科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)和功能群特征*

趙珮杉 郭米山 高廣磊 丁國棟 張 英

(1.北京林業(yè)大學水土保持學院 水土保持國家林業(yè)和草原局重點實驗室 北京 100083；2.寧夏鹽池毛烏素沙地生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站 鹽池 751500)

根際微生物是連接根系與土壤的重要紐帶(Puglisietal.， 2013； Becketal.， 2015)，根內(nèi)真菌定殖(或部分定殖)于植物根內(nèi)，其多樣性和群落結(jié)構(gòu)與宿主植物的生長、發(fā)育和更新能力存在密切關(guān)系(Philippotetal.， 2013； Baldrian， 2017)。一般來說，根內(nèi)真菌可分為寄生真菌、腐生真菌和共生真菌3種類型(Bonitoetal.， 2016； Kilpelainenetal.， 2016)。其中，寄生真菌誘發(fā)植物病害，威脅森林生態(tài)系統(tǒng)健康； 腐生真菌是生態(tài)系統(tǒng)重要的分解者，參與生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化和能量循環(huán)(Mooreetal., 2004)； 共生真菌主要為菌根真菌，能夠促進宿主植物吸收水分和礦物質(zhì)養(yǎng)分，協(xié)助植物提高抗逆性和適應(yīng)性(Frewaetal.， 2018； Martinetal.， 2017)。因此，根內(nèi)真菌組成及其功能直接影響宿主植物的生長和健康狀況，與生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性存在密切聯(lián)系。

一般來說，根內(nèi)真菌對宿主植物常表現(xiàn)出特定偏好，具有宿主特異性，這一現(xiàn)象在植物組成豐富多樣的天然次生林中尤為明顯(Tojuetal., 2013a； Picklesetal., 2015)。但在干旱荒漠地區(qū)，降水稀少，植被單一、稀疏，部分根內(nèi)真菌也表現(xiàn)出較強的普適性，能廣泛定殖于多種宿主植物(Botnenetal.， 2014； Mergesetal., 2018)。根內(nèi)真菌分布及其選擇宿主植物的影響因素較為復雜，既依賴于宿主植物特性，又與環(huán)境條件密切相關(guān)。在大空間尺度水平，氣候和生境條件是造成植物根內(nèi)真菌組成差異的主要原因(Davidetal.， 2016； Barnesetal.， 2016a)； 而在小空間尺度水平，土壤理化性質(zhì)則是根內(nèi)真菌物種豐度和組成變化的主要影響因素(Gaoetal., 2015； Liuetal.， 2015)。林齡即是林分的重要屬性特征，又對林下土壤理化性質(zhì)有重要影響(Gaoetal.， 2014)。已有研究表明，林齡是影響根內(nèi)真菌定殖的重要因子(Kyaschenkoetal.， 2017)，宿主植物受病原菌侵害程度與林齡密切相關(guān)(Sangüesa-Barredaetal.， 2015)，菌根真菌的侵染率、多樣性和群落組成均隨林齡的變化而變化(陳雪冬等， 2017； Spakeetal.， 2016)，在不同演替階段根內(nèi)真菌的優(yōu)勢菌種存在差異(Daveyetal.， 2015)。因此，針對干旱荒漠地區(qū)不同林齡固沙植被，探究其根內(nèi)真菌群落結(jié)構(gòu)和功能群特征，對植被恢復和森林撫育管理具有重要意義。

樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)天然分布于呼倫貝爾紅花爾基地區(qū)，具有適應(yīng)性強、耐低溫干旱、生長迅速等特點(任悅等， 2018)，是我國干旱、半干旱和亞濕潤干旱區(qū)防風治沙的重要常綠喬木樹種(朱教君等， 2007)。鑒于此，本研究以科爾沁沙地樟子松人工林為研究對象，基于高通量測序和真菌功能群劃分，比較分析不同林齡樟子松根內(nèi)真菌多樣性、群落組成和真菌營養(yǎng)類型特征，以期為樟子松人工林經(jīng)營管理提供依據(jù)。

1 研究區(qū)概況

研究區(qū)位于科爾沁沙地東南部的遼寧省彰武縣章古臺沙地森林公園(42°23′N，122°22′E)，海拔226.5 m。屬溫帶亞濕潤大陸性季風氣候，光照充足，晝夜溫差大。年均氣溫8 ℃，年均降水量526.5 mm，年蒸發(fā)量約1 932.7 mm，年均日照時數(shù)為2 615.2 h。土壤類型為風沙土。研究區(qū)常見植物包括樟子松、胡枝子(Lespedezabicolor)、小葉錦雞兒(Caraganamicrophylla)、狗尾草(Setariaviridis)、羊草(Leymuschinensis)、冰草(Agropyroncristatum)等。

2 研究方法

2.1 樣品采集與處理

2017年7月，在26、33和43年生樟子松人工林內(nèi)各設(shè)置1個50 m×50 m的樣地(以下簡稱26a、33a和43a)。對每個樣地內(nèi)所有樟子松進行樹高和胸徑的測量并進行相關(guān)調(diào)查，詳情見表1。每個樣地隨機選取間距8 m以上的5株標準木作為采樣對象。采樣時，先用鐵鍬除去林木基部半徑2 m內(nèi)的地表覆蓋物，后沿其根部小心挖至根的末級，剔除雜根。將3個樣地共15株樟子松細根樣品及少量新鮮土壤(保鮮根樣)分別裝入塑封袋中并編號，并置于4 ℃便攜式保溫箱內(nèi)帶回。同時，采集適量根系附近土壤樣品用于土壤理化性質(zhì)分析。

2.2 根內(nèi)真菌的分子鑒定

根系樣品帶回后保存于-80 ℃冰箱。試驗時，用蒸餾水輕輕沖洗根樣以去除雜物，并剪成10 cm左右的根段，洗凈后將同一樣地的根尖樣品充分混合，再隨機分成5份作為重復組。參照PowerSoil? DNA Kit(MO BIO公司)試劑盒說明書對根尖樣品進行DNA提取。采用PCR對根內(nèi)真菌的rDNA ITS區(qū)進行擴增，真菌通用引物為 ITS1F(5’-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’)和 ITS2(5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’)，每個樣本重復3次。對PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測，合格后使用Illumina MiSeq平臺進行上機測序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST 分析對相似性≥97% OTU序列進行比對，并注釋其群落的物種信息，注釋遵循以對比相似度≥97%鑒定到種水平，相似度介于90%～97%之間則可鑒定到屬水平(Kennedyetal.， 2010)。

表1 樣地概況Tab.1 Basic characteristics of the three sampling plots

2.3 真菌功能類群分析

利用FUNGuild v1.0將樟子松根內(nèi)真菌劃分為不同的營養(yǎng)型和功能群(表2)，結(jié)果數(shù)據(jù)僅保留置信度為“很可能”(Probable)和“極可能”(Highly probable)的OTUs及其類別； 將營養(yǎng)類型鑒定為復合營養(yǎng)型的群落全部納入“其他真菌”(Other fungi)，功能群鑒定為復合多功能方式的群落分別統(tǒng)一為該營養(yǎng)型下的“其他病理/腐生真菌”(Other pathogenic/saprotrophic fungi)(Nguyenetal., 2016)。

表2 真菌營養(yǎng)型和功能群的劃分Tab.2 Classification of trophic mode and guild for fungi

2.4 土壤理化性質(zhì)測定

采用環(huán)刀烘干稱重法測定土壤孔隙度(total soil porosity,TSP)和土壤含水量(soil water content,SWC)，采用pH分析儀(上海雷磁，中國)測定土壤pH值，采用重鉻酸鉀外加熱法測定土壤有機碳(soil organic carbon,SOC)含量，采用全自動化學分析儀(Smartchem 200，意大利)測定土壤全氮(total nitrogen,TN)和全磷(total phosphorus,TP)含量。

2.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)真菌類群在整體群落中的占比劃分優(yōu)勢度，占比≥10%為優(yōu)勢屬，1%～10%為常見屬，≤1%為稀有屬(譙利軍等， 2018)。采用SPSS 20進行數(shù)據(jù)處理與分析，包括最小顯著性差異法(LSD)和斯皮爾曼相關(guān)性檢驗(Spearman’s rank correlation)，運用R 3.5.1進行Shannon、Simpson和Pielou多樣性指數(shù)及物種相關(guān)性矩陣計算，采用OriginPro 2017和Cytoscape繪圖和輸出結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 樟子松根內(nèi)真菌alpha多樣性

從科爾沁沙地26a、33a和43a樣地樟子松根尖樣品中共獲得根內(nèi)真菌高質(zhì)量ITS序列384 016條及可劃分OTU數(shù)量832個。如表3所示，隨著林齡的增加，樟子松根內(nèi)真菌Shannon、Simpson和Pielou指數(shù)逐漸增大，均在43a樣地中達到最大值，分別是2.04、0.72和0.44，但不同林齡林分之間無顯著差異(P>0.05)。

表3 科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌多樣性指數(shù)①Tab.3 Diversity indices of fungi in roots of P. sylvestris var. mongolica in the Horqin Sandy Land

3.2 樟子松根內(nèi)真菌群落組成

科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌隸屬于5門16綱54目84科182屬。從門水平上看(圖1)，不同林齡均包含子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、接合菌門(Zygomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和球囊菌門(Glomeromycota)，且每種菌門在不同林齡中的相對豐度均不存在顯著差異(P>0.05)。子囊菌門的相對豐度隨林齡增加逐漸降低，由68.11%下降至57.79%。擔子菌門相對豐度隨林齡增加而增加，變化范圍為29.32%～38.41%。接合菌門相對豐度均值為2.99%，壺菌門和球囊菌門占所有根內(nèi)真菌的0.05%。

從屬水平上看(圖2)，各林齡沙地樟子松根內(nèi)真菌優(yōu)勢屬和常見屬共包括22屬。其中，26a樣地優(yōu)勢屬為鞘孢屬(Chalara)和肉座菌屬(Hypocrea)，33a樣地優(yōu)勢屬為Phialocephala、鞘孢屬和肉座菌屬，43a樣地優(yōu)勢屬為Phialocephal。26a、33a和43a樣地根內(nèi)真菌優(yōu)勢屬占所有真菌屬的比例分別為42.89%、47.58%和17.83%。26a、33a和43a樣地根內(nèi)真菌常見屬分別有10、9和18屬，占比分別為 46.19%、42.13%和72.34%。稀有屬個數(shù)和占比在不同林齡間相近，分別是128、130和126屬以及10.92%、10.30%和9.83%。隨著林齡增長，優(yōu)勢屬比例呈下降趨勢，常見屬呈增加趨勢，而稀有屬則保持在一個較為穩(wěn)定的水平。結(jié)合它們的相對豐度進行聚類分析(圖2)，26a和33a樣地聚合性較好，表明其2組根內(nèi)真菌組成結(jié)構(gòu)具有較高的相似度。

圖2 科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌聚類熱圖Fig.2 Cluster heatmap of fungi in roots of P. sylvestris var. mongolica in the Horqin Sandy Land

圖1 科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌門的相對豐度Fig.1 The relative abundance of fungi in roots of P. sylvestris var. mongolica in the Horqin Sandy Land

3.3 沙地樟子松根內(nèi)真菌生態(tài)功能群

科爾沁沙地樟子松不同營養(yǎng)型真菌相對豐度隨著林齡的增加呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(圖3)。病理營養(yǎng)型真菌相對豐度呈現(xiàn)下降趨勢，由17.48%下降到7.73%，腐生營養(yǎng)型較為穩(wěn)定(7.84%～10.06%)，共生營養(yǎng)型則表現(xiàn)出較大波動，在26a、33a和43a樣地中的相對豐度分別為22.05%、38.90%和48.79%。其中，不同林齡中共生營養(yǎng)型根內(nèi)真菌主要由外生菌根真菌和內(nèi)生真菌組成，且均存在少量叢枝菌根真菌。26a和33a樣地的共有優(yōu)勢屬(鞘孢屬和肉座菌屬)均為復合營養(yǎng)型真菌，33a和 43a樣地的共有優(yōu)勢屬Phialocephala為內(nèi)生真菌。43a和33a樣地中相對豐度較高的乳菇屬(Lactarius)、絲蓋傘屬(Inocybe)、糙緣腺革菌屬(Amphinema)和須腹菌屬(Rhizopogon)均為共生營養(yǎng)型中的外生菌根真菌。

圖3 科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌功能群的網(wǎng)絡(luò)分布Fig.3 Function network of fungi in roots of P. sylvestrisvar. Mongolica in the Horqin Sandy Land不同真菌營養(yǎng)型在各樣地中的相對豐度用扇形圖表示,真菌屬在不同林齡的相對豐度由邊厚度表示,節(jié)點的面積表示所有樣品中屬的絕對豐度,不同林齡根內(nèi)真菌共16個優(yōu)勢屬和常見屬被可靠鑒定。The pie diagram indicates the relative abundance of trophic mode in different age groups, the thickness of links indicates the relative abundance of genera, the square measure of nodes roughly represents the absolute abundance of genera in all samples, 16 dominant genera and common genera were identified reliably.

3.4 土壤理化性質(zhì)對根內(nèi)真菌多樣性和營養(yǎng)型的影響

不同林齡樟子松根圍土壤的理化性質(zhì)如圖4所示。 26a樣地中土壤含水量顯著高于33a和43a樣地(P<0.05)，土壤有機碳、全氮和全磷含量均呈隨林齡增加而均出現(xiàn)顯著升高(P<0.05)，表明土壤養(yǎng)分含量上升。根系周圍土壤理化性質(zhì)與根內(nèi)真菌多樣性指數(shù)和根內(nèi)真菌營養(yǎng)型相對豐度的相關(guān)性如表4所示，根內(nèi)真菌多樣性與土壤理化性質(zhì)均無顯著相關(guān)關(guān)系(P>0.05)，不同真菌營養(yǎng)型中僅共生營養(yǎng)型真菌相對豐度與土壤含水量顯著負相關(guān)(P<0.05)。

圖4 科爾沁沙地樟子松根圍土壤理化性質(zhì)Fig.4 Soil properties of rhizospheric soil under P. sylvestris var. mongolica in the Horqin Sandy LandSWC： 土壤含水量Soil water content; TSP： 土壤孔隙度Total soil porosity; SOC： 有機碳Soil organic carbon; TN： 全氮Total nitrogen; TP： 全磷Total phosphorus. 下同The same below.

表4 沙地樟子松根內(nèi)真菌多樣性和營養(yǎng)型相對豐度與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性①Tab.4 Correlation coefficients between diversity and relative abundance of the trophic mode with soil properties

4 討論

4.1 科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌多樣性和群落組成

土壤真菌多樣性指數(shù)的高低代表著群落穩(wěn)定性和抵抗力強弱(高尚坤等， 2018)，43a樣地中樟子松根內(nèi)真菌群落抗擾能力強于26a和33a樣地，這對樟子松的健康生長具有積極效應(yīng)。眾所周知，植物根內(nèi)真菌豐富度和多樣性常受土壤pH值和有機質(zhì)含量等因素影響(Toljanderetal., 2006； Barnesetal.， 2016b)，然而沙地樟子松根內(nèi)真菌多樣性與環(huán)境干擾因素的相關(guān)性較差，這種現(xiàn)象在先前研究中同樣存在(Jumpponenetal., 2014； Entwistleetal., 2013)，這是因為真菌多樣性與環(huán)境因子的相關(guān)性取決于所處生態(tài)系統(tǒng)的范圍和類型，在某些生態(tài)系統(tǒng)中真菌對氣候變化的承受力具有較大彈性(Zhengetal., 2017)。

從門水平上看，科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌主要由子囊菌門和擔子菌門組成，其余為少量結(jié)合菌門及極少量壺菌門和球囊菌門，這與櫟樹(Quercus)和極地柳(Salixpolaris)等外生菌根依賴型樹種根內(nèi)真菌群落組成結(jié)果相似(Tojuetal., 2013b； Kernaghanetal., 2011)。其中，不同林齡中子囊菌門相對豐度均高于擔子菌門，一是因為子囊菌的進化速度和物種多樣性均高于擔子菌(王海英等, 2010)，在干旱地區(qū)的適應(yīng)性更強； 二是因為沙地土壤中養(yǎng)分含量較低，而子囊菌門包含的許多腐生真菌能將難降解性有機質(zhì)分解、促進營養(yǎng)元素礦化過程，使土壤中養(yǎng)分含量增加并提高可利用率，從而間接影響著植物的生長(Barnesetal., 2018)。從屬水平上看，沙地樟子松根內(nèi)真菌優(yōu)勢屬為鞘孢屬、肉座菌屬和Phialocephala，其中： 鞘孢屬被認為是造成植物枯梢的植物病原菌(Tuliketal., 2018)，肉座菌屬是通過產(chǎn)生抗生素抑制植物病原真菌的腐生真菌(Jaklitsch, 2009)，而FUNGuild卻將鞘孢屬鑒定為復合營養(yǎng)型，肉座菌屬鑒定為病理營養(yǎng)型，這可能是因為內(nèi)生真菌在發(fā)育階段的不穩(wěn)定性導致它們不停地改變生態(tài)策略，于是生活史復雜的病原菌在不同的宿主中表現(xiàn)出不同的生活狀態(tài)(Arnoldetal., 2007)； 也可能是伴隨著根內(nèi)真菌所在植物根系組織的死亡，其為維持正常的生理活動而改變自身的營養(yǎng)方式(Paulin-Mahadyetal., 2002)。Phialocephala為常出現(xiàn)于健康植物中的深色有隔內(nèi)生真菌(dark septate endophytes,DSE)，在針葉樹種DSE中占主要地位(Suronoetal., 2018)，它能激發(fā)植物對非生物脅迫的抗性，加速根系內(nèi)物質(zhì)運輸和礦化作用，抑制根系病原菌(Mandyametal., 2005； Tellenbachetal., 2013)?？傮w上看，不同林齡沙地樟子松根內(nèi)真菌優(yōu)勢屬和常見屬的種類和占比波動較大，出現(xiàn)真菌組成異質(zhì)性的原因可能是林齡影響了宿主植物根系分泌物的組成成分(李嬌等， 2014)，而不同根系分泌物將直接影響根際微生物的數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)(Lladóetal., 2018)。

4.2 科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌生態(tài)功能特征

植物根系中不同營養(yǎng)型真菌之間相互促進與制約，根內(nèi)真菌功能群結(jié)構(gòu)組成與植物生長發(fā)育狀況密不可分。43a和33a樣地中，相對豐度高于26a樣地的根內(nèi)真菌為乳菇屬、絲蓋傘屬、糙緣腺革菌屬和須腹菌屬，它們均為樟子松林常見的外生菌根真菌(郭米山等, 2018)，這證實了外生菌根真菌多樣性在森林發(fā)育的前30～40年增長較快(Wuetal., 2013； Wallanderetal., 2010)。共生營養(yǎng)型真菌的增加同時對病理營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型真菌產(chǎn)生影響： 一方面，共生營養(yǎng)型真菌可對植物致病菌產(chǎn)生拮抗作用，減少病原菌的定殖以保護植物免受病害(Nagyetal.， 2013； Frewaetal., 2018)，導致病理營養(yǎng)型真菌不斷減少； 另一方面，菌根真菌(尤其是外生菌根真菌)對土壤中營養(yǎng)物質(zhì)的大量攝取，腐生真菌和其他微生物分解者受到抑制(Grauetal., 2017)。因此，即使土壤養(yǎng)分含量隨林齡增加，科爾沁沙地樟子松根內(nèi)腐生營養(yǎng)型真菌相對豐度一直處于較為平穩(wěn)的水平。沙地樟子松根內(nèi)真菌營養(yǎng)型結(jié)構(gòu)隨林齡的變化表現(xiàn)出一定的波動，共生營養(yǎng)型真菌占優(yōu)勢時宿主的抗擾能力增加(Chuetal., 2016)，反之，若病理營養(yǎng)型和腐生營養(yǎng)型真菌比例高于共生營養(yǎng)型真菌，則極易導致植物病害發(fā)生(Millbergetal., 2015)。

土壤理化性質(zhì)和根內(nèi)真菌功能類型組成之間的因果關(guān)系難以確定，真菌自身生理活動直接影響土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康與穩(wěn)定，同時土壤水分和養(yǎng)分又是真菌的主要物質(zhì)來源(Lietal., 2018)。干旱區(qū)沙地樟子松的生長發(fā)育過程需要大量水分，增加共生真菌有助于植物根系從土壤中吸收水分(Groveretal., 2011)，從而導致土壤含水率降低。土壤pH值在土壤真菌群落組成和功能類型上的影響普遍存在(Barnesetal., 2018)，研究區(qū)沙地樟子松人工林根圍土壤pH值在6～7之間，并與根內(nèi)真菌功能群結(jié)構(gòu)無顯著相關(guān)性，這是因為真菌對pH值變化的敏感程度較低，具有較廣的土壤酸堿耐受范圍，且無明顯生長抑制區(qū)(許美玲等， 2004； Rousketal., 2010)。本研究中大部分土壤理化性質(zhì)并未與根內(nèi)真菌營養(yǎng)型組成出現(xiàn)顯著相關(guān)關(guān)系，這是因為宿主根系與根內(nèi)真菌保持著相對穩(wěn)定的供養(yǎng)和反饋相互作用(陳智裕等， 2017)，此時根系微環(huán)境已經(jīng)過強烈的環(huán)境過濾，改變土壤性質(zhì)對根內(nèi)真菌群落的變化影響程度較低(Becketal., 2015)。

值得注意的是，每個樣地的樟子松根尖樣品均鑒定出極少量的叢枝菌根真菌，同樣作為具有外生菌根真菌侵染偏好型的北美紅櫟(Quercusrubra)和赤松(Pinusdensiflora)根系中也發(fā)現(xiàn)了此類現(xiàn)象(Dickieetal., 2001； Tojuetal.， 2018a)。在26a和43a樣地根尖樣品中鑒定出的杜鵑花類菌根真菌粉枝孢屬(Oidiodendron)，在紙樺(Betulapapyrifera)、香脂冷杉(Abiesbalsamea)和白云杉(Piceaglauca)等非杜鵑花植物根系中也被鑒定出(Kernaghanetal., 2011)。這跨越了根據(jù)宿主植物種類對菌根真菌進行劃分的傳統(tǒng)分類模式，更進一步證實宿主與真菌共生體存在較強的環(huán)境依賴性(Tojuetal., 2018b)。

5 結(jié)論

1)科爾沁沙地樟子松根尖樣品共獲得832個OTUs，根內(nèi)真菌多樣性指數(shù)隨林齡的增加而不斷增大，但不同林齡樟子松人工林不存在顯著差異，且根內(nèi)真菌多樣性和土壤理化性質(zhì)無顯著相關(guān)關(guān)系。

2)不同林齡樟子松根內(nèi)真菌隸屬于5門16綱54目84科165屬，子囊菌門和擔子菌門為主要組成部分，根內(nèi)真菌優(yōu)勢屬包括鞘孢屬、肉座菌屬和Phialocephala。不同林齡根內(nèi)真菌群落組成存在異質(zhì)性，中優(yōu)勢屬和常見屬菌種類型和相對豐度變動較大。

3)科爾沁沙地樟子松根內(nèi)真菌功能群組成豐富，隨林齡的增加科爾沁沙地樟子松根內(nèi)共生營養(yǎng)型真菌急劇增加，同時病理營養(yǎng)型呈現(xiàn)下降趨勢，腐生營養(yǎng)型維持在一個穩(wěn)定水平。土壤含水量和共生營養(yǎng)型真菌相對豐度存在顯著相關(guān)關(guān)系。