復(fù)合菌種發(fā)酵煙葉產(chǎn)酶及揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)變化

帥 瑤，陶 菡，田運(yùn)霞，田永鋒，程 凱，何臘平

(1.貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽 550025; 2.云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，云南 昆明 650000)

煙葉發(fā)酵是改善煙葉品質(zhì)的重要手段。未經(jīng)處理的原料煙具有刺激性大、不協(xié)調(diào)等缺點(diǎn)，通過接種微生物對煙葉進(jìn)行人工發(fā)酵已成為改善煙葉品質(zhì)最常用的手段[1]。煙葉表面存在著大量微生物且種類繁多[2]，煙葉發(fā)酵是復(fù)雜微生物群落在結(jié)構(gòu)和組成上發(fā)生變化的過程[3]。目前，煙葉的人工控制發(fā)酵研究多采用單菌株發(fā)酵，利用復(fù)合菌株發(fā)酵煙葉的研究相對較少。但實(shí)踐發(fā)現(xiàn)，很多重要生化過程僅靠單株微生物不能完成或只能微弱地進(jìn)行, 必須依靠2種或多種微生物共同培養(yǎng)來完成[4]，即混菌發(fā)酵。混菌發(fā)酵，是采用2種或多種微生物的協(xié)同作用共同完成某種發(fā)酵過程，是純種發(fā)酵技術(shù)的新發(fā)展，也是一種不需要進(jìn)行復(fù)雜的DNA體外重組卻可取得類似效果的新型發(fā)酵技術(shù)。研究表明，混合菌種發(fā)酵的產(chǎn)品品質(zhì)明顯強(qiáng)于單一菌種發(fā)酵[5]。近年來，通過在煙草發(fā)酵過程中選擇適當(dāng)?shù)奈⑸锖瓦m宜的發(fā)酵條件，來提高煙葉的質(zhì)量和香氣[6]、生產(chǎn)或提高酶活力[7]已有報(bào)道。馮穎杰等[8]利用鞘氨醇單胞菌Sphingomonassp.XP降解復(fù)烤后煙葉中的多酚類物質(zhì)；李浩宇等[9]篩選出菌株后，添加到煙葉進(jìn)行發(fā)酵從而改善煙葉品質(zhì)；李士林等[10]等利用從煙葉篩出的耐高溫菌株進(jìn)行發(fā)酵，通過降解淀粉和蛋白質(zhì)提高煙葉品質(zhì)。鑒于此，利用貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院食品工業(yè)應(yīng)用微生物課題組(以下簡稱課題組)篩選出的具有煙葉提質(zhì)效果的GUHP86、GZU03菌株進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵，研究其發(fā)酵特性，建立合適的發(fā)酵工藝，并對其進(jìn)行氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)檢測揮發(fā)性風(fēng)味成分，分析微生物發(fā)酵對煙葉風(fēng)味的影響。通過復(fù)合菌種進(jìn)行煙葉發(fā)酵，建立發(fā)酵工藝，分析揮發(fā)性風(fēng)味成分與煙葉品質(zhì)之間的關(guān)系，為生產(chǎn)高質(zhì)量煙葉提供混菌發(fā)酵工藝。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑

口含煙煙草原料大理紅大CL314由云南工業(yè)有限責(zé)任公司提供。

菌種為課題組篩選出的解淀粉芽孢桿菌GUHP86(中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC M 2016003)，拉丁文學(xué)名：Bacillusamyloliquefaciens；GZU03(中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏編號CCTCC M 2018762)。

福林酚試劑購自上海源葉生物科技有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)色譜純或分析純，購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基和有糖鹽溶液配制 種子液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨1.25 g/L、酵母提取物0.625 g/L、NaCl 6.25 g/L、葡萄糖0.625 g/L，配好后按三角瓶容量的20%分裝入三角瓶，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。含糖鹽溶液：準(zhǔn)確稱取MgCl25 g、KCl 0.5 g、CaCl20.5 g、NaCl 0.5 g、葡萄糖2 g，補(bǔ)水至1 000 mL，溶解滅菌后備用。

1.2.2 煙葉發(fā)酵 原料煙切絲，寬度1 mm左右，稱取20 g于121 ℃條件下滅菌5 min。解淀粉芽孢桿菌GUHP86、GZU03接種于種子液體培養(yǎng)基，于37℃、180 r/min培養(yǎng)18 h，培養(yǎng)液于4 ℃、8 000 r/min離心10 min，取菌體沉淀，加入等體積無菌生理鹽水重懸，得菌體重懸液。滅菌后煙葉置于密封袋內(nèi)，吸取適量菌體重懸液于煙葉，適量含糖鹽溶液于煙葉中，充分混勻，37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行發(fā)酵。每天對其進(jìn)行換氣。

1.2.3 煙葉發(fā)酵單因素試驗(yàn) 稱取煙葉20 g，切絲滅菌備用，固定接種量20%，發(fā)酵溫度37 ℃、發(fā)酵15 d。分別考察GZU03和GUHP86復(fù)配比例(1∶3、1∶1、3∶1、0∶4、4∶0)、葡萄糖添加量(0.04%、1.00%、2.00%、10.00%)、大豆蛋白添加量(0.50%、1.00%、1.50%、2.00%)、水分含量(30%、35%、40%、45%、50%)對煙葉感官及蛋白酶活力的影響。

1.2.4 煙葉發(fā)酵 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過Plackett-Burman試驗(yàn)對可能影響煙葉感官值的參數(shù)，包括復(fù)配比例、接種量、水分含量、葡萄糖添加量、大豆蛋白添加量進(jìn)行主效應(yīng)分析，選用n=5的設(shè)計(jì)，每個(gè)因素取高、低2個(gè)水平，以感官值為指標(biāo)，篩選出主要的影響指標(biāo)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)因素及水平

1.2.5 煙葉發(fā)酵中心組合設(shè)計(jì)(Central composite design,CCD)優(yōu)化設(shè)計(jì) 在Plackett-Burman試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇接種量和葡萄糖添加量為因素，采用CCD的設(shè)計(jì)方案，因素水平見表2。

表2 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)因子水平

1.2.6 感官評價(jià) 樣品制備及感官評價(jià)方法參照文獻(xiàn)[11]的方法，采用盲評的形式，總分100分，其中，入口口感、香味、勁頭、釋放均勻性各15分，刺激性、順應(yīng)性、滋味、余味各10分。

1.2.7 蛋白酶活力測定 精確稱取磨碎的煙草原料樣品1 g于燒杯中，用25 mL 磷酸鹽(PBS)緩沖溶液浸提24 h，然后用慢速定性濾紙過濾，濾液待用。蛋白酶活力參照GB/T 23527—2009標(biāo)準(zhǔn)[12]進(jìn)行測定。

1.2.8 GC-MS檢測揮發(fā)性風(fēng)味 將2 g煙葉放入10 mL頂空固相微萃取瓶中，將頂空瓶放入斯特斯(CTC)自動(dòng)進(jìn)樣器品盤，設(shè)置萃取條件為70 ℃保持5 min，70 ℃吸附30 min，萃取盤轉(zhuǎn)速為250 r/min，萃取得到的物質(zhì)在氣相色譜進(jìn)樣口進(jìn)行解吸附，解吸溫度250 ℃，時(shí)間5 min。

色譜柱:DB-wax(60 m×0.25 mm×0.25 mm)毛細(xì)管柱；進(jìn)樣口溫度240 ℃；載氣He，1.5 mL/min；分流比2∶1；升溫程序：初始溫度 40 ℃，保持 1 min，以10 ℃/min升至 120 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至230 ℃，保持5 min。傳輸線溫度：240 ℃；電離方式：EI；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；掃描范圍：33～350 amu；數(shù)據(jù)采集模式：全掃描。采用譜庫檢索定性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Design Expert 8.05b、Origin 9.0、SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析, 測定3次以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，根據(jù)單因素方差(One-Way ANOVA)方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性比較分析，P<0.05為數(shù)據(jù)之間存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合菌種接種比例對發(fā)酵煙葉品質(zhì)及蛋白酶活力的影響

解淀粉芽孢桿菌[13]發(fā)酵提高煙葉品質(zhì)主要是由于微生物可將煙葉中的有機(jī)成分(如淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì))用作自身代謝基質(zhì), 通過某些代謝途徑最終將有機(jī)大分子成分轉(zhuǎn)化為小分子物質(zhì)[14-15]。單獨(dú)GUHP86與GZU03發(fā)酵煙葉感官效果都有所提高，由此考慮復(fù)合菌發(fā)酵對煙葉品質(zhì)的影響。如圖1所示，與單菌發(fā)酵相比，復(fù)合菌種發(fā)酵后煙葉的感官品質(zhì)有所提升，且以 GZU03和GUHP86的比例為1∶1時(shí)進(jìn)行復(fù)合菌種發(fā)酵效果較好，此時(shí)煙葉的香氣較濃，刺激性較少，整體較為諧調(diào)。而單菌發(fā)酵的煙葉香氣稍差，不如復(fù)合菌種發(fā)酵煙葉諧調(diào)，說明復(fù)合菌種發(fā)酵提高了煙葉品質(zhì)。自然發(fā)酵煙葉幾乎不產(chǎn)蛋白酶，而混菌發(fā)酵煙葉產(chǎn)生了一定的蛋白酶活力，當(dāng)進(jìn)行復(fù)配時(shí)，可能會發(fā)生拮抗作用[16]從而導(dǎo)致蛋白酶活力下降。但是單獨(dú)的GUHP86雖然蛋白酶活力較高，然而感官值不是最高的，這說明感官值雖然與蛋白酶活力相關(guān)但并不是越高越好，過量易導(dǎo)致一些刺激性風(fēng)味如胺味等產(chǎn)生[17]。故選擇GUHP86與GZU03復(fù)合發(fā)酵煙葉，復(fù)配比例為1∶1。

不同小、大寫字母分別表示不同處理方式感官、蛋白酶活力具有顯著性差異(P<0.05)，下同

2.2 葡萄糖添加量對發(fā)酵煙葉品質(zhì)及蛋白酶活力的影響

葡萄糖易于被微生物直接利用，促進(jìn)微生物生長。如圖2所示，當(dāng)葡萄糖添加量為1.00%時(shí)，發(fā)酵煙葉感官值(P<0.05)和蛋白酶活力(P<0.05)最高，而自然發(fā)酵只在葡萄糖添加量為10.00%檢測到蛋白酶活力，而后在加菌發(fā)酵條件下繼續(xù)增大葡萄糖添加量，感官值降低，這主要是因?yàn)槠咸烟沁^多，煙葉甜度過高，對煙葉風(fēng)味有消極的影響。而且葡萄糖含量過高也會抑制代謝和產(chǎn)酶，故選擇葡萄糖添加量為1.00%進(jìn)行煙葉發(fā)酵。

Ⅰ—Ⅳ分別表示加菌發(fā)酵條件下葡萄糖添加量分別為0.04%、1.00%、2.00%、10.00%；Ⅴ—Ⅷ分別表示自然發(fā)酵條件下葡萄糖添加量分別為0.04%、1.00%、2.00%、10.00%

2.3 大豆蛋白添加量對發(fā)酵煙葉品質(zhì)及蛋白酶活力的影響

大豆蛋白[18]為微生物的生長提供了一定的營養(yǎng)物質(zhì)，對發(fā)酵煙葉感官品質(zhì)提高有一定的積極作用。由如圖3所示，當(dāng)加菌發(fā)酵，大豆蛋白添加量為1.00%時(shí)，感官值最高，為90.33，并且此時(shí)加菌發(fā)酵煙葉蛋白酶活力最高，為20.38 U/g。且添加大豆蛋白后，蛋白酶活力比未添加(圖2)時(shí)更高，說明大豆蛋白對蛋白酶產(chǎn)生有一定的促進(jìn)作用，故選擇大豆蛋白添加量為1.00%進(jìn)行煙葉發(fā)酵。

Ⅰ—Ⅳ分別表示加菌發(fā)酵條件下大豆蛋白添加量分別為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%；Ⅴ—Ⅷ分別表示自然發(fā)酵條件下大豆蛋白添加量分別為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%

2.4 水分含量對發(fā)酵煙葉品質(zhì)及蛋白酶活力的影響

水分是影響微生物生長的重要因素[19]，合適的含水量能為微生物提供更好的生存環(huán)境。水分主要影響發(fā)酵環(huán)境濕度，不同濕度對發(fā)酵煙葉品質(zhì)的影響是顯著的。由圖4可知，加菌發(fā)酵條件下，水分含量在30%～40%時(shí)，感官值隨著水分含量的增加而增加，當(dāng)水分含量為40%時(shí)，到達(dá)感官最高值并得到最高蛋白酶活力，而后隨著水分含量的增加，感官值逐漸下降。李晶晶等[20]研究發(fā)現(xiàn)，高濕環(huán)境下有利于抑制雪茄煙亞硝胺的產(chǎn)生和積累，李常軍等[21]等認(rèn)為，在高濕環(huán)境下有利于蛋白質(zhì)降解和氨基酸的積累。但高水分環(huán)境更適于霉菌的生長[22]，水分含量過高時(shí)，煙葉稍有發(fā)霉現(xiàn)象。結(jié)合感官和蛋白酶活力，選擇水分含量為40%進(jìn)行煙葉發(fā)酵。

Ⅰ—Ⅴ分別表示加菌發(fā)酵條件下水分含量分別為30%、35%、40%、45%、50%；Ⅵ—Ⅹ分別表示自然發(fā)酵條件下水分含量分別為30%、35%、40%、45%、50%

2.5 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，綜合分析葡萄糖添加量、水分含量、復(fù)配比例、大豆蛋白添加量和接種量5個(gè)因素，利用Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對煙葉發(fā)酵過程影響較大的因素，結(jié)果如表3、4所示。

表3 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

通過方差分析，得到以感官為響應(yīng)值的線性回歸方程：

Y=106.69-269.76×A-9.07×C-0.64×E-0.53×G-42.07×J。

根據(jù)方差分析得到回歸模型，其中F值為5.900，P=0.025 9<0.05，表示模型顯著，擬合程度較好。由表4可知，葡萄糖添加量與接種量對發(fā)酵煙葉感官有顯著影響，其P值分別為0.040 4和0.007 7，均小于0.05，可以作為進(jìn)一步優(yōu)化的因素。而含水量、復(fù)配比例和大豆蛋白添加量沒有顯著影響，對結(jié)果影響不大，在進(jìn)一步研究中，取中間水平，對影響效果不進(jìn)行分析。

表4 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析

2.6 CCD試驗(yàn)結(jié)果

基于單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對優(yōu)化工藝進(jìn)行了一系列的試驗(yàn)，在Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)CCD原理，試驗(yàn)安排及響應(yīng)值結(jié)果見表5。

表5 響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)及結(jié)果

對表6中的回歸模型進(jìn)行分析，模型P值=0.003 1，極顯著(P<0.01)，失擬項(xiàng)P值=0.647 4，不顯著(P>0.05)，說明模型可靠，擬合情況較好，同時(shí)試驗(yàn)方法也是可靠的。R2=0.889 1，表明預(yù)測值與實(shí)際值之間具有高度相關(guān)性。校正系數(shù)RAdj2=0.809 8，變異系數(shù)為2.24，說明試驗(yàn)可靠性良好。響應(yīng)面方程為Y=89.9+1.15×A+0.36×B-1.58×A×B-4.51×A2-3.01×B2。單因素A、B的F值的大小分別為2.92、0.28，提示單因素對感官的影響順序?yàn)锳(接種量)>B(葡萄糖添加量)。而且A2與B2的影響都是極顯著，A2>B2，說明說明接種量、葡萄糖添加量兩因素對感官不是簡單的線性影響，也說明解淀粉芽孢桿菌的代謝作用也不是簡單受因素的線性影響，這對于優(yōu)化控制很關(guān)鍵。根據(jù)回歸分析結(jié)果做出相應(yīng)的響應(yīng)面圖及其等高線圖(圖5)，以確定接種量和加糖量的交互作用對發(fā)酵煙葉感官的影響，響應(yīng)曲面陡峭，等高線呈密集橢圓形，響應(yīng)面開口向下，表明隨著因素的增大，響應(yīng)值隨之增大，當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到極值后，因素增大但響應(yīng)值逐漸減小[23]。

表6 回歸模型系數(shù)及顯著性檢驗(yàn)

圖5 接種量和葡萄糖添加量交互影響發(fā)酵煙葉感官曲面及等高線

2.7 最優(yōu)工藝條件確定與模型驗(yàn)證

對所建立模型進(jìn)行參數(shù)最優(yōu)分析處理，得到最優(yōu)發(fā)酵工藝為接種量為23.8%、葡萄糖添加量為1.13%，此時(shí)得到發(fā)酵煙葉預(yù)測感官值為88.38±0.799?；趯l件可操作性的考慮，進(jìn)一步將最佳發(fā)酵條件修正為接種量24.0%、葡萄糖1.20%。使用該條件進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，最終得到發(fā)酵煙葉感官值為88.32，與預(yù)測值接近，證明響應(yīng)面法得到的發(fā)酵煙葉工藝參數(shù)是真實(shí)可靠的。

2.8 GC-MS檢測揮發(fā)性風(fēng)味

對最優(yōu)工藝煙葉樣品利用GC-MS檢測其揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，結(jié)果如表7所示。

表7 自然發(fā)酵和加菌發(fā)酵揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)峰面積相對含量分析

分析表7，自然發(fā)酵檢測到為81種物質(zhì)、加菌發(fā)酵檢測到82種物質(zhì)。加菌發(fā)酵醛、酮、酸類物質(zhì)種類較自然發(fā)酵有一定的增加，表明加菌發(fā)酵產(chǎn)生了一定的新物質(zhì)，且醛、酮、酸類相對含量也有不同程度的增加，而這幾種物質(zhì)是很多風(fēng)味的主要組成物質(zhì)。烯烴和酯類等物質(zhì)種類都減少，醇、酮類相對含量明顯增加，烯烴類相對含量明顯下降，自然發(fā)酵烯烴類相對含量為44.00%，加菌發(fā)酵僅為11.23%，自然發(fā)酵醇、酮類相對含量分別為9.71%、3.64%，加菌發(fā)酵醇、酮類分別為22.17%、11.89%。與自然發(fā)酵煙葉相比，加菌發(fā)酵煙葉煙堿含量明顯下降，自然發(fā)酵煙堿相對含量為18.27%，而加菌發(fā)酵煙堿相對含量僅為11.43%，降低6.84個(gè)百分點(diǎn)。

3 結(jié)論與討論

葡糖糖、大豆蛋白及水分都能影響解淀粉芽孢桿菌的生長，故影響對煙葉的發(fā)酵效果，合適的發(fā)酵條件能得到感官更好、蛋白酶活力更高的煙葉。

解淀粉芽孢桿菌可產(chǎn)生較多酶類，如蛋白酶、淀粉酶和葡萄糖苷酶等，它們能將原料中豐富的聚合淀粉和蛋白質(zhì)分解為寡糖和單糖、多肽和氨基酸，共同促進(jìn)微生物的生長和多種代謝物的生物合成[24]。加菌發(fā)酵煙葉醛類主要是糠醛(杏仁氣味)和苯甲醛(濃郁的果香香韻)的增加，可能是因?yàn)榈鞍酌笇⒌鞍踪|(zhì)分解為氨基酸等物質(zhì)，氨基酸與糖發(fā)生反應(yīng)，從而推動(dòng)美拉德反應(yīng)的發(fā)生[25]，而糠醛及5-羥甲基糠醛為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物，表現(xiàn)為相對含量增加，苯甲醛可能是氨基酸的Strecker reaction(斯特雷克反應(yīng))降解所產(chǎn)生[26]；酸類主要是丙酸的增加，研究表明，芽孢桿菌與酸類物質(zhì)之間相關(guān)性顯著[27]，解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)生的蛋白酶可將煙葉中的蛋白質(zhì)分解為氨基酸[28]，再參與解淀粉芽孢桿菌生長代謝，經(jīng)代謝的氨基酸可能轉(zhuǎn)化為酸類化合物，故酸類化合物相對含量增加。

烯烴、醇和酮類化合物的變化可能是因?yàn)橄N容易被芽孢桿菌利用分解為醇類[29]，故醇類相對含量增加而烯烴類顯著降低，加菌發(fā)酵煙葉苯甲醇相對含量較自然發(fā)酵明顯增加，這可能是因?yàn)闊熑~本身具有一定苯丙氨酸裂解酶活力[30]，芽孢桿菌促進(jìn)了苯丙氨酸裂解酶產(chǎn)生從而促進(jìn)苯丙氨酸裂解，產(chǎn)生了較多苯丙氨酸裂解產(chǎn)物如苯甲醇；酮類主要是5,6-二氫-6-戊基-2H-吡喃-2-酮(具有奶油香、椰子香、辛香)、β-大馬酮(玫瑰特征香氣)、β-紫羅蘭酮(木香和紫羅蘭香)等物質(zhì)相對含量增加，酮類化合物的增加可能是因?yàn)檠挎邨U菌將一部分醇轉(zhuǎn)化為酮和微生物，或芽孢桿菌產(chǎn)酶促進(jìn)煙葉中類胡蘿卜素降解[31]生成巨豆三烯酮、β-大馬酮和β-紫羅蘭酮等物質(zhì)。烷烴類化合物相對含量明顯增加，這可能是發(fā)酵過程中微生物代謝產(chǎn)生的[32]。

煙堿具有毒性，但又影響煙草制品的滿足感[33]，通過微生物發(fā)酵降低煙堿含量是一個(gè)有效手段[34]。研究使用復(fù)合菌種發(fā)酵煙葉，在減少有害物質(zhì)的同時(shí)大大增加了具有煙草辛辣味物質(zhì)的相對含量，如葉綠醇[35]，降低了煙草對人體的有害性又保證了煙草的風(fēng)味。葉綠醇是葉綠素的主要構(gòu)件，葉綠醇與葉綠素轉(zhuǎn)化降解為新植二烯，新植二烯本身具有清香氣且刺激性較強(qiáng)[36-40]。2-乙基己醇表現(xiàn)為霉味，丙烯酸正丁酯、正己醛和正辛醛有刺激性。在加菌發(fā)酵煙葉中未檢測出2-乙基己醇，且加菌發(fā)酵煙葉中的丙烯酸正丁酯、正己醛和正辛醛的相對含量低于自然發(fā)酵，表明接種復(fù)合菌解淀粉芽孢桿菌對減少煙草風(fēng)味消極影響的物質(zhì)有較好的作用。

由于復(fù)合解淀粉芽孢桿菌的作用產(chǎn)生較多代謝產(chǎn)物包括風(fēng)味物質(zhì)及減少刺激性化合物相對含量，且發(fā)酵產(chǎn)生了一定活力的酶如蛋白酶，將煙葉中的蛋白質(zhì)分解為一些具有特殊風(fēng)味的氨基酸參與微生物代謝，故在感官上，加菌發(fā)酵煙葉較自然發(fā)酵煙葉整體更為協(xié)調(diào)，香味復(fù)雜濃烈，勁頭足，刺激性小，滋味豐富，風(fēng)味更佳。

以煙葉為原料，利用課題組前期從臘肉中篩選出的GUHP86、GZU03菌株對煙葉進(jìn)行混菌發(fā)酵，研究其發(fā)酵特性，得到具有較高蛋白酶活力且更高品質(zhì)的煙葉。在單因素試驗(yàn)和Plackett-Burman試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用CCD響應(yīng)面法對發(fā)酵條件進(jìn)行探究，得到最佳發(fā)酵工藝。最佳發(fā)酵工藝為接種量24.0%、葡萄糖添加量1.20%、水分含量40%、復(fù)配比例(GZU03∶GUHP86)1∶1、大豆蛋白添加量1.00%。通過GC-MS分析揮發(fā)性風(fēng)味成分發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵降低了煙堿相對含量，降低煙葉的有害性，且蛋白酶可將蛋白質(zhì)分解用于解淀粉芽孢桿菌的生長代謝，微生物產(chǎn)生了較多代謝產(chǎn)物，包括一些具有特殊風(fēng)味的物質(zhì)，增加了煙葉風(fēng)味多樣性，得到整體更為協(xié)調(diào)、香味復(fù)雜濃烈、勁頭足、刺激性小、滋味豐富、風(fēng)味更佳的煙葉，提高了煙葉質(zhì)量，為煙葉的混菌發(fā)酵技術(shù)開發(fā)提供一定的理論和技術(shù)參考。