獼猴桃貯藏中常見病原菌的分離鑒定及抗菌中藥的篩選

呂蕊花,林 樅,白崇旭,方亞妮,馮 昭,史琳娜,呂瑞華,張喜榮

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，陜西 咸陽 712046)

獼猴桃(Actinidiachinensis)為呼吸躍變型的多汁漿果，產(chǎn)后極易腐爛變軟，為提高獼猴桃經(jīng)濟(jì)價(jià)值，延長(zhǎng)銷售時(shí)間，其保鮮冷藏技術(shù)一直被廣泛關(guān)注。陜西省周至縣享有“中國(guó)獼猴桃之鄉(xiāng)”的美名，全縣獼猴桃種植面積達(dá)2.77萬hm2，年貯藏能力可達(dá)30萬t。現(xiàn)普遍使用的冷藏庫消毒技術(shù)多為在獼猴桃入庫之前，用高錳酸鉀和甲醛配比液對(duì)冷藏庫空間進(jìn)行全面熏蒸，這種背景下獼猴桃果實(shí)采摘預(yù)冷后直接進(jìn)入冷藏庫，不作任何消毒處理，在貯藏過程中極易發(fā)生霉?fàn)€。2002年，該縣貯藏獼猴桃腐爛率在30%～40%，甚至高達(dá)60%，最低也在10%左右，且不同品種的霉?fàn)€率不盡相同。

在獼猴桃典型病害研究方面，引起獼猴桃褐斑病、軟腐病、類似象皮病和果腐病的病原菌已被鑒定，分別為鏈格孢菌(Alternariaalternate)[1]、葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)[2]、柔膜菌目真菌(Cadophoramelinii)[3]和擬莖點(diǎn)霉(Phomopsissp.)[4]。在獼猴桃采摘后病害鑒定方面，丁愛冬等[5]發(fā)現(xiàn)貯藏19周的獼猴桃腐爛率高達(dá)50%，從中分離得到7種病原菌，其中,灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)、青霉屬(Penicilliumsp.)和擬莖點(diǎn)霉(Phomopsissp.)3種病原菌為優(yōu)勢(shì)菌。除此之外，葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)、擬隱殼孢屬(Cryptosporiopsissp.)、間座殼屬(Diaporthespp.)、念珠菌(Cylindrocarponcf.candidum)和多變莖點(diǎn)菌(Phomaexigua)5種真菌均被證實(shí)可以侵染獼猴桃，且極易從獼猴桃受損部位侵入[6]。在獼猴桃病害防治方面，王小潔等[2]從海沃德軟腐病病果中分離出了10種致病菌，經(jīng)鑒定均為葡萄球座菌，藥劑篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，多菌靈對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，抑制率高達(dá)91.97%。由此可見，引起獼猴桃貯藏期病害的病原菌種類繁多，但使用農(nóng)藥對(duì)真菌菌絲或孢子進(jìn)行防控僅限于研究層面，不能在生產(chǎn)上進(jìn)行有效應(yīng)用。因此，進(jìn)一步明確病原菌種類，并探究中藥對(duì)獼猴桃貯藏期病原菌的防治效果是當(dāng)下降低獼猴桃貯藏過程中霉變率的有效途徑。鑒于此，以陜西省周至縣貯藏量較大、收益較高的獼猴桃品種為研究對(duì)象，研究在獼猴桃貯藏過程中引起果實(shí)霉?fàn)€的幾種常見病原菌，并選取常用抗菌中藥，通過菌絲生長(zhǎng)抑制方法，分別對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行抑制效果測(cè)定，以期為獼猴桃貯藏、保鮮提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

供試病樣及菌種：貯藏期病果于2018年11月—2019年1月從陜西省周至縣獼猴桃冷藏庫中獲得，為貯藏1～4個(gè)月的成熟果實(shí)。病果具有該地區(qū)獼猴桃貯藏期間常見的發(fā)病癥狀，病果品種為該地區(qū)經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的品種：海沃德、徐香、華優(yōu)。病原菌致病性測(cè)定所用上述品種健康獼猴桃亦由此地購得。

培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potota dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉12 g、蒸餾水1 000 mL；馬鈴薯葡萄糖(Potota dextrose, PD)液體培養(yǎng)基：不添加瓊脂粉的PDA培養(yǎng)基。

試劑及儀器：真菌基因組DNA提取試劑盒購自北京索來寶科技有限公司；PCR擴(kuò)增、檢測(cè)及產(chǎn)物克隆所用試劑盒均購自TAKARA公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均購自O(shè)MEGA公司；瓊脂糖、核酸Marker、預(yù)染EB均購自上海生物工程有限公司；光學(xué)顯微鏡購自日本Olympus公司；雙壓電泳儀和電泳槽購自北京君意公司。

中藥材：選取的10種抗真菌常用單味藥[7]的顆粒劑,均購于陜西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，生產(chǎn)廠家為四川新綠色藥業(yè)科技發(fā)展有限公司。10種單味藥均為濃縮顆粒劑，其1 g濃縮顆粒劑對(duì)應(yīng)的原藥材質(zhì)量分別為大黃7 g、茵陳11 g、蛇床子21 g、薄荷11 g、苦楝皮12 g、鹽小茴香21 g、連翹11 g、板藍(lán)根11 g、馬齒莧11 g、土茯苓11 g。

1.2 病原菌的分離與純化

組織分離法[8]：切取病、健交界處的組織4～5 mm，用75%乙醇清洗1 min，再用無菌水沖洗3～4次，置于無菌濾紙上，用刀片從中間切開，切面貼向PDA平板進(jìn)行培養(yǎng)。對(duì)于肉眼可見的霉菌菌絲，在超凈工作臺(tái)上直接用接種環(huán)挑取接種于PDA培養(yǎng)基上，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。然后挑取邊緣菌絲再次分離，直至分離到單菌落。

將純化的病原菌用打孔器打成直徑為1 cm的圓餅，菌絲面朝上接種于PDA平板上，20 ℃培養(yǎng)，觀察、記錄菌絲生長(zhǎng)情況，顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)及孢子產(chǎn)生情況。

1.3 病原菌的致病性測(cè)定

待接種健康獼猴桃果實(shí)消毒處理方式：用75%的乙醇噴灑獼猴桃果實(shí)表面，置于超凈工作臺(tái)中完全吹干。采用穿刺法接種：用無菌的牙簽穿刺果皮，用1 cm的打孔器在培養(yǎng)5 d的PDA平板菌落邊緣打孔，將菌絲面朝向果皮接種健康的獼猴桃。分離到的每種病原菌均接種3個(gè)待測(cè)獼猴桃品種，每個(gè)品種重復(fù)3次，每個(gè)品種每次接種5個(gè)果實(shí)。接種后置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察并記錄發(fā)病情況。待果實(shí)發(fā)病后，根據(jù)柯赫法則，再次從人工接種致發(fā)病的獼猴桃果實(shí)上分離病原菌進(jìn)行培養(yǎng)，并與接種前所用病原菌進(jìn)行對(duì)比。

1.4 病原菌形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定

病原菌形態(tài)學(xué)鑒定：將分離得到的致病菌株接種到PDA平板上，20 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)7 d，觀察記錄菌落生長(zhǎng)情況，并在光學(xué)顯微鏡下觀察其菌絲及產(chǎn)孢情況。

病原菌分子生物學(xué)鑒定：根據(jù)真菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取分離病原菌基因組DNA，并以此為模板，應(yīng)用ITS序列通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并純化后，送至北京擎科生物科技有限公司西安分公司進(jìn)行測(cè)序。所得序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，下載不同地域來源的同源性較高的序列，用MEGA 4.0軟件以鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，分析其親緣關(guān)系。

1.5 常用抗真菌中藥室內(nèi)抑菌效果測(cè)定

采用含藥平板進(jìn)行篩選，將10種抗真菌常用中藥顆粒劑根據(jù)質(zhì)量及濃縮倍數(shù)，加去離子水溶解，配成質(zhì)量濃度為2.5 g/mL的溶液。將配好的顆粒劑溶液及PDA培養(yǎng)基分別滅菌。待培養(yǎng)基溫度降至50～60 ℃時(shí)，分別用移液槍吸取不同體積的顆粒劑溶液加入到PDA培養(yǎng)基中，最終配制成含不同單味中藥質(zhì)量濃度為0.3 g/mL PDA培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基完全冷卻，用直徑為1 cm的打孔器在菌落邊緣打取大小相同的菌絲塊，接種于含不同單味中藥的培養(yǎng)基上，置于20 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每個(gè)中藥重復(fù)3 次，每次3個(gè)平板，以加入無菌水的PDA培養(yǎng)基作為對(duì)照(CK)。每隔24 h觀察記錄1次，采用十字交叉法測(cè)量菌落生長(zhǎng)直徑，計(jì)算各單味中藥的抑制率。菌絲生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑-含中藥培養(yǎng)基菌落生長(zhǎng)直徑)/對(duì)照菌落生長(zhǎng)直徑×100%。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并利用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Student-Newman-Keuls多重比較法進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)特征

經(jīng)柯赫法則驗(yàn)證，從3個(gè)品種的獼猴桃病果中共分離得到5種菌株，依次編號(hào)為QD1、QD4、QD5、QD7和QD10，形態(tài)學(xué)鑒定初步將其歸為以下4個(gè)屬：QD1為根毛霉屬[Mucor(Rhizomucor)]、QD4和QD7為鏈格孢屬(Alternaria)、QD5為葡萄座腔菌屬(Botryosphaeria)、QD10為間座殼屬(Diaporthe)。

2.1.1 根毛霉屬 根毛霉屬(QD1)病原菌剛接種到PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，菌絲白色。20 ℃ 培養(yǎng)7 d后，菌絲上面長(zhǎng)出大量小孢子。之后菌絲顏色逐漸加深為乳黃色，孢子卵圓形，大小為(1.7～2.3)μm×(2.5～2.9)μm。該病原菌極易侵染華優(yōu)獼猴桃，接種10 d肉眼可見明顯的發(fā)病癥狀：獼猴桃接種的地方有少量菌絲，從果皮上看無異常，但被侵染的獼猴桃果實(shí)部位表面變軟。揭開果皮后，可見果實(shí)呈黃色腐爛狀，果蒂也變黃并腐爛(圖1)。

圖1 根毛霉屬(QD1)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.1.2 鏈格孢屬 鏈格孢屬(QD4)在PDA培養(yǎng)基上為青灰色，菌絲為有隔菌絲，菌絲在生長(zhǎng)過程中不產(chǎn)生孢子。發(fā)病的獼猴桃表面明顯有灰白色菌絲，肉眼可見有黏性液體滲出果皮，果實(shí)有乙醇味，發(fā)病部位果肉內(nèi)部結(jié)成一塊，明顯呈黃色(圖2)。

圖2 鏈格孢屬(QD4)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

同樣為鏈格孢屬的QD7真菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌絲為深灰色，20 ℃條件下生長(zhǎng)7 d長(zhǎng)滿9 cm的平板。菌絲有隔，20 ℃生長(zhǎng)5 d后菌絲上產(chǎn)生大量孢子。孢子呈梨形，大小為(2.3～3.6)μm×(4.7.5～8.9)μm。被侵染的獼猴桃表面有大量黑色菌絲，果肉內(nèi)部變黃，腐爛變質(zhì)(圖3)。

圖3 鏈格孢屬(QD7)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.1.3 葡萄座腔菌屬 葡萄座腔菌屬(QD5)病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1～5 d的菌絲為白色，從第5天開始，菌絲顏色逐漸加深，最終顯示為灰綠色。顯微鏡觀察，菌絲形態(tài)呈碎片狀，不產(chǎn)生孢子。病原菌侵染獼猴桃的癥狀表現(xiàn)為被侵染處皺縮凹陷，果肉腐爛發(fā)黃(圖4)。

圖4 葡萄座腔菌屬(QD5)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.1.4 間座殼屬 間座殼屬(QD10)病原菌在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較緩慢，20 ℃條件下培養(yǎng)15～18 d長(zhǎng)滿整個(gè)平板。菌絲白色，緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，不易與培養(yǎng)基分離，在培養(yǎng)基上呈同心圓分布。顯微鏡下菌絲較短小，不產(chǎn)生孢子。被病原菌侵染的獼猴桃表面無異樣，但受感染部位明顯變軟，果肉發(fā)黃變質(zhì)(圖5)。

圖5 間座殼屬(QD10)的形態(tài)特征及侵染獼猴桃的發(fā)病癥狀

2.2 病原菌的分子生物學(xué)鑒定

以鄰近法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)生樹見圖6。結(jié)合該5株病原菌形態(tài)學(xué)特征，將QD1病原菌鑒定為多變根毛霉菌[Mucorirregularis(Rhizomucorvariabilis)]，QD4病原菌鑒定為黑斑病菌(Alternariabrassicae)，QD5病原菌鑒定為葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)，QD7病原菌鑒定為鏈格孢菌(Alternariaalternate)，QD10病原菌鑒定為間座殼菌(Diaportheeres)。

圖6 基于ITS序列采用鄰近法構(gòu)建菌株QD1、QD4、QD5、QD7、QD10系統(tǒng)發(fā)生樹

2.3 常用抗真菌中藥室內(nèi)抑菌效果

通過含中藥的培養(yǎng)基培養(yǎng)不同菌株，5～10 d測(cè)得的抑菌效果(表1)顯示，0.3 g/mL培養(yǎng)基的蛇床子、苦楝皮和連翹對(duì)幾種獼猴桃病原菌的抑菌效果較好，這3種中藥對(duì)QD7和QD10病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率均在90%及以上。除此之外，對(duì)QD1、QD4和QD5病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率也均在70%以上。相反地，總體來說茵陳、板藍(lán)根、薄荷和土茯苓對(duì)這5種病原菌菌絲生長(zhǎng)速率抑菌效果較差。

表1 不同中藥對(duì)獼猴桃貯藏期常見病原菌菌絲的抑制率

3 結(jié)論與討論

現(xiàn)階段，從獼猴桃病果中分離出來的病原菌均為真菌性病害且種類繁多，段愛莉等[9]從貯藏期霉?fàn)€獼猴桃華優(yōu)、海沃德和秦美果實(shí)中分離出的主要病原菌為青霉屬(Penicilliumsp.)，占總菌株的63.3%。本研究并未分離出青霉屬真菌，這可能與貯藏進(jìn)冷藏庫時(shí)獼猴桃表面所攜帶的病原菌相關(guān)。與本研究分離出的QD10病原菌發(fā)病癥狀相同，Phomopsisactinidiae(Henn.)引起獼猴桃采后腐爛[10]。病斑大多最初發(fā)生在成熟果實(shí)莖端，從莖端逐漸擴(kuò)散，發(fā)病部位開始變得柔軟，剝?nèi)ケ砥ず?，發(fā)病組織顏色比周圍健康組織更淺，呈淡綠色[10]。病原菌從果蒂端侵入而引起獼猴桃果實(shí)發(fā)病的原因，有可能與獼猴桃果樹里面的內(nèi)生菌有關(guān)。因此，在獼猴桃的栽培種植中，提高果樹的抗病能力，是延長(zhǎng)果實(shí)貯藏期的根本。

在病原菌的分離過程中發(fā)現(xiàn)，不同獼猴桃品種感染不同病原菌的發(fā)病率也有差別，總體來說，海沃德品種獼猴桃抗病原菌侵染的能力最強(qiáng)。徐香品種獼猴桃更容易被多變根毛霉菌[Mucorirregularis(Rhizomucorvariabilis)]和葡萄球座菌(Botryosphaeriadothidea)侵染，海沃德品種更易被鏈格孢菌(Alternariaalternata)侵染，華優(yōu)品種則更容易被黑斑病菌(Alternariabrassicae)和間座殼菌(Diaportheeres)侵染，這可能與不同獼猴桃品種的含糖量有關(guān)。趙金梅等[1]從中華獼猴桃褐斑病發(fā)病果實(shí)中分離出鏈格孢菌，并發(fā)現(xiàn)海沃德比華優(yōu)獼猴桃更易感病，這與本研究的結(jié)果剛好相反，這可能與獼猴桃栽培方式、采摘時(shí)間、貯藏條件有關(guān)系。YOUNG等[11]從采摘后的獼猴桃果腐病果中，也分離到了Botryosphaeria和Diaporthe，這與本研究分離到的QD5和QD10病原菌相同。

在獼猴桃采摘后病原菌防控方面的研究表明，獼猴桃經(jīng)0.08 mol/L氯化鈣[12]、500 GY電子束輻射[13]、5%的抗壞血酸[14]處理、肉桂酸精油熏蒸[15]、80%的富氫水[16]或香芹、茴香油體外處理[17]均可降低其貯藏期霉變率。另外，50%多菌靈可濕性粉劑1 000倍液對(duì)葡萄球座菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最好，抑制率高達(dá)91.97%[2]，但這些方法僅限于研究層面，現(xiàn)階段還沒有具體應(yīng)用。程小梅等[18]采用川穹等對(duì)貯藏期的獼猴桃進(jìn)行病原菌防治，抑制率高達(dá)92.76%，但其僅針對(duì)青霉菌1種菌株作了相關(guān)研究。本研究從10種常見抗菌中藥中篩選出了在獼猴桃貯藏過程中對(duì)常見病原菌防控效果較好的3種藥劑(蛇床子、苦楝皮和連翹)，這3種單味中藥對(duì)大部分病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率可達(dá)70%以上。因此，采用中藥防治獼猴桃貯藏過程中的病原菌，不僅符合現(xiàn)階段人們對(duì)于高品質(zhì)、無公害農(nóng)產(chǎn)品的倡導(dǎo)和追求，且抑制效果較好，更易被果農(nóng)接受，也更容易在獼猴桃的貯藏、保鮮中得到實(shí)際應(yīng)用。后期將對(duì)篩選出的上述3種中藥進(jìn)行有效配伍，結(jié)合中藥對(duì)獼猴桃果實(shí)細(xì)胞壁的軟化作用，研究其抑制獼猴桃貯藏中常見病原菌的最佳配伍，以期對(duì)獼猴桃貯藏過程常見真菌進(jìn)行切實(shí)有效的防控。