西伯利亞百合遺傳轉(zhuǎn)化高頻直接分化受體體系的建立

馮慧敏 鄭 野 張 偉

（1.大興安嶺職業(yè)學(xué)院 黑龍江大興安嶺 165000；2.國家林業(yè)和草原局大興安嶺調(diào)查規(guī)劃設(shè)計(jì)院 黑龍江大興安嶺165000；3.張家口市城市管理綜合行政執(zhí)法局 河北張家口 075000）

西伯利亞百合型美味濃，是重要的鮮切花。通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入干擾花粉發(fā)育基因、抗病基因、抗衰老基因等外源基因，可以改良品質(zhì)，提高百合的觀賞價(jià)值[1~2]。同時(shí)，建立高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化受體體系是西伯利亞百合轉(zhuǎn)基因育種的基礎(chǔ)。本研究意在探索適合西伯利亞百合遺傳轉(zhuǎn)化的受體體系[3]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

西伯利亞百合（Lilium×siberia)無菌苗的葉片、小鱗莖的鱗片和愈傷組織。

1.2 建立西伯利亞百合的高頻再生體系

實(shí)驗(yàn)材料處理：①幼嫩葉片，切成約0.5 cm2的小塊，四周形成傷口；②直徑約1.5 cm 的小鱗莖的鱗片，切掉基部可能存在潛伏芽的部位，再分成約0.5 cm2的小塊，四周形成傷口；③鱗片愈傷組織，切取0.8 cm2的愈傷塊。所有試材接種在分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)培養(yǎng)，每次處理 30 個(gè)樣本。分化培養(yǎng)基為MS + NAA 0.2（單位符號(hào)為mg/L，以下均省略），添加不同濃度的BA，接種葉片和愈傷組織培養(yǎng)基的BA 濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5，接種鱗片培養(yǎng)基的BA 濃度分別為0.0、0.5、1.0、1.5、2.0。30 d 后統(tǒng)計(jì)分化情況。

再生苗高2～3cm 時(shí)轉(zhuǎn)入添NAA（0.2 和0.5）的1/2MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，45 d 后統(tǒng)計(jì)生根結(jié)果。當(dāng)組培苗高5～6cm、根長(zhǎng)3～5cm 時(shí)移栽到滅菌基質(zhì)（蛭石∶草炭土=1∶1）中培養(yǎng)。

1.3 潮霉素敏感性實(shí)驗(yàn)

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加不同濃度的潮霉素（Hy，以下均使用簡(jiǎn)寫符號(hào)）進(jìn)行篩選試驗(yàn)，濃度梯度分別為0、30、50、60、70、80（單位符號(hào)為mg/L，以下均省略），每處理接種鱗片樣本40 個(gè)（經(jīng)試驗(yàn)確定鱗片為轉(zhuǎn)化材料），培養(yǎng)30 d 統(tǒng)計(jì)分化再生情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 西伯利亞百合高頻再生體系的建立

2.1.1 不同濃度BA 對(duì)西伯利亞百合葉片再生芽誘導(dǎo)的影響

西伯利亞百合葉片誘導(dǎo)5 d 后葉色加深呈酥脆狀，切口出現(xiàn)褐化，并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。培養(yǎng)10 d 時(shí)多數(shù)葉塊膨大變厚，褐化嚴(yán)重的外植體開始死亡。培養(yǎng)12 d接種，在高濃度BA 培養(yǎng)基中葉塊的邊緣開始分化出芽。培養(yǎng)20 d 時(shí)1/4 葉塊分化出芽，其余外植體褐化嚴(yán)重失去再生能力或者已經(jīng)死亡。培養(yǎng)30 d 時(shí)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，如圖1 所示，共47 個(gè)葉塊分化出芽，BA 各濃度培養(yǎng)基（從低到高）中獲得再生芽數(shù)目依次為4、5、8、17 和13，占比不到總數(shù)的1/3（共接種150 個(gè)葉塊），且BA 濃度越低葉片褐化死亡率越高。較適合的葉片誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配方為MS +BA2.0+ NAA0.2，平均增殖系數(shù)0.67。

2.1.2 不同濃度BA 對(duì)西伯利亞百合鱗片再生芽誘導(dǎo)的影響

鱗片誘導(dǎo)5 d 后體積開始膨大，培養(yǎng)10 d 時(shí)低濃度BA培養(yǎng)基中鱗片的切口開始分化出芽或生根，17 d 時(shí)所有外植體都分化出芽或生根，并開始形成小植株。誘導(dǎo)30 d 鱗片叢芽分化率為100%，如表1 所示，在MS +NAA 0.2 + BA0.0（即不添加BA）的培養(yǎng)基中鱗片的增殖系數(shù)為1.76，再生芽的根較長(zhǎng)，葉片的生長(zhǎng)狀態(tài)良好，是較適宜鱗片誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)基。

2.1.3 不同濃度BA 對(duì)西伯利亞百合愈傷組織再生芽誘導(dǎo)的影響

愈傷組織誘導(dǎo)5 d 后開始增殖，至10 d 時(shí)低濃度BA 培養(yǎng)基中的愈傷團(tuán)體積增大一倍以上；15 d 時(shí)部分愈傷開始分化出芽；20 d 時(shí)半數(shù)愈傷塊分化出芽，部分愈傷團(tuán)表面細(xì)胞開始皺縮老化；至30 d 時(shí)共有112 塊愈傷分化出芽（共150個(gè)），生長(zhǎng)迅速，高達(dá)3 cm，并分化生根，如表2 所示。在MS +NAA 0.2 + BA0.5 培養(yǎng)基中愈傷組織分化率100%，增值系數(shù)1.23，適于愈傷組織的誘導(dǎo)分化。

表1 不同濃度BA 對(duì)鱗片不定芽誘導(dǎo)分化的影響

表2 不同濃度BA 對(duì)愈傷組織再生芽誘導(dǎo)分化的影響

2.1.4 不同濃度NAA 對(duì)西伯利亞百合再生苗生根培養(yǎng)的影響

高2～3 cm 無根組培苗生根培養(yǎng)7 d 后開始分化生根，黃綠色，根毛呈白色。培養(yǎng)45 d 統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表3 所示，1/2MS+NAA0.5 更適合西伯利亞百合的誘導(dǎo)生根，平均每株生根9個(gè)，雖然平均生根數(shù)量不是最多的，但根的質(zhì)量較好，也易產(chǎn)生下級(jí)根，增大吸收面積，移栽成活率高達(dá)100 %。

表3 不同濃度NAA 再生苗生根（誘導(dǎo)45 d）和移栽的影響

2.2 潮霉素對(duì)西伯利亞百合鱗片外植體再生的影響

鱗片接種到含Hy 的培養(yǎng)基10 d 后開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，Hy 濃度越高褐化越嚴(yán)重。培養(yǎng)30 d 后Hy 80 中的鱗片全部死亡，因此鱗片Hy 抗性選擇壓以80 mg/L 為宜。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Hy 不但抑制鱗片外植體的分化出芽，還強(qiáng)烈抑制分化生根和根的生長(zhǎng)，培養(yǎng)30 d 平均根長(zhǎng)0.6 cm，與對(duì)照平均根長(zhǎng)2.9 cm 差異明顯。

3 討論

建立百合高頻再生體系可用的外植體材料很多[4]，本實(shí)驗(yàn)采用無菌苗的鱗片為轉(zhuǎn)化材料，有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）有效避免材料污染和表面消毒引起的外植體褐變；（2）轉(zhuǎn)化材料不受季節(jié)限制；（3）通過直接分化途徑獲得再生，避免愈傷組織再生發(fā)生變異[5-6]；（4）再生芽多分化在切口處，利于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染以此多獲得轉(zhuǎn)化植株。最后，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)再生芽分布在鱗片下部的居多，上部次之，兩側(cè)最少，這可能和鱗片內(nèi)部的激素分布有關(guān)。