大白菜干燒心病原菌Pantoea ananatis的生物學(xué)特性及全基因組序列分析

張燁，張庶，李化銀，王鳳德，高建偉

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所／山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室／國家蔬菜改良中心山東分中心，山東 濟(jì)南 250100；2.黃山學(xué)院，安徽 黃山 245041）

大白菜（Brassica rapa L.ssp.pekinensis）原產(chǎn)于中國，是我國的特產(chǎn)蔬菜。大白菜產(chǎn)量高、生產(chǎn)成本低、種植方法簡單、耐運(yùn)輸、耐儲藏，且味美、營養(yǎng)豐富，深受人們喜愛，在蔬菜產(chǎn)業(yè)中具有重要地位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國大白菜播種面積每年高達(dá)266.7萬公頃，產(chǎn)值約600億元以上，占全國蔬菜播種總面積的15%左右［1］。同時(shí)，大白菜是城鄉(xiāng)居民的主要食用蔬菜，在保障全國蔬菜均衡供應(yīng)、平抑菜價(jià)和農(nóng)民增收等方面做出了突出貢獻(xiàn)。

自20世紀(jì)70年代以來，大白菜干燒心病發(fā)生嚴(yán)重，對大白菜產(chǎn)量和品質(zhì)造成了嚴(yán)重的影響，減少了菜農(nóng)收入［2，3］。干燒心病又稱頂燒病、心腐病和緣腐病，前人在水果和蔬菜上的研究表明，缺鈣時(shí)其生長點(diǎn)及附近組織的生長會受到影響，表現(xiàn)出頂燒或心腐的癥狀［4-11］。因此，以往通常認(rèn)為大白菜干燒心病是一種生理性病害，主要由植株體內(nèi)生理性缺鈣引起，表現(xiàn)為結(jié)球前期內(nèi)部幼葉的邊緣呈水漬狀、半透明，隨后脫水萎蔫，葉色變淺、發(fā)黃，頂邊干枯，葉肉呈黃白色的干紙狀［12］；如在結(jié)球后期發(fā)病，則植株外觀正常，但葉球內(nèi)部的心葉邊緣部分變干、黃化、焦枯，出現(xiàn)干紙狀的帶狀病斑或不規(guī)則病斑，發(fā)病部位與健康部位界限較為清晰。大白菜干燒心病多發(fā)生在蓮座期或包心期，但當(dāng)生長環(huán)境不適宜或者該品種對干燒心病的抗性較弱時(shí)，苗期也會發(fā)生干燒心?。?2］；另外，貯藏期間，由于生理活動(dòng)仍緩慢進(jìn)行且鈣元素供應(yīng)停止，大白菜干燒心病可持續(xù)發(fā)展，并且在貯藏條件不好的情況下大白菜植株極易受病菌侵染，使葉球出現(xiàn)“夾葉爛”的現(xiàn)象，最終導(dǎo)致整個(gè)植株腐爛。

根據(jù)傳統(tǒng)描述的大白菜干燒心病癥特點(diǎn)，本課題組經(jīng)多年田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，除缺鈣引起的大白菜干燒心病外，細(xì)菌感染也會導(dǎo)致大白菜干燒心［13］，因此，將其界定為細(xì)菌性干燒心和缺素（鈣元素等）性干燒心兩種類型。早期細(xì)菌性干燒心病葉邊緣呈濕腐狀，而缺鈣引起的干燒心病葉邊緣則成干枯狀，這是兩種類型大白菜干燒心病的主要區(qū)別。目前，對大白菜干燒心病的研究主要集中于生理性缺鈣引起的病害，而對細(xì)菌性干燒心病研究較少；且人們對兩種類型的干燒心病往往區(qū)分不清，僅采用常規(guī)田間栽培管理措施，難以實(shí)現(xiàn)對大白菜干燒心病的有效防治。

2019年，我們首次報(bào)道了泛菌Pantoea ananatis能導(dǎo)致大白菜細(xì)菌性干燒心病的發(fā)生［13］。本研究即對分離得到的P.ananatis Y2菌株進(jìn)行生物學(xué)特征及其引起的大白菜干燒心病發(fā)病規(guī)律調(diào)查，并對P.ananatis的全基因組進(jìn)行測序，分析基因組特征。本研究將有助于人們?nèi)娼沂敬蟀撞烁蔁牟“l(fā)生的分子機(jī)理，對利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段結(jié)合傳統(tǒng)育種方式培育大白菜高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病品種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)基地進(jìn)行，所用品種為春大王。將大白菜種子在僅含有蒸餾水的培養(yǎng)皿上萌發(fā)后轉(zhuǎn)入基質(zhì)（營養(yǎng)土∶蛭石＝2∶1）中，在25℃／22℃、14 h／10 h（光／暗）以及相對濕度50%的條件下培養(yǎng)至完全展開第七片葉，用于細(xì)菌接種。

1.2 病原菌分離

從田間取回大白菜感病植株，用刀片在大白菜葉片病健交界處切取1 cm2左右的方塊，在超凈臺進(jìn)行組織表面消毒后放入無菌三角瓶中，加入70%乙醇消毒30 s，期間不斷搖晃三角瓶；倒出70%乙醇后，再加入1%次氯酸鈉（現(xiàn)用現(xiàn)配）消毒5 min；用滅菌蒸餾水沖洗5遍后，用滅菌濾紙吸干多余水分，并轉(zhuǎn)移至無菌研缽中。向研缽中加入1 mL滅菌水，用研磨棒將組織研磨充分，靜置10 min左右，使組織中的細(xì)菌進(jìn)入水中，形成懸浮液。將細(xì)菌懸浮液分別進(jìn)行10、100、1 000、10 000倍稀釋，分別取10μL涂布在NB培養(yǎng)基上（pH 7.0，含1.5%瓊脂），30℃倒置培養(yǎng)2～3 d，對平板上出現(xiàn)的主要菌落進(jìn)行純化。

1.3 病原菌P.ananatis致病性的測定

在NB液體培養(yǎng)基中接種純化的菌落，30℃條件下振蕩培養(yǎng)過夜，常溫下5 000 r／min離心10 min后，用滅菌蒸餾水重懸菌體，并調(diào)整菌液濃度為1×106cfu／mL。用1 mL無針頭無菌注射器吸取重懸菌液并注射進(jìn)大白菜葉片背面，以無菌蒸餾水作為對照。設(shè)置3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)處理10棵大白菜幼苗。接種后，觀察大白菜葉片的發(fā)病情況，完成柯赫氏法則的驗(yàn)證，對分離得到的致病菌再次確認(rèn)。

1.4 病原菌P.ananatis的生物學(xué)特性

1.4.1 形態(tài)學(xué)觀察 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》進(jìn)行革蘭氏染色，使用光學(xué)顯微鏡觀察菌體形態(tài)。

1.4.2 生理生化鑒定 依照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》（Bergey’sManual of Detenninative Bacteriology）對P.ananatis進(jìn)行生理生化鑒定，包括革蘭氏染色、糖發(fā)酵試驗(yàn)、氧化酶反應(yīng)、V-P試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)。

1.5 P.ananatis基因組測序分析

1.5.1 DNA提取 采用天根生化科技（北京）有限公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）進(jìn)行。

1.5.2 測序文庫構(gòu)建及測序 提取的細(xì)菌DNA使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用Qubit進(jìn)行定量。使用Covaris超聲破碎儀從DNA上隨機(jī)打斷成長度約為350 bp的片段，并對該片段進(jìn)行末端修復(fù)、加A、加測序接頭、純合與PCR擴(kuò)增等完成文庫制備。使用Illumina NovaSeq PE150進(jìn)行測序。

1.5.3 生物信息學(xué)分析 （1）原始數(shù)據(jù)處理：使用readfq（Version 10）對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，包括去除含低質(zhì)量堿基的reads、含N堿基超過10 bp的reads、含Adapter的reads、可能來源于宿主的reads和duplication污染。

（2）樣品組裝：使用SOAP denovo、SPAdes和AbySS對預(yù)處理后的CleanData進(jìn)行組裝［14-17］，使用CISA［18］軟件進(jìn)行整合，初步組裝結(jié)果使用gapclose（Version1.12）進(jìn)行優(yōu)化和補(bǔ)洞，并過濾掉500 bp以下的片段。

（3）基因組組分分析：使用GeneMarkS（Version 4.17）軟件對基因組編碼基因預(yù)測［19］。使用RepeatMasker（Version open-4.0.5）軟件進(jìn)行散在重復(fù)序列預(yù)測［20］，使用TRF（Tandem Repeats Finder，Version 4.07b）搜尋DNA序列中的串聯(lián)重復(fù)序列［21］。通過tRNAscan-SE軟件（Version 1.3.1）對tRNA進(jìn)行預(yù)測［22］，通過與近緣參考序列的rRNA庫與rRNAmmer軟件（Version 1.2）預(yù)測rRNA［23］，使用Rfam database對sRNA進(jìn)行注釋［24，25］，使用cmsearch程序（Version 1.1rc4）確定最終的sRNA。使用IslandPath-DIOMB軟件（Version 0.2）預(yù)測基因島［26］。使用phiSpy軟件（Version 2.3）預(yù)測樣品基因組上的前噬菌體［27］。使用CRISPRdigger（Version 1.0）對樣品基因組進(jìn)行CRISPR預(yù)測［28］。

（4）功能注釋：使用通用功能數(shù)據(jù)庫與特定功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋。通用功能數(shù)據(jù)庫包括GeneOntology數(shù)據(jù)庫［29］、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫［30，31］和COG（Cluster of Orthologous Groups of Proteins）數(shù)據(jù)庫［32］；特定功能數(shù)據(jù)庫包括TCDB（Transporter Classification Database）數(shù)據(jù)庫［33］、碳水化合物活性酶（Carbohydrate-Active EnZymes Database，CAZy）數(shù)據(jù)庫［34］和病原與宿主互作數(shù)據(jù)庫等。

2 結(jié)果與分析

2.1 P.ananatis的致病性鑒定

2018年6月，在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所試驗(yàn)基地對大白菜進(jìn)行春季調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)了由P.ananatis引起的細(xì)菌性干燒心癥狀（圖1A），與生理性缺鈣引起的大白菜干燒心癥狀（圖1B）明顯不同。葉邊緣腐爛還是干枯是細(xì)菌性與生理性缺鈣引起的大白菜干燒心病的主要區(qū)別。

圖1 Pantoea ananatis與生理性缺鈣引起的大白菜干燒心病癥狀對比

將分離、純化得到的P.ananatis Y2菌株回接至健康的大白菜葉片（以接無菌水為對照），10天后從回接部位發(fā)現(xiàn)壞死病灶（圖2）；25天后，發(fā)病癥狀與田間自然條件下發(fā)病時(shí)一致，再次分離純化得到的細(xì)菌菌株形態(tài)學(xué)特征與接種細(xì)菌一致。

圖2 病原菌回接10天大白菜病斑

2.2 P.ananatis的生物學(xué)特性

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征 P.ananatis呈圓形菌落，菌落直徑0.2～0.3 mm，表面較為光滑，邊緣整齊，培養(yǎng)初期為乳白色，后期變?yōu)樯铧S色（圖3）。

2.2.2 生理生化特性 P.ananatis革蘭氏染色陰性，單個(gè)菌體桿狀，菌體大?。?.92～2.87）μm×（0.64～1.25）μm。能利用D-葡萄糖、α-乳糖、蔗糖、D-果糖和L-鼠李糖產(chǎn)酸但不產(chǎn)氣，不能利用麥芽糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，V-P試驗(yàn)和檸檬酸利用試驗(yàn)結(jié)果為陽性，氧化酶試驗(yàn)結(jié)果為陰性（表1）。參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》與《伯杰細(xì)菌手冊》，該病原菌與泛菌屬細(xì)菌的特征極為相似。

圖3 細(xì)菌性大白菜干燒心病病原菌的菌落培養(yǎng)形態(tài)

表1 Pantoea ananatis的生理生化特性鑒定結(jié)果

2.3 P.ananatis的全基因組測序分析

2.3.1 數(shù)據(jù)處理與樣品組裝 使用Illumina NovaSeq PE150測序平臺對P.ananatis Y2進(jìn)行了全基因組測序，獲得了658 Mb原始數(shù)據(jù)，其中過濾后的有效數(shù)據(jù)為600 Mb，占原數(shù)據(jù)量的91.19%。有效數(shù)據(jù)的Q20達(dá)到97.75%，Q30達(dá)到93.59%，預(yù)測基因組大小為5.26 Mb（表2）。

表2 基因組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

獲得的有效數(shù)據(jù)經(jīng)SOAP denovo（Version 2.04）、SPAdes和AbySS軟件組裝后，使用CISA軟件進(jìn)行整合，使用gapclose（Version 1.12）等軟件進(jìn)行優(yōu)化后，組裝成32個(gè)contig（＞500 bp），總長度為5 062 658 bp，G+C含量為53.54%，其中長度最長的contig包含1 350 885 bp序列，長度最短的contig包含562 bp序列（表3）。

表3 基因組組裝結(jié)果contig統(tǒng)計(jì)

2.3.2 編碼基因預(yù)測結(jié)果 對編碼基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果（表4）顯示，預(yù)測編碼基因4 955個(gè)，基因總長度4 380 990 bp，平均基因長度884 bp，在全基因組序列中編碼基因占86.54%。編碼基因的長度從小于100 bp到大于2 000 bp均有分布，其中基因長度200～300、400～500、700～800、900～1 000 bp范圍內(nèi)分布的編碼基因數(shù)目較多，而基因長度在0～100、1 700～1 800、1 800～1 900、1 900～2 000 bp的編碼基因數(shù)目較少（圖4）。

表4 編碼基因預(yù)測結(jié)果

圖4 P.ananatis Y2基因長度分布

2.3.3 重復(fù)序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果 散在重復(fù)序列、串聯(lián)重復(fù)序列是根據(jù)重復(fù)序列在基因組上的分布確定的。在P.ananatis Y2中共有109個(gè)散在重復(fù)序列，包括：長末端重復(fù)序列55個(gè)，DNA轉(zhuǎn)座子15個(gè)，長散在重復(fù)序列25個(gè)和短散在重復(fù)序列14個(gè)，這些散在重復(fù)序列長度范圍901～3 742 bp，在基因組中所占比例從0.0178%到0.0739%，平均長度范圍64～86 bp（表5）。

表5 散在重復(fù)序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果

在P.ananatis Y2中共鑒定到串聯(lián)重復(fù)序列223個(gè)，包括：串聯(lián)重復(fù)序列135個(gè)、小衛(wèi)星DNA 81個(gè)和微衛(wèi)星DNA 7個(gè)，串聯(lián)重復(fù)序列總長度范圍是486～17 135 bp，在基因組中所占比例為0.0096%～0.3385%（表6）。

表6 串聯(lián)重復(fù)序列統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3.4 非編碼RNA（ncRNA）統(tǒng)計(jì)結(jié)果 對于微生物而言，非編碼RNA中研究較為普遍的包括sRNA、rRNA、tRNA等。在P.ananatis Y2中，共鑒定到ncRNA 111個(gè)，其中，tRNA數(shù)目最多，鑒定到71個(gè)，sRNA次之，鑒定到32個(gè)，rRNA（5S）鑒定到6個(gè)，rRNA（16S）和rRNA（23S）數(shù)目最少，各鑒定到1個(gè)（表7）。這些ncRNA的平均長度從78 bp到2 549 bp，總長度從660 bp到5 572 bp（表7）。

表7 ncRNA去冗余后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果

2.3.5 基因島、前噬菌體和CRISPR統(tǒng)計(jì)結(jié)果

在P.ananatis Y2中，鑒定到15個(gè)基因島（GIs），其總長度為185 078 bp，平均長度為12 339 bp（表8）。對基因島基因分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中長度小于15 kb的基因島中的基因分布見圖5。在P.ananatis Y2中，鑒定到6個(gè)前噬菌體，總長度為169 319 bp，平均長度為28 219 bp（表8）。在P.ananatis Y2中，僅鑒定到1個(gè)CRISPR，長度為95 bp（表8）。

表8 基因島、前噬菌體和CRISPR預(yù)測結(jié)果統(tǒng)計(jì)

圖5 小于15 kb的P.ananatis Y2基因島中的基因分布

2.4 P.ananatis的基因組功能注釋

2.4.1 GO功能注釋 P.ananatis Y2鑒定到的編碼基因的分子功能可以分類為11個(gè)條目，其中富集基因數(shù)目最多的兩個(gè)條目是binding和catalytic activity（圖6）。依細(xì)胞組分分類，編碼基因可富集到10個(gè)條目中，cell和cell part富集的基因數(shù)目最多（圖6）。在生物過程類別中，編碼基因富集在24個(gè)條目中，富集基因數(shù)目最多的條目是cellular process和metabolic process（圖6）。

2.4.2 KEGG注釋 從P.ananatis Y2鑒定到的編碼基因在多個(gè)KEGG條目中均有富集，在cellular processes類別中，富集基因數(shù)目最多的兩個(gè)條目是cellular community-prokaryotes和cell motility；在environmental information processing類別中，都富集在兩個(gè)條目，分別是signal transduction和membrane transport；在genetic information processing類別中，編碼基因被富集到4個(gè)條目中，富集基因數(shù)目最多的條目是translation；在human diseases類別中，編碼基因被富集到11個(gè)條目中，基因數(shù)目最多的兩個(gè)條目是drug resistance：antimicrobial和infectious diseases：bacterial；編碼基因在metabolism類別中富集的條目最多，有12個(gè)條目，富集基因數(shù)目最多的是global and overview maps，其 次 是carbohydrate metabolism 和amino acid metabolism。在organismal systems分類中，編碼基因被富集為7個(gè)條目，包括endocrine system、environmental adaptation、immune system 和aging等（圖7）。

圖6 P.ananatis Y2基因功能注釋GO功能分類

圖7 P.ananatis Y2基因功能注釋KEGG代謝通路分類

2.4.3 COG注釋 P.ananatis Y2編碼基因在COG數(shù)據(jù)庫按照功能一共可以分為23類，其中富集基因數(shù)目最多的4個(gè)條目分別是：carbohydrate transport and metabolism、amino acid transport and metabolism、general function prediction only和transcription（圖8）。

圖8 P.ananatis Y2基因功能注釋COG功能分類

2.4.4 TCDB注釋 TCDB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫是膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白包括離子通道的分類系統(tǒng)，以5個(gè)級別進(jìn)行分類。P.ananatis Y2編碼基因在TCDB轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分類數(shù)據(jù)庫中的第一級分類共富集在7個(gè)條目中，富集基因數(shù)目最多的條目是primary active transporters，其次是electrochemical protential-driven transporters（圖9）。

圖9 P.ananatis Y2基因功能注釋TCDB功能分類

2.4.5 分泌蛋白預(yù)測 分泌蛋白是指在細(xì)胞內(nèi)合成的可在信號肽引導(dǎo)下穿過細(xì)胞膜分泌到細(xì)胞外起作用的蛋白質(zhì)。分泌蛋白中有許多是生命活動(dòng)所需的重要酶類。分泌蛋白的N端是由15～30個(gè)氨基酸組成的信號肽，對分泌蛋白的分泌起主導(dǎo)作用。使用SignalP（Version 4.1）和TMHMM（Version 2.0c）可對信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，以確認(rèn)預(yù)測蛋白序列是否屬于分泌蛋白。P.ananatis Y2編碼基因中有386個(gè)蛋白含有信號肽，有1 147個(gè)蛋白含有跨膜結(jié)構(gòu)，綜合預(yù)測為分泌蛋白的數(shù)目為311個(gè)（表9）。

表9 分泌蛋白預(yù)測結(jié)果

2.4.6 TNSS效應(yīng)蛋白預(yù)測 TNSS（type N secretion systems）即N型分泌系統(tǒng)，目前確定的有7種，為Ⅰ～Ⅶ型。病原菌通過將TNSS效應(yīng)蛋白分泌至胞外或宿主細(xì)胞中控制免疫應(yīng)答反應(yīng)及細(xì)胞衰亡，從而引起病理反應(yīng)。其中，T3SS（Ⅲ型分泌系統(tǒng)）通常用來從分子水平研究革蘭氏陰性菌的感染機(jī)制和毒力作用等，是研究得比較多的分泌系統(tǒng)。P.ananatis Y2的編碼基因只有Ⅵ型分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，數(shù)量為3個(gè)（表10）。而采用EffectiveT3軟件（Version 1.0.1）預(yù)測其T3SS效應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)在4 955個(gè)編碼基因中，T3SS效應(yīng)蛋白數(shù)目為204個(gè)（表10）。兩種結(jié)果差異的具體原因還有待進(jìn)一步研究。原菌與宿主互作數(shù)據(jù)庫，病原菌主要為真菌、卵菌和細(xì)菌，感染的宿主包括動(dòng)物、植物、真菌以及昆蟲。對P.ananatis Y2編碼基因在PHI數(shù)據(jù)庫中匹配的基因數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果（圖11）表明，編碼基因在PHI數(shù)據(jù)庫中鑒定到29個(gè)基因分布在increased virulence（hypervirulence）分類中，319個(gè)基因分布于ruduced virulence分類中，6個(gè)基因分布于lethal分類中，未見其它致病相關(guān)分類含有P.ananatis Y2的編碼基因。

表10 TNSS和T3SS結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2.4.7 次級代謝基因簇分析 次級代謝產(chǎn)物是微生物在一定的生長時(shí)期以初級代謝產(chǎn)物為前體合成的，對微生物的生命活動(dòng)無明確功能，并非生長繁殖所必需的物質(zhì)。采用antiSMASH 程序（Version 2.0.2）對P.ananatis Y2的次級代謝基因簇進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，在P.ananatis Y2中有7條次級代謝基因簇，被分成了5類，其中siderophore和hserlactone各有2條，arylpolyene、thiopeptide和terpene各有1條（圖10）。

2.4.8 病原菌與宿主互作注釋分析 PHI是病

圖10 P.ananatis Y2次級代謝基因簇及相應(yīng)基因數(shù)量

圖11 P.ananatis Y2病原體PHI數(shù)據(jù)庫基因分布

3 討論與結(jié)論

2018年6月，在山東大白菜種植地區(qū)發(fā)生大面積疑似干燒心感病現(xiàn)象，即頂葉邊緣初期水浸狀，半透明，后變淡黃褐色，皺縮干枯成干邊；但持續(xù)觀察發(fā)現(xiàn)到發(fā)病后期與生理性干燒心病害的癥狀并不相同，沒有出現(xiàn)葉面變干黃化或心葉邊緣枯焦等現(xiàn)象［3］，而是葉片邊緣嚴(yán)重腐爛，因此，懷疑其并非生理性病害，可能受病原菌感染所致。我們從感病葉片的病健交界處取樣，通過分子生物學(xué)鑒定，確定該病病原菌為泛菌屬的P.ananatis［13］。

泛菌屬細(xì)菌廣泛存在于土壤、水、種子以及植物表面，甚至人與動(dòng)物的尿液、汗液中也檢測出此類細(xì)菌。目前，很多學(xué)者對此屬細(xì)菌的致病性仍存在爭議，認(rèn)為泛菌屬細(xì)菌是非植物致病菌，僅是植物病灶中的次生菌或腐生性細(xì)菌［35］。但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)泛菌屬細(xì)菌可引起多種植物病害，如P.stewartii可引起玉米細(xì)菌性枯萎病，鑒于其危害性及傳播性極強(qiáng)，已被列為我國植物檢疫對象；P.agglomerans能引起玉米枯萎病、葉疫病［36］以及玉米莖腐?。?7］。近年來，國外大量報(bào)道指出多種植物的細(xì)菌性病害由P.ananatis引起，如P.ananatis可引起玉米細(xì)菌性褐腐病以及加州高粱葉斑?。?8，39］，并且發(fā)病面積和危害程度不斷加重，引起國外大量學(xué)者的廣泛關(guān)注［40-43］。然而，P.ananatis在我國引起病害的報(bào)道較少，其引起大白菜葉部腐爛尚屬首次報(bào)道［13］。

本研究對從大白菜中分離鑒定到的細(xì)菌性干燒心病原菌P.ananatis Y2菌株進(jìn)行生理生化鑒定和基因組測序分析，獲得的組裝基因組大小約為5.26 Mb，拼接獲得32個(gè)contig，編碼4 955個(gè)基因。將P.ananatis Y2菌株的基因組與已知的SGAir0210和Strain 1.38基因組進(jìn)行比對（表11），發(fā)現(xiàn)其比已知的SGAir0210和Strain 1.38的基因組更大，編碼的基因數(shù)也更多，但G+C含量差異不大［44，45］。P.ananatis SGAir0210是從空氣中分離得到的，P.ananatis Strain 1.38是從水稻根際土壤中分離得到的，未見這兩個(gè)菌株具有致病性的報(bào)道；而本試驗(yàn)分離得到的P.ananatis Y2菌株具有植物致病性，基因組大小的差異可能是導(dǎo)致其具有致病性的原因。

表11 不同Pantoea ananatis菌株基因組比較

在P.ananatis Y2菌株中鑒定到109個(gè)重復(fù)序列、223個(gè)串聯(lián)重復(fù)序列、111個(gè)非編碼RNA、5個(gè)基因島、6個(gè)前噬菌體和1個(gè)CRISPR。在GO數(shù)據(jù)庫中，P.ananatis Y2的編碼基因在分子功能分類中富集到11個(gè)條目中，在細(xì)胞組分分類中富集到10個(gè)條目中，在生物過程分類中富集在24個(gè)條目中。在KEGG數(shù)據(jù)庫中，P.ananatis Y2的蛋白富集到6大分類的40條途徑中。在COG數(shù)據(jù)庫中，P.ananatis Y2的蛋白在23個(gè)分類中有富集。同時(shí)對P.ananatis Y2菌株在膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、碳水化合物活性酶、分泌蛋白、分泌系統(tǒng)蛋白及T3SS效應(yīng)蛋白、次級代謝基因簇及病原菌與宿主互作等特定功能進(jìn)行了注釋。盡管在P.ananatis Y2中鑒定到29個(gè)強(qiáng)致病相關(guān)基因，但是目前尚未見到其在大白菜葉片致病機(jī)理方面的研究，因而這29個(gè)基因?qū)ζ渲虏×Φ挠绊戇€需進(jìn)一步深入研究，這將有利于今后對大白菜葉片細(xì)菌性干燒心致病機(jī)理及大白菜對其抗性的研究。