jié)果一致。

通過分析M26菌株的16S rRNA序列、形態(tài)和生理特征，確定M26為解淀粉芽孢桿菌。M26菌株的最佳培養(yǎng)條件為溫度25℃、pH＝7、0.5%NaCl含量、轉(zhuǎn)速150 r／min、裝載量40%。本試驗(yàn)為解淀粉芽孢桿菌的生產(chǎn)工藝提供了參考數(shù)據(jù)。