• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    非洲豬瘟病毒MGF505-5R蛋白表達與純化

    2020-10-17 14:33:14張素玲岳亞男白晨雨郝麗影李向東逄文強田克恭
    河南農業(yè)科學 2020年10期
    關鍵詞:可溶性質粒蛋白質

    張素玲,吳 芃,岳亞男,白晨雨,郝麗影,李向東,逄文強,田克恭

    (國家獸用藥品工程技術研究中心,河南 洛陽 471003)

    非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)感染引起的一種高致死性傳染病。ASFV具有雙層囊膜結構,基因組大小約180~190 kb[1],編碼160多種蛋白質,其中50多種為病毒結構蛋白[2-3]。

    ASFV基因組包含幾個不同的多基因家族,其中MGF360和MGF505位于基因組高度可變的左端區(qū)域,由其編碼的蛋白質對ASFV的復制及感染均具有重要的影響[4-7]。ASFV編碼的多基因家族能夠抑制感染的巨噬細胞產生Ⅰ型IFN應答,MGF360和MGF530/505等多個基因缺失后,可導致Ⅰ型IFN在感染巨噬細胞中的誘導水平增加,且缺失后的毒株對Ⅰ型IFN敏感,表明這些基因具有抑制IFN應答和抗病毒狀態(tài)的功能[8-9]。敲除ASFV強毒株MGF360和MGF505/530中的多個基因后,病毒在巨噬細胞中的復制能力未受影響,但對家豬的致病力發(fā)生降低;該毒株免疫后能夠針對親本毒株提供較好的攻毒保護,其保護水平和免疫劑量、親本毒株類型和缺失的基因有關[10-12]。上述研究均表明,以多基因家族為靶點的基因缺失疫苗研制是ASFV免疫防控的重要方向之一。因此,體外表達具有生物學活性的MGF蛋白和制備相應的單克隆抗體或多克隆抗體成為免疫學診斷方法建立的前提。

    大腸桿菌是用于外源蛋白表達的常用宿主菌株,但是表達的外源蛋白易形成包涵體,不具有生物活性。利用能夠增強重組蛋白可溶性表達的融合標簽SUMO[13-14]、TrxA[15]、GST[16]、MBP[17]和NusA[18]可以提高外源蛋白在大腸桿菌中的可溶性表達水平。鑒于此,通過標簽篩選、優(yōu)化表達和純化條件,以獲得高純度可溶性ASFV MGF505-5R蛋白,并制備特異性的多克隆抗體,旨在為ASFV基因缺失疫苗的免疫學鑒別診斷方法的建立奠定基礎。

    1 材料和方法

    1.1 質粒和菌株

    質粒pET28a購自Novagen公司;菌株DH5α、E.coliBL21(DE3)均購自天根生化科技(北京)有限公司;質粒pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP、pET28a-NusA均為國家獸用藥品工程技術研究中心構建。

    1.2 主要試劑

    DL2000 Marker、限制性內切酶和T4 DNA連接酶均購自Thermo Fisher公司;2×EasyTaqPCR SuperMix購自北京全式金生物技術有限公司;DNA膠回收試劑盒購自OMEGA公司;質粒提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;蛋白質預染Marker購自Thermo Fisher公司;Ni2+親和層析填料、MBP親和層析柱均購自美國GE Healthcare公司;羊抗鼠IgG-HRP二抗購自Abbkine公司;其他試劑均為分析純。

    1.3 方法

    1.3.1 基因的擴增及重組表達載體的構建 經過密碼子優(yōu)化的MGF505-5R基因由金唯智合成。根據(jù)合成的基因設計1對特異性引物,F(xiàn):5′-CGCGGATCCATGTTCTCTCTGCAGGAAAT-3′;R:5′-CCGCTCGAGTTATTCGTAACGCATGTCGG-3′,其中下劃線位置為酶切位點。以合成的MGF505-5R基因為模板進行PCR擴增并回收。將回收的MGF505-5R片段和pET28a載體同時用BamHⅠ和XhoⅠ進行雙酶切后回收,酶切產物經T4 DNA連接酶連接,構建pET28a-MGF505-5R載體。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,將菌液均勻涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落進行PCR鑒定并送金唯智進行測序。以國家獸用藥品工程技術研究中心前期構建的pET28a-SUMO、pET28a-TrxA、pET28a-GST、pET28a-MBP和pET28a-NusA5個質粒為模板,利用表1中的引物分別PCR擴增His-SUMO、His-TrxA、His-GST、His-MBP和His-NusA基因片段并回收。將回收的5個片段分別用NdeⅠ和BamHⅠ進行雙酶切后回收,然后分別與NdeⅠ和BamHⅠ酶切后的pET28a-MGF505-5R載體連接,構建pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R表達載體。連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞,涂布于含卡那霉素(100 mg/mL)LB平板上,37 ℃培養(yǎng)過夜。挑取單克隆菌落進行PCR鑒定并送金唯智進行測序,將5種測序正確的質粒分別轉化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞。

    表1 引物序列

    1.3.2 重組蛋白表達與可溶性分析 將5種重組質粒分別轉入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞,37 ℃培養(yǎng)過夜后挑取單克隆菌落接種于含有100 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,37 ℃搖床(220 r/min)過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)過夜的種子按1%的接種量接種于含卡那霉素的LB培養(yǎng)液中,37 ℃搖床(220 r/min)培養(yǎng)至OD600為0.5~0.6時,加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG,分別在20 ℃和28 ℃條件下誘導表達10 h。表達結束后,離心收集菌體細胞。按照菌體∶重懸液=1∶10的比例加入PBS,充分重懸菌體細胞。超聲破碎后,4 ℃、12 000 r/min離心30 min,分別收集上清和沉淀,進行SDS-PAGE檢測,采用灰度掃描分析法分析重組蛋白表達水平和可溶性。根據(jù)初步表達結果,選擇可溶性表達較好的菌株進行誘導劑含量和誘導時間的優(yōu)化,并進行SDS-PAGE檢測分析。

    1.3.3 重組蛋白的純化 取pET28a-MBP-MGF505-5R轉化的E.coliBL21(DE3)按照優(yōu)化的表達條件大量誘導表達。誘導后的菌體加PBS重懸后,800 bar高壓均質破碎。破碎后的樣品4 ℃、12 000 r/min離心1 h,取上清用0.45 μm濾膜過濾后,分別用Ni2+親和層析和MBP親和層析進行純化。Ni2+親和層析用咪唑梯度進行洗雜和洗脫,MBP親和層析選用麥芽糖梯度進行洗雜和洗脫。收集的洗脫蛋白用PBS緩沖液透析后,加入TEV蛋白酶將MBP標簽蛋白切除,然后加入Ni2+填料,4 ℃過夜孵育吸附MBP標簽蛋白,離心取上清用12% SDS-PAGE檢測。

    1.3.4 動物免疫 MGF505-5R蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1混合后乳化,以每只小鼠100 μg的劑量對6周齡雌性BALB/c小鼠進行皮下免疫;以弗氏不完全佐劑充分乳化MGF505-5R蛋白,并按相同方式和劑量于21、42、63 d進行免疫。最后一次免疫結束后7 d采血,分離血清,采用間接ELISA法檢測免疫血清的抗體效價。

    1.3.5 重組蛋白的Western blot分析 純化后的MGF505-5R蛋白電泳后,采用半干法將蛋白質轉移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,含5%脫脂牛奶粉的封閉液25 ℃封閉2 h,然后加入1∶500稀釋的鼠抗MGF505-5R蛋白血清,4 ℃孵育過夜后棄去,PBST反復洗滌3次。再加入1∶5 000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP二抗,室溫孵育1 h后棄去,PBST反復洗滌3次。用DAB顯色試劑盒顯色后,觀察結果。

    2 結果與分析

    2.1 MGF505-5R重組載體的構建與鑒定

    以合成的MGF505-5R基因為模板進行PCR擴增,1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1,從圖1可以看出,擴增的MGF505-5R基因片段大小約為1 500 bp,與預期結果一致。MGF505-5R基因片段與pET28a載體連接的質粒測序結果正確,表明pET28a-MGF505-5R載體構建成功。分別以國家獸用藥品工程技術研究中心前期構建的5種質粒為模板,利用表1中的引物分別擴增5種融合標簽蛋白的基因片段,擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2所示。從圖2可以看出,His-SUMO基因、His-TrxA基因、His-GST基因、His-MBP基因和His-NusA基因片段大小分別約為350、300、700、1 000 bp和1 500 bp,均與預期基因片段大小相符。將5種重組質粒分別測序,測序結果與模板堿基序列一致,表明重組表達載體pET28a-SUMO-MGF505-5R、pET28a-TrxA-MGF505-5R、pET28a-GST-MGF505-5R、pET28a-MBP-MGF505-5R和pET28a-NusA-MGF505-5R均構建成功。

    M:DL2000 Marker;1:MGF505-5R基因

    M:DL2000;1:His-SUMO基因;2:His-TrxA基因;3:His-GST基因;4:His-MBP基因;5:His-NusA基因

    2.2 MGF505-5R重組蛋白表達與可溶性分析

    分別取5種菌株表達的上清和沉淀20 μL,加入5 μL 5×Loading Buffer,沸水加熱10 min,進行SDS-PAGE檢測分析。從圖3可以看出,28 ℃誘導表達時,5種菌株均大量表達重組蛋白,但是均為包涵體;20 ℃誘導表達時,SUMO-MGF505-5R、GST-MGF505-5R和TrxA-MGF505-5R重組蛋白仍為不溶性的包涵體,NusA-MGF505-5R和MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達水平提高,其中MBP-MGF505-5R蛋白的可溶性表達水平經過灰度掃描分析可知提高約20%。

    A:重組蛋白28 ℃誘導表達結果(M:蛋白質Marker;1、3、5、7、9、11分別為28 ℃誘導表達后的全菌裂解上清;2、4、6、8、10、12分別為28 ℃誘導表達后的全菌裂解沉淀);B:重組蛋白20 ℃誘導表達結果(M:蛋白質Marker;1、3、5、7、9、11分別為20 ℃誘導表達后的全菌裂解上清;2、4、6、8、10、12分別為20 ℃誘導表達后的全菌裂解沉淀)

    對MBP-MGF505-5R重組蛋白的表達條件進行了優(yōu)化,即在20 ℃條件下,設置IPTG濃度梯度:0.2、0.5、0.8 mmol/L,分別誘導8 h和12 h取樣檢測分析MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達水平。從圖4可以看出,當IPTG濃度為0.5 mmol/L時,MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達量最高,但是進一步增加誘導劑濃度到0.8 mmol/L時,MBP-MGF505-5R重組蛋白可溶性表達水平下降,說明最適誘導劑濃度為0.5 mmol/L。在IPTG濃度為0.5 mmol/L的誘導條件下,誘導時間增加,MBP-MGF505-5R重組蛋白的可溶性表達量提高。

    A:重組蛋白誘導表達8 h結果(M:蛋白質Marker;1、3、5分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達8 h后的全菌裂解上清;2、4、6分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達8 h后的全菌裂解沉淀);B:重組蛋白誘導表達12 h結果(M:蛋白質Marker;1、3、5分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達12 h后的全菌裂解上清;2、4、6分別為IPTG濃度為0.2、0.5、0.8 mmol/L誘導表達12 h后的全菌裂解沉淀)

    2.3 MBP-MGF505-5R重組蛋白的純化

    MBP-MGF505-5R重組蛋白N端含有6×His融合標簽,可以利用MBP 親和層析和Ni2+親和層析進行純化。為了獲得純度較高的目的蛋白,分別進行上述2種純化試驗。洗脫的MBP-MGF505-5R重組蛋白12%進行SDS-PAGE檢測,結果(圖5A)顯示,目的蛋白分子質量約為100 ku?;叶葤呙璺治鼋Y果顯示,Ni2+親和層析純化后純度約為80%,MBP親和層析純化后純度大于90%。去除MBP標簽后,經12% SDS-PAGE檢測,結果(圖5B)顯示,MGF505-5R分子質量約為55 ku。

    A:MBP-MGF505-5R重組蛋白的純化(M:蛋白質Marker;1:MBP親和層析純化MBP-MGF505-5R重組蛋白;2:Ni2+親和層析純化MBP-MGF505-5R重組蛋白);B:MGF505-5R蛋白的純化(M:蛋白質Marker;1:MGF505-5R蛋白)

    2.4 MGF505-5R蛋白多克隆抗體的制備

    用純化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠后,采集并分離小鼠血清進行間接ELISA檢測血清效價,結果顯示,免疫后的小鼠血清效價達到1∶12 800以上,表明MGF505-5R蛋白活性良好,具有免疫原性,能夠刺激機體產生抗體。

    2.5 MGF505-5R蛋白的生物活性分析

    Western blot結果顯示,PVDF膜上出現(xiàn)了分子質量約為55 ku的特異性條帶,表明MGF505-5R蛋白活性良好,且免疫小鼠后能產生特異性抗體(圖6)。

    M:蛋白質Marker;1:MGF505-5R蛋白

    3 結論與討論

    ASFV基因組可編碼多種蛋白質,用于調控宿主細胞蛋白質表達、干擾宿主天然免疫系統(tǒng)和調控細胞周期等,從而抑制和逃避宿主的免疫應答,其中ASFV編碼的免疫逃避蛋白MGF360和MGF505/530是基因缺失疫苗研制的主要靶標之一。KING等[19]將ASFV弱毒株OURT88/3進行了部分MGF基因的缺失,與親本病毒相比,MGF基因缺失毒株可以誘導產生較高水平的IFN,且可提供針對同源病毒的保護力。因此,多基因家族基因缺失疫苗有望應用于臨床,成為預防非洲豬瘟的商業(yè)化疫苗。吳映彤[20]建立了針對MGF360-12L和MGF360-13L的分子檢測方法,并利用大腸桿菌原核表達載體對MGF360-12L和MGF360-13L蛋白進行了表達,并對表達的MGF360-12L和MGF360-13L包涵體蛋白進行了純化,為多克隆抗體的制備和間接ELISA檢測方法的建立奠定了基礎。包涵體蛋白因其空間結構不正確,可能不具有生物學活性。因此,利用具有生物學活性的多基因家族蛋白制備相應的單克隆抗體或多克隆抗體,對多基因家族基因缺失疫苗的免疫學鑒別診斷具有重要意義。

    本研究選用原核表達系統(tǒng),通過標簽篩選成功獲得了可溶性的ASFV MBP-MGF505-5R重組蛋白,并利用純化后的MGF505-5R蛋白免疫小鼠制備了特異性的多克隆抗體。ASFV強毒或弱毒株缺失MGF360和MGF530/505基因后免疫動物,可以提供針對同源病毒或部分異源病毒的攻毒保護[21-22]。因此,本研究制備的多克隆抗體有望用于ASFV MGF505相關基因缺失疫苗的臨床免疫學鑒別檢驗,為進一步建立鑒別診斷方法奠定了基礎。

    猜你喜歡
    可溶性質粒蛋白質
    蛋白質自由
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:48
    人工智能與蛋白質結構
    海外星云(2021年9期)2021-10-14 07:26:10
    鮮地龍可溶性蛋白不同提取方法的比較
    中成藥(2018年8期)2018-08-29 01:28:34
    短乳桿菌天然質粒分類
    食品科學(2018年10期)2018-05-23 01:27:28
    蛋白質計算問題歸納
    重組質粒rAd-EGF構建并轉染hDPSCs對其增殖的影響
    可溶性Jagged1對大鼠靜脈橋狹窄的抑制作用
    可溶性ST2及NT-proBNP在心力衰竭中的變化和臨床意義
    Survivin-siRNA重組質粒對人神經母細胞瘤細胞SH-SY5Y的作用
    BAG4過表達重組質粒構建及轉染結腸癌SW480細胞的鑒定
    青春草国产在线视频 | 美女内射精品一级片tv| 热99re8久久精品国产| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 特级一级黄色大片| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久久久久大精品| 麻豆国产av国片精品| 色尼玛亚洲综合影院| 欧美变态另类bdsm刘玥| 此物有八面人人有两片| 波多野结衣高清作品| 久久午夜福利片| 嘟嘟电影网在线观看| 精品久久久久久久久久免费视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 久久久精品欧美日韩精品| 日本欧美国产在线视频| 精品久久久噜噜| 美女脱内裤让男人舔精品视频 | 桃色一区二区三区在线观看| 中文字幕av在线有码专区| 在线a可以看的网站| 亚洲乱码一区二区免费版| 久久久久久国产a免费观看| 日本欧美国产在线视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 大型黄色视频在线免费观看| 九色成人免费人妻av| 99久久精品国产国产毛片| 久久精品国产亚洲av天美| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 亚洲美女视频黄频| 免费搜索国产男女视频| 国产av一区在线观看免费| 大香蕉久久网| 亚洲综合色惰| 国产成人影院久久av| 色尼玛亚洲综合影院| 白带黄色成豆腐渣| 少妇的逼好多水| 亚洲精品国产av成人精品| 色尼玛亚洲综合影院| 国产精品国产高清国产av| 深夜a级毛片| 偷拍熟女少妇极品色| 在现免费观看毛片| 久久久精品大字幕| 22中文网久久字幕| 亚洲内射少妇av| 精品欧美国产一区二区三| 高清毛片免费看| 大香蕉久久网| 草草在线视频免费看| 国产黄片视频在线免费观看| 女人被狂操c到高潮| av在线老鸭窝| 色视频www国产| 亚洲av一区综合| 国产黄色小视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 国产精华一区二区三区| 国产中年淑女户外野战色| 九九爱精品视频在线观看| 中文字幕久久专区| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久久久久久久久丰满| 99久久精品一区二区三区| 看免费成人av毛片| 国产精品一区二区性色av| 日本五十路高清| 高清日韩中文字幕在线| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 性插视频无遮挡在线免费观看| 最近的中文字幕免费完整| 久久精品国产亚洲av天美| 看黄色毛片网站| av.在线天堂| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品精品国产色婷婷| 亚洲欧美清纯卡通| 国产伦精品一区二区三区四那| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久久久久久午夜电影| 成人二区视频| 亚洲成人av在线免费| av免费在线看不卡| 99久国产av精品国产电影| 日韩视频在线欧美| 欧美又色又爽又黄视频| av视频在线观看入口| 成年av动漫网址| 插逼视频在线观看| 亚洲内射少妇av| 精品无人区乱码1区二区| 尾随美女入室| 国产私拍福利视频在线观看| 美女 人体艺术 gogo| 在线播放无遮挡| 少妇人妻一区二区三区视频| 能在线免费看毛片的网站| 国产成人精品一,二区 | 麻豆国产av国片精品| 欧美潮喷喷水| 久久国产乱子免费精品| av在线播放精品| 别揉我奶头 嗯啊视频| 小说图片视频综合网站| 有码 亚洲区| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 欧美日韩国产亚洲二区| 精品一区二区免费观看| 亚洲成人久久爱视频| 免费av观看视频| 日韩欧美精品v在线| av在线播放精品| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品综合久久久久久久免费| 岛国在线免费视频观看| 国产成人精品一,二区 | 亚洲av成人精品一区久久| 日韩欧美 国产精品| a级毛片a级免费在线| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品.久久久| 免费av毛片视频| 午夜精品在线福利| kizo精华| 婷婷六月久久综合丁香| 亚洲av免费高清在线观看| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久久九九精品影院| 久久亚洲国产成人精品v| 哪个播放器可以免费观看大片| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲无线在线观看| 国产高潮美女av| 亚洲自拍偷在线| 久久久成人免费电影| 在线免费观看的www视频| 国产视频首页在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 嘟嘟电影网在线观看| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 日本黄色视频三级网站网址| 国产高清激情床上av| 听说在线观看完整版免费高清| 97热精品久久久久久| 免费看av在线观看网站| 国产欧美日韩精品一区二区| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲av男天堂| 欧美激情在线99| 人妻系列 视频| 日韩大尺度精品在线看网址| 在线a可以看的网站| 在线观看一区二区三区| 99九九线精品视频在线观看视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 最近最新中文字幕大全电影3| 女同久久另类99精品国产91| 欧美成人免费av一区二区三区| 成人午夜精彩视频在线观看| 精品国产三级普通话版| 精品人妻熟女av久视频| 岛国毛片在线播放| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 三级毛片av免费| 不卡视频在线观看欧美| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 久久久久性生活片| 插逼视频在线观看| а√天堂www在线а√下载| 日本在线视频免费播放| 日日啪夜夜撸| 好男人视频免费观看在线| 亚洲丝袜综合中文字幕| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久久国产成人免费| 亚洲在久久综合| 丰满的人妻完整版| 一级黄片播放器| 亚洲色图av天堂| 国产黄a三级三级三级人| 男人狂女人下面高潮的视频| 两个人的视频大全免费| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 免费观看人在逋| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 日本免费一区二区三区高清不卡| 一区二区三区四区激情视频 | 久久久精品大字幕| 村上凉子中文字幕在线| 国产亚洲精品久久久com| kizo精华| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美极品一区二区三区四区| 久久久午夜欧美精品| 免费搜索国产男女视频| 尾随美女入室| 少妇的逼好多水| 成人亚洲精品av一区二区| 色哟哟哟哟哟哟| 国产精品精品国产色婷婷| 极品教师在线视频| 成人一区二区视频在线观看| 麻豆成人午夜福利视频| 高清在线视频一区二区三区 | 久久久久久久久久久丰满| 一个人看视频在线观看www免费| 只有这里有精品99| 国产黄a三级三级三级人| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 国产免费一级a男人的天堂| 男女下面进入的视频免费午夜| 久久精品影院6| 日韩欧美精品免费久久| 国产v大片淫在线免费观看| 尾随美女入室| 久久精品人妻少妇| 黑人高潮一二区| 国模一区二区三区四区视频| 国产精品蜜桃在线观看 | 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产中年淑女户外野战色| 国产免费男女视频| 婷婷色综合大香蕉| 一本久久中文字幕| 一级毛片aaaaaa免费看小| 边亲边吃奶的免费视频| 精品久久久久久久末码| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国国产精品蜜臀av免费| 亚洲人成网站高清观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 国产真实乱freesex| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久久久久国产a免费观看| 在线播放国产精品三级| www日本黄色视频网| 人妻少妇偷人精品九色| 国产成人精品久久久久久| 日韩成人av中文字幕在线观看| 黄色欧美视频在线观看| 国产精品,欧美在线| 国产单亲对白刺激| 99国产极品粉嫩在线观看| 一级毛片我不卡| 一个人看视频在线观看www免费| 一边亲一边摸免费视频| 乱码一卡2卡4卡精品| 91aial.com中文字幕在线观看| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 搡老妇女老女人老熟妇| av在线亚洲专区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 亚洲成人精品中文字幕电影| 久久人人爽人人片av| 亚洲第一区二区三区不卡| av视频在线观看入口| 国产成人午夜福利电影在线观看| 精品久久久久久久久av| 国产成人a区在线观看| 少妇丰满av| 最近的中文字幕免费完整| 高清午夜精品一区二区三区 | 永久网站在线| 午夜老司机福利剧场| 日本熟妇午夜| 亚洲av一区综合| 成人午夜精彩视频在线观看| 少妇的逼好多水| 午夜久久久久精精品| 成人三级黄色视频| 又爽又黄无遮挡网站| 欧美精品一区二区大全| 久久久久网色| 小说图片视频综合网站| 久久午夜福利片| 国产精品乱码一区二三区的特点| 欧美日韩乱码在线| 91狼人影院| 有码 亚洲区| 十八禁国产超污无遮挡网站| 丰满的人妻完整版| 亚洲第一电影网av| 婷婷色综合大香蕉| 晚上一个人看的免费电影| 日日啪夜夜撸| 日韩一区二区三区影片| 日本五十路高清| 国产精品一区www在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 大香蕉久久网| 色播亚洲综合网| 精品少妇黑人巨大在线播放 | 青春草国产在线视频 | 亚洲人与动物交配视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 国产91av在线免费观看| 国产 一区精品| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲一区二区三区色噜噜| 能在线免费看毛片的网站| 免费无遮挡裸体视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产激情偷乱视频一区二区| 国产黄a三级三级三级人| 国产成人精品一,二区 | 少妇的逼水好多| 日韩三级伦理在线观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| avwww免费| 国产精品伦人一区二区| 国产 一区精品| 桃色一区二区三区在线观看| 黄片无遮挡物在线观看| 国产单亲对白刺激| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 国产精品一二三区在线看| 日本免费一区二区三区高清不卡| 国产成人aa在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 99riav亚洲国产免费| 夫妻性生交免费视频一级片| 一级毛片我不卡| 免费av不卡在线播放| 精品免费久久久久久久清纯| 97超碰精品成人国产| 国产精品日韩av在线免费观看| 午夜精品一区二区三区免费看| av免费在线看不卡| 久久久久久久亚洲中文字幕| 亚洲av成人av| 联通29元200g的流量卡| 国产精品日韩av在线免费观看| 欧美最黄视频在线播放免费| 波多野结衣高清作品| 久久久久久久亚洲中文字幕| 天堂√8在线中文| 国产色婷婷99| 国产精品日韩av在线免费观看| 亚洲丝袜综合中文字幕| 久久久久久大精品| 中国美白少妇内射xxxbb| 嫩草影院精品99| 午夜视频国产福利| av在线天堂中文字幕| 97超碰精品成人国产| 亚洲最大成人av| 看片在线看免费视频| 一边亲一边摸免费视频| 中文字幕av在线有码专区| 亚洲精品国产成人久久av| a级一级毛片免费在线观看| 精品久久国产蜜桃| 午夜视频国产福利| 欧美性感艳星| 黄色配什么色好看| 欧美成人a在线观看| 黄色日韩在线| 禁无遮挡网站| ponron亚洲| 久99久视频精品免费| 边亲边吃奶的免费视频| 99热6这里只有精品| 大型黄色视频在线免费观看| 国产视频内射| 美女大奶头视频| 特大巨黑吊av在线直播| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久久久久久久久久丰满| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 热99在线观看视频| 国产av一区在线观看免费| 美女国产视频在线观看| 国产成人精品一,二区 | 色综合色国产| 日韩欧美精品免费久久| 麻豆久久精品国产亚洲av| 国产真实乱freesex| 中文字幕av成人在线电影| 午夜爱爱视频在线播放| 只有这里有精品99| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲av男天堂| 免费人成在线观看视频色| 麻豆国产97在线/欧美| 看黄色毛片网站| 国产精品精品国产色婷婷| 麻豆成人av视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲欧美日韩东京热| 一区二区三区四区激情视频 | 人妻少妇偷人精品九色| av在线观看视频网站免费| 国产单亲对白刺激| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 高清在线视频一区二区三区 | 日本免费a在线| 亚洲性久久影院| 精品免费久久久久久久清纯| 欧美最新免费一区二区三区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 热99re8久久精品国产| 日本与韩国留学比较| 国产单亲对白刺激| 99久久精品热视频| 中文字幕久久专区| 99九九线精品视频在线观看视频| 色综合色国产| 国产亚洲精品久久久com| 91久久精品电影网| 国产69精品久久久久777片| 久久精品国产自在天天线| 亚洲第一电影网av| 99在线人妻在线中文字幕| 久久久久久久久中文| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 色综合色国产| 日本欧美国产在线视频| 午夜福利在线在线| 精品久久久久久成人av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久久久久中文| 校园人妻丝袜中文字幕| 在线a可以看的网站| 国产精品嫩草影院av在线观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 婷婷色av中文字幕| 日韩制服骚丝袜av| 联通29元200g的流量卡| 免费大片18禁| 黄色日韩在线| 成人av在线播放网站| 人人妻人人澡欧美一区二区| 午夜精品国产一区二区电影 | 内地一区二区视频在线| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲丝袜综合中文字幕| 一夜夜www| 黄色日韩在线| 午夜爱爱视频在线播放| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 97超视频在线观看视频| 波多野结衣巨乳人妻| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩,欧美,国产一区二区三区 | 九九爱精品视频在线观看| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲精品日韩在线中文字幕 | 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲成人av在线免费| 久久久久网色| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 国产伦一二天堂av在线观看| videossex国产| 我的老师免费观看完整版| 国产中年淑女户外野战色| 久久精品国产自在天天线| 日本一本二区三区精品| 成人漫画全彩无遮挡| 网址你懂的国产日韩在线| 亚洲最大成人手机在线| 国产极品天堂在线| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 床上黄色一级片| 国产探花极品一区二区| 最近2019中文字幕mv第一页| 欧美日韩在线观看h| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲欧洲日产国产| 黄色一级大片看看| 亚洲最大成人手机在线| 91aial.com中文字幕在线观看| 高清在线视频一区二区三区 | 色播亚洲综合网| 精品一区二区三区人妻视频| 男人狂女人下面高潮的视频| 亚州av有码| 亚洲无线观看免费| 高清毛片免费观看视频网站| 久久99精品国语久久久| 国产精品永久免费网站| 亚洲无线在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久精品久久久久久噜噜老黄 | 大型黄色视频在线免费观看| 亚洲人成网站在线播| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产亚洲5aaaaa淫片| 99久久人妻综合| 欧美一区二区国产精品久久精品| 免费无遮挡裸体视频| 国产真实乱freesex| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久久精品大字幕| 搡老妇女老女人老熟妇| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美+日韩+精品| 禁无遮挡网站| 亚洲国产精品sss在线观看| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 欧美性猛交黑人性爽| 亚洲国产精品合色在线| 简卡轻食公司| 亚洲欧洲国产日韩| 日韩一区二区视频免费看| 国产高清有码在线观看视频| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲欧美精品综合久久99| 又粗又硬又长又爽又黄的视频 | 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 久久99热6这里只有精品| 丰满的人妻完整版| 日韩成人伦理影院| 一级毛片我不卡| 日本与韩国留学比较| 国产高清三级在线| 搡老妇女老女人老熟妇| 两个人的视频大全免费| 国产精品久久电影中文字幕| a级毛片免费高清观看在线播放| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 深爱激情五月婷婷| 日本-黄色视频高清免费观看| 久久精品久久久久久久性| 国产精品免费一区二区三区在线| 国产精品99久久久久久久久| 给我免费播放毛片高清在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 成人一区二区视频在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 亚洲精品自拍成人| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 嫩草影院精品99| av.在线天堂| 国产v大片淫在线免费观看| АⅤ资源中文在线天堂| 欧美不卡视频在线免费观看| 午夜激情欧美在线| 亚洲综合色惰| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲国产色片| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产成人午夜福利电影在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 免费观看a级毛片全部| 亚洲三级黄色毛片| 天天躁日日操中文字幕| 亚洲精品日韩在线中文字幕 | av在线天堂中文字幕| 国产午夜福利久久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 九九热线精品视视频播放| 熟女电影av网| 亚洲欧美精品综合久久99| 97在线视频观看| 99视频精品全部免费 在线| 美女高潮的动态| 99在线人妻在线中文字幕| 国产精品1区2区在线观看.| 色视频www国产| 国产av不卡久久| 免费av不卡在线播放| 啦啦啦啦在线视频资源| 九色成人免费人妻av| 一级黄色大片毛片| 免费看日本二区| 国国产精品蜜臀av免费| 高清午夜精品一区二区三区 | 波多野结衣高清作品| 三级经典国产精品| 亚洲成a人片在线一区二区| 丰满人妻一区二区三区视频av| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 热99re8久久精品国产| 亚州av有码| 亚洲色图av天堂| 色视频www国产| 亚洲精品粉嫩美女一区| 在线a可以看的网站| 国产一级毛片在线| 久久久精品94久久精品| 欧美三级亚洲精品| 国产91av在线免费观看| 欧美性感艳星| ponron亚洲| 十八禁国产超污无遮挡网站| 91久久精品国产一区二区成人| 久久99精品国语久久久|