不同調(diào)控措施對連作高粱生長及根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

樊芳芳，白文斌，王 磊，王勁松，聶萌恩，劉 鵬，李 光，范昕琦

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 高粱研究所，山西 晉中 030600；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所，山西 太原 030031)

連作可導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低、土傳病害嚴(yán)重、植物病原體富集[1]，而合理輪作可有效緩解連作障礙[2-3]。已有研究表明，連作會導(dǎo)致高粱長勢及產(chǎn)量降低[4-6]。作為釀造業(yè)的主要原料，高粱主要種植在貴州、山西等省區(qū)。近年來，由于訂單農(nóng)業(yè)的需要，釀造企業(yè)為追求高收益，連續(xù)多年種植高粱，導(dǎo)致出現(xiàn)高粱連作障礙。因此，緩解或者克服連作障礙，成為高粱栽培可持續(xù)發(fā)展的一項(xiàng)重要工作。

微生物是土壤生態(tài)系統(tǒng)中最重要和活躍的部分，在促進(jìn)土壤養(yǎng)分循環(huán)、維持系統(tǒng)穩(wěn)定性以及可持續(xù)利用中占主導(dǎo)地位[7]。健康的土壤微生物群落可表征土壤健康高產(chǎn)、抑制土傳病害[8]。以植物根際為核心，植物-土壤-微生物及其他環(huán)境條件相互作用形成根際微生態(tài)環(huán)境，有學(xué)者認(rèn)為，根際微生態(tài)系統(tǒng)的失衡是造成連作障礙的主要原因[9-10]。HUANG等[11]認(rèn)為，植物-土壤的相互反饋調(diào)節(jié)成為現(xiàn)代可持續(xù)發(fā)展農(nóng)業(yè)的重要領(lǐng)域。因此研究根際土壤微生物的變化規(guī)律，對解決高粱連作障礙具有重要意義。

對玉米[12]、大豆[13-14]、馬鈴薯[15-16]等作物的研究表明，采取合理的輪作制度或增施有益菌均可有效緩解連作障礙。劉杭[12]用Biolog-Eco技術(shù)對3種典型旱地作物連作研究表明，大豆和小麥長期連作條件下，土壤微生物對糖類碳源的利用率顯著低于輪作；玉米長期連作條件下，土壤微生物對多聚物、胺類碳源的利用率顯著低于輪作。不同栽培制度可改變連作馬鈴薯根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)代謝多樣性及遺傳多樣性[15-17]。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化特征因作物品種和試驗(yàn)條件仍有所差異。迄今為止，沒有針對高粱連作根際土壤微生物群落代謝多樣性與遺傳多樣性及不同調(diào)控措施的系統(tǒng)研究。鑒于此,采用高粱盆栽栽培試驗(yàn)，通過Biolog-Eco板和DGGE(變形梯度凝膠電泳)技術(shù)，對不同調(diào)控措施下高粱根際土壤的功能代謝多樣性及基因多樣性進(jìn)行分析。探究有效調(diào)控高粱連作障礙的措施，以期為緩解和克服高粱連作障礙提供理論依據(jù)與數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

盆栽用土采集于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽試驗(yàn)基地，連作土壤采自于高粱連作試驗(yàn)田，輪作土壤采自于高粱/玉米輪作田的玉米茬，除去人為擾動0～2 cm表層土后，采集2～20 cm的根層土壤，多點(diǎn)采樣并混勻，采集土壤化學(xué)特征為：pH值8.40、有機(jī)質(zhì)含量14.16 g/kg、全氮含量0.98 g/kg、速效磷含量8.17 mg/kg、速效鉀含量259.82 mg/kg。供試高粱品種為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高粱研究所選育的矮稈品種晉雜34。供試土壤生態(tài)調(diào)理劑為山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與資源研究所篩選的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefacienssp.)Pb-4發(fā)酵液。盆栽試驗(yàn)于2017年4—7月在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院聯(lián)棟溫室內(nèi)進(jìn)行；設(shè)置3個(gè)處理：T1(高粱連作)、T2(高粱連作施加生態(tài)調(diào)理劑)、T3(高粱/玉米輪作)，每個(gè)處理重復(fù)6次。

1.2 試驗(yàn)方法與根際土采集

在裝盆前將稱好的肥料與不同處理土壤充分混勻(施N 0.2 g/kg、P 0.15 g/kg、K 0.15 g/kg)，每盆5 kg(盆高18 cm、內(nèi)徑21 cm)，播種前將高粱種子催芽，每盆播20粒，留苗4株到抽穗期。在出苗60 d破壞性取樣，根據(jù)抖根法[17]采集高粱根際土壤，去除雜質(zhì)后立即保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 高粱生長特征測定 在盆栽出苗60 d時(shí)破壞性采樣，測定作物株高、莖粗，烘干后測其干物質(zhì)量。

1.3.2 土壤微生物群落功能多樣性測定 土壤微生物群落功能多樣性使用Biolog-Eco板測定(Biolog Inc,CA,USA)。稱取相當(dāng)于10 g烘干土質(zhì)量的新鮮土樣加到已滅菌的生理鹽水(NaCl溶液，0.85%)中，200 r/min旋渦振蕩30 min，靜置10 min后用生理鹽水稀釋到10-3，將稀釋液加入Biolog-Eco板中，每孔加入150 μL，標(biāo)記后置于28 ℃的培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)168 h，每隔24 h用Biolog自動讀數(shù)儀測定吸光值(OD590)[3]。計(jì)算每孔顏色變化率(AWCD)、McIntosh指數(shù)(McIntosh index)、香農(nóng)(Shannon)指數(shù)、均勻度指數(shù)(Pielou index)[18]。AWCD值來表征根際土壤微生物代謝群落，計(jì)算公式如下：

式中，Ci為微孔板第i孔的吸光值，R為對照孔的吸光值，31為微孔板有碳源孔的總數(shù)。

根據(jù)官能團(tuán)的不同，將Biolog-Eco板中31種碳源分為6大類，胺類、氨基酸類、糖類、羧酸類、雙親化合物類、聚合物類。選擇AWCD曲線的拐點(diǎn)處，對培養(yǎng)96 h的數(shù)據(jù)進(jìn)行不同碳源代謝能力、多樣性指數(shù)分析[18]，計(jì)算公式如下：

香農(nóng)指數(shù)=-∑pilnpi

均勻度指數(shù)=Shannon指數(shù)/lnS

1.3.3 土壤微生物基因組DNA的提取及DGGE分析 土壤總DNA的提取參照土壤DNA提取試劑盒(生工生物工程股份有限公司)進(jìn)行。以樣品總DNA為模板，細(xì)菌采用16S rDNA引物對GC-338F(5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG

CACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)/R518(5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，真菌采用18S rDNA引物對GC-Fung(5′-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCATTCCCCG-TTACCCGTTG-3′)/NS1(5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′)，為了使PCR產(chǎn)物在DGGE膠上更好地分離，在前引物5′末端加了含有40 bp的GC夾子。PCR采用30 μL反應(yīng)體系：2×PCR Master 12.5 μL(生工生物工程股份有限公司)，DNA模板2 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，滅菌的雙蒸水補(bǔ)足至30 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，48 ℃退火50 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。熱蓋設(shè)置溫度105 ℃。所有PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)。

采用Bio-Rad公司的DcodTM的基因突變檢測系統(tǒng)(Dcod univeral detection system instrument)對PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離。聚丙烯酰胺含量為8%(w/v)，細(xì)菌的DGGE變性含量為35%～65%，真菌的DGGE變性含量為18%～38%，電泳在1×TAE緩沖液中，65 V電壓，60 ℃條件下電泳300 min，電泳后用4S核酸燃料泡染40 min，洗凈后用凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad，USA)拍照。采用Quantity one軟件分析DGGE圖譜條帶特征，計(jì)算多樣性指數(shù)[19]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2007整理數(shù)據(jù)，使用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對高粱生長的影響

T2、T3處理高粱的莖粗、生物量均顯著高于T1處理，T2處理高粱的株高顯著高于T1和T3處理(表1)。與T1處理相比，T2處理高粱的株高、莖粗和干物質(zhì)量分別增加16.95%、13.33%和19.82%，差異均顯著；T3處理高粱的莖粗、干物質(zhì)量分別增加12.00%、16.22%。這表明不同調(diào)控措施(施加調(diào)理劑、輪作)均可促進(jìn)高粱生長，有效緩解高粱連作障礙問題，高粱連作施加生態(tài)調(diào)理劑(T2處理)促進(jìn)效果更好。

表1 不同處理對高粱生長的影響

2.2 不同處理對高粱根際土壤微生物群落功能多樣性的影響

2.2.1 不同處理對高粱根際土壤微生物群落代謝活性的影響 AWCD值可反映土壤微生物群落的碳源代謝活性。由圖1可知，隨培養(yǎng)時(shí)間延長，高粱根際土壤AWCD值不斷升高，培養(yǎng)168 h時(shí)增加相對緩慢。不同處理比較，T3處理高粱根際土壤微生物群落AWCD值高于T1、T2處理，培養(yǎng)96 h后差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)，培養(yǎng)96 h時(shí)，T3處理高粱根際土壤微生物群落AWCD值比T1、T2處理分別高出16.72%、19.15%(P<0.05)?？梢?，與玉米輪作顯著提高了高粱根際微生物群落碳源代謝活性，而施加生態(tài)調(diào)理劑對高粱根際微生物群落代謝活性影響不顯著。

圖1 不同處理AWCD值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化

由表2可知，對培養(yǎng)96 h后不同處理根際土壤微生物群落不同碳源利用能力的分析發(fā)現(xiàn)：與T1處理相比，T3處理根際土壤微生物群落對氨基酸類、糖類、雙親化合物類碳源的利用能力顯著增加(P<0.05)，對這3類碳源的利用能力分別是T1處理的1.85倍、1.63倍、1.78倍。與T1處理相比，T2處理高粱根際微生物群落對胺類的利用能力增加(P<0.05)，其利用能力分別是T1、T3處理的5.5倍、1.38倍。

表2 不同處理對高粱根際土壤微生物群落不同碳源利用能力的影響

2.2.2 不同處理高粱根際土壤微生物群落功能多樣性及主成分分析 T3處理根際土壤微生物群落的McIntosh指數(shù)和均勻度指數(shù)較T1處理均顯著增加，T2處理高粱根際土壤微生物群落的均勻度指數(shù)較T1處理顯著增加(表3)。T3處理的McIntosh指數(shù)分別比T1、T2處理增加31.41%、32.37%；T2、T3處理的均勻度指數(shù)分別比T1處理增加17.48%、19.42%(P<0.05)。

表3 不同處理高粱根際土壤微生物群落功能多樣性指數(shù)

不同處理在主成分圖上有明顯分異(圖2)，T3處理在主成分1(PC1)上得分最高，而T1處理得分最低，位于PC1負(fù)軸方向。T2處理在主成分2(PC2)上得分最低，位于PC2負(fù)軸方向，而T1、T3處理在PC2上無顯著分異。這表明PC1對T1和T3處理間分異的貢獻(xiàn)較大，PC2對T2處理與其他處理間分異的貢獻(xiàn)較大。對PC1顯著相關(guān)的碳源有：氨基酸類3種(L-天冬酰胺酸、L-苯基丙氨酸、L-絲氨酸)、糖類2種(β-甲基D-葡萄糖苷、N-乙?；?D-葡萄胺)、羧酸類2種(D-半乳糖酸γ內(nèi)酯、D-半乳糖醛酸)、雙親化合物2種(丙酮酸甲酯、葡萄糖-1-磷酸鹽)、聚合物類3種(吐溫40、吐溫80、α-環(huán)狀糊精)，對PC2顯著相關(guān)的碳源有羧酸類2種(衣康酸、D-蘋果酸)(表4)。T1、T3處理的分異主要由于與PC1顯著相關(guān)的12種碳源綜合代謝差異導(dǎo)致的，而T2處理與T1、T3處理的差異主要是由于與PC2顯著相關(guān)的衣康酸和D-蘋果酸的代謝差異導(dǎo)致的。

圖2 高粱根際土壤微生物群落代謝主成分分析

表4 PC1、PC2顯著相關(guān)碳源

2.3 不同處理高粱根際土壤微生物群落DGGE分析

2.3.1 細(xì)菌DGGE圖譜及基因香農(nóng)指數(shù) 所得16S rDNA片段通過DGGE分離，可以看出不同處理DGGE條帶數(shù)量及亮度有差異(圖3)。細(xì)菌DGGE電泳分離條帶較多，這表明高粱根際土壤細(xì)菌種群數(shù)量豐富，不同處理?xiàng)l帶A1上的亮度差別明顯，T3處理A1條帶濃度較低，在電泳膠的A2區(qū)域，T3處理的條帶數(shù)量多于T1和T2處理。這說明，與不同調(diào)控措施相比，T1處理高粱根際土壤細(xì)菌基因香農(nóng)指數(shù)顯著降低，比T2、T3處理分別降低36.54%、46.49%(表5)。

圖3 細(xì)菌群落的DGGE圖譜

表5 細(xì)菌與真菌基因香農(nóng)指數(shù)

2.3.2 真菌DGGE圖譜及基因香農(nóng)指數(shù) 所得18S rDNA片段通過DGGE分離(圖4)，不同處理根際土壤中真菌18S在條帶數(shù)量上有明顯差別，T1、T2處理都出現(xiàn)特異性條帶，這表明高粱連作導(dǎo)致根際微生物群落中出現(xiàn)特有真菌。T1處理高粱根際土壤中真菌18S區(qū)的基因香農(nóng)指數(shù)較高(表5)，T1與T2處理高粱根際真菌基因香農(nóng)指數(shù)顯著高于T3處理，其中T1處理高粱根際的真菌基因香農(nóng)指數(shù)比T3處理高出14.47%。

圖4 真菌群落的DGGE圖譜

2.4 Person相關(guān)系數(shù)分析

高粱莖粗、株高與干物質(zhì)量均呈極顯著正相關(guān)(表6)；根際土壤微生物群落的功能多樣性指數(shù)與細(xì)菌基因多樣性指數(shù)顯著正相關(guān)，而與真菌基因多樣性指數(shù)顯著負(fù)相關(guān)，這說明細(xì)菌與真菌的多樣性的變化導(dǎo)致根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)失衡，進(jìn)而影響了根際土壤微生物群落的代謝多樣性。

表6 Person相關(guān)系數(shù)分析

3 結(jié)論與討論

同一作物或近緣作物連作后，在正常的管理?xiàng)l件下，也會出現(xiàn)連作障礙現(xiàn)象，如生長情況變差、產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣等，合理有效的農(nóng)藝措施如輪作[5,12]、施用土壤生態(tài)調(diào)理劑[20-21]或者土壤消毒[22-24]可以促進(jìn)作物生長，有效緩解連作障礙現(xiàn)象。本研究也表明，與連作高粱相比，輪作及施加生態(tài)調(diào)理劑均增加了高粱株高、莖粗和干物質(zhì)量，促進(jìn)高粱生長，緩解高粱連作障礙。

Biolog-Eco板通過檢測土壤微生物群落對31種單一碳源的利用能力，測定土壤微生物群落代謝活性及代謝多樣性。AWCD值表示對31種碳源的平均利用能力，其值越高表示土壤微生物群落代謝活性越高。本研究發(fā)現(xiàn)，T1處理高粱根際土壤微生物群落的AWCD值低于T3處理，說明連作高粱根際土壤微生物群落代謝活性減弱；高粱連作后施加生態(tài)調(diào)理劑(T2處理)增加了高粱根際土壤微生物群落對胺類的代謝活性，高粱/玉米輪作(T3處理)增加了高粱根際土壤微生物對氨基酸類、糖類、雙親化合物類碳源的利用能力，這與本課題組之前大田高粱連作障礙研究結(jié)果一致[3,5]，輪作后高粱根際土壤微生態(tài)環(huán)境得到優(yōu)化，微生物群落對多種碳源的代謝明顯升高，劉杭[12]也得出一致結(jié)論，輪作后土壤微生物群落對多種碳源代謝的利用能力增強(qiáng)，代謝多樣性增加。通過DGGE條帶分析可知，與T3處理相比，T1、T2處理高粱根際土壤中細(xì)菌香農(nóng)指數(shù)降低，真菌香農(nóng)指數(shù)顯著增加，這可能是由于高粱連作后根際土壤中真菌類微生物的累積，打破了原來土壤中的微生態(tài)平衡，根際土壤由細(xì)菌型向真菌型轉(zhuǎn)變，根際土壤微生物群落代謝活性降低，尤其減少了對氨基酸類、糖類及雙親化合物類碳源的利用，根際土壤微生態(tài)環(huán)境惡化，發(fā)生高粱連作障礙。孟品品等[17]通過對連作馬鈴薯根際土壤微生物群落的PCR-DGGE分析，也證實(shí)了連作會增加土壤中真菌類病原菌鐮刀菌，進(jìn)而影響馬鈴薯塊莖產(chǎn)量降低。

綜上所述，連作后高粱長勢減弱，根際土壤微生態(tài)平衡被破壞，與連作高粱相比，施加生態(tài)調(diào)理劑或者與玉米輪作都可促進(jìn)高粱的生長，改變連作高粱根際土壤微生物群落的代謝功能及遺傳多樣性，緩解連作障礙。本研究采用Biolog-Eco和DGGE技術(shù)探討不同調(diào)控措施對高粱根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，從碳源代謝功能變化、細(xì)菌與真菌基因群落變化的角度進(jìn)行解析，下一步仍需借助分子生物學(xué)方法明確具體關(guān)鍵微生物菌群的變化，并進(jìn)一步探究生態(tài)調(diào)理劑緩解連作障礙的作用機(jī)制。