煙草長柄分泌型腺毛的遺傳分析

李雪君，王召軍，李耀宇，平文麗，孫 煥，馬彩娟，陳 飛，孫計(jì)平

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 煙草研究所/黃淮煙區(qū)煙草病蟲害綠色防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 許昌 461000;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002; 3.河南省煙草公司許昌市公司，河南 許昌 461000)

普通煙草(Nicotianatabacum)腺毛由表皮細(xì)胞分化而來，其中，長柄分泌型腺毛是主要的分泌場所，可以分泌萜類、糖脂類、酮類等多種化學(xué)物質(zhì)[1]，而長柄非分泌型腺毛為多細(xì)胞矛狀結(jié)構(gòu)，不具備分泌能力。

煙草長柄分泌型腺毛分泌物主要由雙萜化合物類西柏三烯二醇、順-冷杉醇、賴百當(dāng)二醇及糖脂類等組分構(gòu)成，可達(dá)葉片干質(zhì)量的10%以上[2]。這些組分是煙葉中香氣物質(zhì)的重要前體，對煙葉品質(zhì)具有重要影響[3]；而且，腺毛分泌物中的萜類物質(zhì)對蚜蟲有顯著的抵抗作用，可以有效降低蟲害及病毒病的發(fā)生[4]。普通煙草品種中長柄分泌型和長柄非分泌型腺毛同時(shí)存在，但不同品種中2種腺毛類型所占比例不同[5]，長柄分泌型腺毛比例較高的品種葉面分泌物含量較高，品質(zhì)較好[6]。因此，提高長柄分泌型腺毛的比例和密度，是改良煙葉品質(zhì)及提高煙株抗性的手段之一。近年來，國內(nèi)多個(gè)煙草育種單位開始以腺毛分泌物含量為育種目標(biāo)開展相關(guān)育種研究，然而，烤煙育種中可有效利用的高腺毛分泌物種質(zhì)資源較少[7]。前人研究發(fā)現(xiàn)了一些煙草腺毛突變體材料，如T.I.1068，長柄腺毛純粹由分泌型組成，缺乏非分泌型腺毛，而且長柄分泌型腺毛密度高，分泌物能在腺毛頭部形成分泌囊，分泌旺盛，屬于高分泌型煙草突變材料[8]，是進(jìn)行腺毛遺傳改良的重要種質(zhì)資源。

煙草腺毛的發(fā)生受到許多因素的調(diào)控，例如土壤、肥料、光照、溫度、水分等諸多環(huán)境因素均會影響煙草的腺毛密度[9-11]，但遺傳因素在腺毛發(fā)生過程中起著決定性作用，不同煙草品種[6]及葉片不同發(fā)育時(shí)期[12]，腺毛密度及分泌物均有較大差異。由于煙草長柄腺毛分泌物對煙葉品質(zhì)的影響較大，因此，對長柄分泌型和長柄非分泌型腺毛之間的相對比例進(jìn)行研究，能夠更加準(zhǔn)確地描述腺毛密度的遺傳規(guī)律。然而，目前針對煙草長柄分泌型和長柄非分泌型腺毛相對比例遺傳特性的研究較少，嚴(yán)重制約了煙草腺毛遺傳改良工作。鑒于此，以2種不同腺毛類型的煙草材料T.I.1068和T.I.1112為親本，構(gòu)建多世代群體并統(tǒng)計(jì)2種腺毛在不同世代的表型比例，進(jìn)行遺傳分析，明確長柄分泌型和長柄非分泌型腺毛相對比例的遺傳模式，為解析2種腺毛類型發(fā)生的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制，促進(jìn)腺毛類型和密度的遺傳改良提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

長柄純分泌型腺毛煙草材料T.I.1068和長柄純非分泌型腺毛煙草材料T.I.1112，均由國家煙草種質(zhì)資源庫提供。

利用上述2份煙草材料配制雜交組合(T.I.1068×T.I.1112)，分別獲得P1、P2和F1、F2、BC1、BC26個(gè)世代群體，播種于河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所試驗(yàn)基地。采用漂浮方式育苗，每盤200株。P1、P2各播種0.5盤，F(xiàn)1、F2、BC1、BC2各播2盤。

1.2 試驗(yàn)方法

腺毛類型鑒定：成苗期(7～8葉)分別對6個(gè)世代群體的腺毛類型進(jìn)行觀察。選取10 cm長的葉片，用 2 g/L羅丹明水溶液染色10～15 min，將染色后的葉片分別在裝有清水的 4 個(gè)燒杯中依次浸泡5 s，去除未結(jié)合羅丹明，通風(fēng)條件下自然晾干。在葉片中部沿主脈2側(cè)1 cm處剪取 6 mm×8 mm 組織塊，葉面朝上置于 VHX-5000 超景深顯微鏡下(日本基恩士公司)進(jìn)行葉片上表面腺毛形態(tài)觀察和腺毛密度統(tǒng)計(jì)。采用移動(dòng)鏡臺對葉片進(jìn)行掃描，每片連續(xù)掃描3個(gè)視野進(jìn)行腺毛計(jì)數(shù)，取3個(gè)觀察值的平均數(shù)作為每個(gè)樣品的腺毛密度值。

為了便于分析，根據(jù)調(diào)查結(jié)果，把長柄分泌型腺毛占長柄腺毛總數(shù)的比例分為0～10%(即≥0且<10%,下同)、10%～25%、25%～50%、50%～75%、75%～90%、90%～100% 6個(gè)類別。

1.3 遺傳分析

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草材料 T.I.1068和T.I.1112葉片的腺毛觀察

成苗期對T.I.1068和T.I.1112葉片腺毛進(jìn)行比較觀察，由圖1可以看出，T.I.1068葉片表面只有長柄分泌型和短柄分泌型2種腺毛，而T.I.1112表面只有短柄分泌型和長柄非分泌型2種腺毛。

a.長柄分泌型腺毛；b.短柄分泌型腺毛；c.長柄非分泌型腺毛

2.2 煙草腺毛類型的遺傳分析

2.2.1 不同世代腺毛類型的比例分布 對6個(gè)世代單株葉片長柄分泌型腺毛所占比例進(jìn)行調(diào)查，不同比例的株數(shù)如圖2所示。從圖2可以看出，F(xiàn)1代中，11%的植株腺毛表型為純長柄分泌型，89%的植株為長柄混合型，無長柄純非分泌型，即表現(xiàn)為親本T.I.1068的性狀，說明長柄腺毛類型受顯性基因控制。F2代群體的長柄分泌型腺毛表型呈現(xiàn)較鮮明的雙峰偏態(tài)分布，主基因特征的長柄分泌型在遺傳中顯現(xiàn)出來，同時(shí)該性狀還受多基因控制，即長柄分泌型腺毛顯現(xiàn)為主基因+多基因的遺傳特性。

圖2 雙親及F1、F2長柄分泌性腺毛所占比例分布

2.2.2 主基因+多基因的遺傳性分析 利用IECM方法計(jì)算，對6個(gè)世代的長柄分泌型腺毛的比例進(jìn)行遺傳分析，得到5類24種模型的極大似然值和AIC值(表1)。依據(jù)AIC準(zhǔn)則，選擇AIC值相對較小的5個(gè)模型MX2-ADI-ADI、MX2-AD-AD、MX2-AED-AD、MX2-ADI-AD、MX1-AD-ADI為遺傳模型的備選模型。對得到的5個(gè)遺傳模型進(jìn)一步進(jìn)行適合性檢驗(yàn)，如表2所示。比較各個(gè)模型的統(tǒng)計(jì)量，發(fā)現(xiàn)MX2-ADI-ADI模型數(shù)值中有11個(gè)差異達(dá)到顯著水平，其他模型達(dá)到顯著水平的數(shù)值均大于或等于12個(gè)，故將MX2-ADI-ADI模型作為長柄分泌型腺毛的最優(yōu)遺傳模型，即2對加性-顯性上位性主基因+加性-顯性上位性多基因模型。

表1 不同遺傳模型的 MLV值和AIC值

表2 遺傳模型的適合性檢驗(yàn)

2.2.3 遺傳效應(yīng)分析 針對最優(yōu)遺傳模型MX2-ADI-ADI進(jìn)一步進(jìn)行參數(shù)估計(jì)分析(表3)，由表3可知，第1對主基因的加性效應(yīng)值和顯性效應(yīng)值基本接近，表明第1對主基因的加性效應(yīng)和顯性效應(yīng)基本相當(dāng)；第2對主基因的加性效應(yīng)值明顯大于顯性效應(yīng)值，表明第2對主基因以加性效應(yīng)為主。2對主基因間顯性×顯性互作效應(yīng)值為-74.346 3，說明這2對主基因之間的互作以顯性效應(yīng)為主且為負(fù)效應(yīng)?；虻募有?、顯性之間的互作均為負(fù)值，說明在進(jìn)行腺毛類型選擇時(shí)應(yīng)該考慮到基因間互作作用的影響。

表3 遺傳參數(shù)估計(jì)

BC1、BC2和F2世代長柄分泌型腺毛主基因的遺傳率分別為80.05%、97.88%和96.50%，主基因遺傳率很大，可以在雜交分離早代進(jìn)行長柄腺毛種類的選擇，BC1、BC2和F2世代中多基因的遺傳率分別為16.15%、1.55%、2.75%，BC2和F2世代多基因的遺傳率較小，基本不予考慮，BC1代要考慮到多基因的影響。

3 結(jié)論與討論

煙草腺毛分泌物不僅可以增強(qiáng)煙株對蚜蟲的抗性[17]，同時(shí)也能有效提高煙葉品質(zhì)，因此，選育高腺毛分泌物含量的煙草品種具有重要的應(yīng)用價(jià)值。對腺毛發(fā)生遺傳規(guī)律進(jìn)行深入研究，進(jìn)一步定位控制長柄分泌型腺毛發(fā)生的基因，開發(fā)與之緊密連鎖的分子標(biāo)記并用以輔助選擇育種，將有效促進(jìn)高腺毛分泌物含量煙草品種的選育。BURK等[18]利用T.I.1112與2個(gè)烤煙品種構(gòu)建的遺傳群體進(jìn)行研究，認(rèn)為長柄分泌型腺毛的發(fā)生受3對基因調(diào)控，JOHNSON等[19]利用T.I.1112與具有不同腺毛特征的3份煙草材料構(gòu)建的遺傳群體進(jìn)行研究，也發(fā)現(xiàn)長柄分泌型腺毛的發(fā)生受3對基因的調(diào)控。然而，上述研究只是分析了長柄分泌型腺毛發(fā)生的遺傳規(guī)律，分析得到的主效基因只是影響腺毛密度的一個(gè)影響因素。由于煙草表面同時(shí)存在多種類型的腺毛，因此，長柄分泌型腺毛的發(fā)生不可避免地會受到其他類型腺毛的影響，以不同腺毛類型之間的相對比例為切入點(diǎn)開展研究，能夠從不同角度描述腺毛類型的遺傳規(guī)律。

采用主基因+多基因混合遺傳模型分析，根據(jù)表型就能初步判定遺傳模型，可以為后期的基因定位提供依據(jù)，同時(shí)對于育種親本選擇也有一定理論意義。目前，該方法在煙草抗病性(白粉病、青枯病、赤星病和黑脛病)[20-23]、植物學(xué)性狀的葉數(shù)[24]、株高[25]、煙堿含量[26]、烘烤特性[27]等重要性狀的遺傳研究上已有相關(guān)報(bào)道，但在煙草腺毛類型的遺傳研究上較少。

本研究利用2份不同腺毛類型的煙草突變體T.I.1068和T.I.1112為親本，構(gòu)建了自交和回交群體，對長柄分泌型和長柄非分泌型腺毛的遺傳規(guī)律進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草長柄分泌型腺毛所占比例的遺傳是由2對加性-顯性上位性主基因+加性-顯性上位性多基因模型控制。這與JOHNSON等[19]得出的3對主效基因模型不一致，可能是由于基因緊密連鎖等原因使得一些微效基因的效應(yīng)累加，表現(xiàn)出了主效基因的效應(yīng)；另外，本研究以長柄分泌型腺毛的占比作為研究對象，而前人以長柄分泌型腺毛的發(fā)生作為研究對象，二者的調(diào)控基因也可能存在差異，從而造成研究結(jié)果不一致，這還需要進(jìn)一步的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，影響腺毛類型的主基因遺傳率很高，在BC1、BC2和F2世代中分別為80.05%、97.88%和96.50%，說明其受環(huán)境影響較小，適合在早代進(jìn)行選擇。值得注意的是，2對主效基因之間的互作存在著負(fù)效應(yīng)，JOHNSON等[19]研究也發(fā)現(xiàn)了該現(xiàn)象，因此在進(jìn)行品種選育時(shí)需要考慮其影響。

綜上，采用主基因+多基因混合遺傳模型對分泌型煙草T.I.1068 和非分泌型煙草T.I.1112的長柄腺毛的遺傳特性進(jìn)行分析，最終確定，長柄分泌型腺毛與非分泌型腺毛的相對比例受2對加性-顯性上位性主基因+加性-顯性上位性多基因控制，且以主基因效應(yīng)為主，同時(shí)受基因間互作的影響。