紅花多糖通過調(diào)控MMP-9抑制神經(jīng)母細胞瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的研究

瞿紅霞　高潔　張春泉　劉子龍　溫娟　胡兆鵬

【摘 要】目的：研究紅花多糖對神經(jīng)母細胞瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的作用及其作用機制。方法：用不同濃度的紅花多糖作用于人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞后進行細胞生物學(xué)功能實驗，研究其對神經(jīng)母細胞瘤侵襲及轉(zhuǎn)移的影響;收集經(jīng)不同濃度紅花多糖處理的SH-SY5Y細胞的mRNA和蛋白分別進行RT–PCR和Westernblot實驗。結(jié)果：紅花多糖抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移;紅花多糖在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)MMP-9的表達。結(jié)論：在神經(jīng)母細胞瘤細胞中，紅花多糖通過轉(zhuǎn)錄抑制下調(diào)MMP-9的表達，并通過靶向MMP-9抑制神經(jīng)母細胞瘤細胞的體外侵襲、轉(zhuǎn)移。

【關(guān)鍵詞】紅花多糖;神經(jīng)母細胞瘤;MMP-9;SH-SY5Y;生物學(xué)功能

【中圖分類號】R3【文獻標識碼】A【文章編號】1005-0019（2020）13--01

在臨床上，紅花常用于抗腫瘤復(fù)方中，大量的實驗相繼發(fā)現(xiàn)紅花抑制腫瘤的主要成分為紅花多糖（SPS）、紅花黃色素及紅花黃色素A，研究主要集中于肺癌、肝癌、乳腺癌等腫瘤。將紅花用于神經(jīng)母細胞瘤的研究非常少，紅花作用于該腫瘤的機理尚不明確。神經(jīng)母細胞瘤（Neuroblastoma，NB）是起源于交感神經(jīng)系統(tǒng)的惡性胎源性腫瘤。NB的病因目前并不明確，但目前越來越多的研究表明細胞外基質(zhì)對腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程起組織屏障作用，細胞外基質(zhì)屏障的破壞會使得腫瘤細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究觀察了紅花多糖對人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH- SY5Y細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移、增殖的作用，并且對它的作用機理進行了初步探討，為紅花多糖治療NB提供科學(xué)的實驗和理論依據(jù)。

1 試劑與儀器

紅花多糖購于成都德思特生物;人神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y由華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院童教授提供;TRIPA總蛋白裂解液、MTT等購于武漢谷歌生物科技有限公司;ECL顯影液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購于上海碧云天公司;Transwell小室購自美國Invetrogen公司。DMEM細胞培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）等購于Hyclone公司;GAPDH和MMP-9基因的引物購至擎科生物;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司-大連寶生物有限公司。兔抗MMP-9抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔的二抗購于ABclonal公司;生物超凈臺購自蘇凈安泰公司;PCR儀購自DTC公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)及分組 SH-SY5Y細胞株在DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗中所使用的SH-SY5Y細胞均處于對數(shù)生長期。待細胞融合至70～80%時，用胰酶消化，制備成細胞懸液并接種于細胞培養(yǎng)板中待細胞貼壁，生長良好后分別加入不同濃度的紅花多糖。實驗分為四組，其中第1組為對照組（加入PBS，紅花多糖濃度為0mg/ ml）、第2、3、4組為含有不同濃度的紅花多糖（濃度分別為0.16 mg/ml、0.32 mg/ml、0.64mg/ml）的實驗組[1]。

2.2 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率 消化細胞，以3000個/孔細胞的密度接種于96孔板，每個孔分別加入200μl培養(yǎng)基，每種處理設(shè)8個重復(fù)。分別加入不同濃度的紅花多糖進行培養(yǎng)，48 h后吸棄培養(yǎng)液，每孔分別加入180μl培養(yǎng)基，并分別加入20μl MTT溶液（5 mg/μl），培養(yǎng)箱中繼續(xù)培育4 h后吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入100 ml DMSO，用酶標儀測定吸光度（A）值，并計算增殖活性抑制率。

2.3 Transwell實驗檢測對細胞侵襲能力的改變 消化細胞，取一個24孔板，每孔加入500?l培養(yǎng)基（含20%血清），將小室放入24孔板;上層每孔加入200?l培養(yǎng)基（含5%血清及）及25000個細胞，混勻后在培養(yǎng)箱中培養(yǎng);過夜后用棉棒擦掉小室上層細胞，加入500?l甲醇固定10-15min，PBS清洗，結(jié)晶紫染色，PBS清洗，顯微鏡下照相。

2.4 劃痕遷移實驗檢測對腫瘤細胞遷移能力的影響 消化細胞，以每孔1.25×105個細胞的密度種于24孔板，過夜后用10?l槍頭與24孔板底垂直做十字劃痕;用PBS清洗洗去劃下的細胞，分別加入不同紅花多糖濃度的完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中培育，分別于0、24、48h拍照。

2.5 Real-time PCR檢測MMP-9基因的mRNA表達 紅花多糖處理SH-SY5Y細胞24h后，收集細胞，每（5～10）×106個細胞中加入1mL Trizol，反復(fù)吹充分裂解細胞。加入200μL氯仿，充分震蕩混勻后室溫放置2～3min。4℃12000g離心15min，吸取上層水相至新EP管中，加入等體積異丙醇，上下顛倒混勻，4℃靜置5～10min。4℃12000g，離心10min，離心后管壁和管底出現(xiàn)膠狀沉淀。加入1mL 75 %的乙醇，懸浮沉淀。4℃12000g離心5min，室溫晾干5min后加入20μL無Rnase的水，充分震蕩混勻。用分光光度計檢測總RNA的OD值并計算其濃度。然后進行逆轉(zhuǎn)錄，用于real-timePCR檢測，用StepOneSoftware分析軟件分析并輸出Ct值及熔解擴增曲線。

2.6 Western blot檢測MMP-9蛋白的表達 紅花多糖處理SH-SY5Y細胞48h后，收集細胞，加入蛋白裂解液提取總蛋白，使用蛋白檢測試劑盒對所提取的蛋白進行濃度測定，測定后每管各加入1/4倍體積的5×SDS上樣緩沖液，把樣品放置于95℃的金屬浴鍋中變性10 min，變性后的蛋白用于上樣進行SDS-PAGE電泳并轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后加封閉液封閉12 h，封閉過的膜加入MMP-9抗體4℃過夜。次日，TBST搖床洗膜，然后加入二抗（1：1000）室溫孵育1 h，TBST洗膜，增強化學(xué)發(fā)光劑（ECL）顯色，發(fā)光儀發(fā)光，記錄并保存結(jié)果;使用Photoshop、ImageJ處理分析數(shù)據(jù)。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析方法 實驗所得數(shù)據(jù)用均數(shù)士標準差（X士S）表示，通過SPSS 17. 0統(tǒng)計軟件的t檢驗和方差分析進行統(tǒng)計處理，取P<0. 05說明有差異，代表有統(tǒng)計學(xué)意義，用Graphpad Prism 5.0軟件進行繪圖。

3 結(jié)果

3.1 細胞生物學(xué)功能實驗：加入不同濃度的紅花多糖可使SH-SY5Y細胞的增殖能力顯著降低 （P<0.05） （圖3-1）、侵襲能力顯著降低（P< 0.05）（圖3-2）、遷移能力顯著下降 （圖3-3），且隨著紅花多糖的濃度增加，對SH-SY5Y細胞增殖、侵襲及遷移的抑制作用越明顯。

3.2 加入不同濃度的紅花多糖可使人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞中MMP-9的轉(zhuǎn)錄本（mRNA）和蛋白表達水平顯著下調(diào)（P< 0.05，圖3-4和圖3-5）。

4 討論

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康并危及生命，轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的首要原因。NB是最常見的起源于神經(jīng)脊的外周神經(jīng)系統(tǒng)實體瘤，占兒童腫瘤死亡病例總數(shù)15 %左右。在影響腫瘤轉(zhuǎn)移的諸多因素中，MMPs與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系非常密切。MMPs活性的增加與乳腺、肺、結(jié)腸等多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)[2]，它能導(dǎo)致細胞外基質(zhì)降解，使得腫瘤細胞能夠突破細胞外基質(zhì)組成的屏障，從而導(dǎo)致腫瘤細胞發(fā)生浸潤和轉(zhuǎn)移[3]。MMP-9是MMPs中很重要的一員，在多種類型腫瘤中MMP-9表達水平上調(diào)，且MMP-9高表達患者預(yù)后較差，生存時間相對較短。程瑜等的研究已經(jīng)證實在NB組織中 MMP-9的表達是上調(diào)的，但是MMP-9在 NB組織中的表達調(diào)控機制仍不明確[4]。下調(diào)MMP-9，是抑制腫瘤轉(zhuǎn)移，延長腫瘤患者生存時間的突破口。

從中藥中尋找下調(diào)MMP-9，對抗腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的藥物，對推進我國中醫(yī)藥現(xiàn)代化具有非常重要的意義。紅花多糖提取自中藥紅花，大量研究表明紅花多糖具有抗腫瘤、抑制血小板聚集、調(diào)節(jié)機體免疫等多種作用[5]，紅花多糖抗腫瘤的機理是抑制新生血管生成，以及抑制腫瘤細胞增殖。本研究重點探討紅花多糖對神經(jīng)母細胞瘤SH- SY5Y細胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移的作用。

我們的研究發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細胞瘤中，紅花多糖通過轉(zhuǎn)錄抑制下調(diào) MMP-9的表達，且紅花多糖可以通過下調(diào)MMP-9抑制神經(jīng)母細胞瘤侵襲和轉(zhuǎn)移;而且紅花多糖可使神經(jīng)母細胞瘤的增殖能力降低，但是不知道確切機制，需要進一步研究闡明。這項研究拓展了我們關(guān)于紅花多糖在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)MMP-9的認識，且表明紅花多糖可以作為NB新治療靶標的潛在價值。

隨著對中藥的研究不斷深入，某些中藥的研究已表現(xiàn)出較好的開發(fā)前景。但目前很多研究還局限于實驗性研究，相信隨著研究的不斷深入，中藥抑制MMPs抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的機理會有更大的突破，并進一步實現(xiàn)臨床應(yīng)用。

參考文獻：

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