基于SSR分子標記的紅安縣省沽油遺傳多樣性分析

李 靜，田思雨，毛威濤，姚國新,2

(1.湖北工程學院 生命科學技術(shù)學院，湖北 孝感 432000；2.糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430000)

省沽油(StaphyleabumaldaDC)是省沽油科(Staphyleaceae)省沽油屬(Staphylea)植物，優(yōu)質(zhì)的藥食兩用木本，屬珍稀經(jīng)濟植物，是我國罕見的食用灌木[1-2]，也可作觀賞苗木，利用價值極高。其頂生白花似珍珠，也被稱為珍珠花，花蕾和幼葉口味清香且富含大量人體所必需的營養(yǎng)元素，有助于增強人體免疫力而受到人們的廣泛喜愛[3]；其果實可治療干咳，根可治瘀，長期食用省沽油能明顯降低血壓、血脂[4]。目前，對省沽油的研究主要集中在繁育技術(shù)[5-7]、營養(yǎng)成分[8]、藥用價值[9]和油分含量[10-11]等方面，分子生物學方面的研究報道較少[12-14]。由于省沽油資源量小，以采摘花蕾為主，很少留花結(jié)果，且種子發(fā)芽率低，導致其分布零散[15]，加之缺乏管理和保護，導致相當部分省沽油野生資源被破壞。紅安縣地處湖北省孝感市，省沽油分布范圍較廣，多為零星小片分布，偶有成片種植，當?shù)鼐用裼惺秤檬」劣偷牧晳T，隨著近年來的開發(fā)建設，省沽油野生資源破壞嚴重，急需進行資源保護和遺傳多樣性研究。為此，采集紅安縣內(nèi)24份省沽油野生材料，利用SSR(Simple sequence repeats)標記研究紅安縣省沽油的遺傳多樣性，以期為省沽油植物種質(zhì)資源保護利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2019年4月，在湖北省紅安縣24個地點(表1)采集省沽油的幼嫩葉片，裝入自封袋中，放入冰盒帶回實驗室，-20 ℃低溫冰箱保存，用于DNA提取。

表1 紅安縣省沽油采樣地點

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取試劑配制 參考趙靜等[16]改良的CTAB(Cetyl-trimethyl-ammonium bromide)法配置DNA提取試劑，每100 mL CTAB溶液中包含2.5 mol/L NaCl 56 mL、PVP(Polyvinyl pyrrolidone)1 g、0.5 mol/L EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid)4 mL、1 mol/L Tris(Tris metyl aminomethane)-HCl 10 mL、CTAB 2 g。

1.2.2 DNA提取 采用改良CTAB法提取紅安省沽油幼嫩葉片的DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，稀釋至20 ng/μL后-20 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 SSR引物 利用前期檢測到的有多態(tài)性的21對引物(結(jié)果未發(fā)表，詳見表2)進行省沽油遺傳多樣性分析。

表2 SSR標記信息

1.2.4 PCR(Polymerase chain reaction)擴增及電泳 PCR反應體系：PCR-Mix 5 μL，上、下游引物各1 μL(10 ng/μL)，DNA模板1 μL，加水補充至10 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃ 50 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR擴增產(chǎn)物用8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳[17]，并進行銀染[18]。

1.2.5 遺傳多樣性分析 統(tǒng)計聚丙烯酰胺凝膠電泳圖條帶，依據(jù)SSR標記統(tǒng)計的數(shù)據(jù)(按照分子質(zhì)量從大到小的順序，將不同等位純合變異位點編號為AA、BB、CC、DD、…；雜合位點按等位變異組成大小編號為AB、BC、AC、AD、BD、CD、…)形成矩陣，利用PopGene 32軟件計算不同地點省沽油的觀測等位變異數(shù)(Observed number of alleles,Na)、有效等位變異數(shù)(Effective number of alleles,Ne)、Shannon-Weaver多樣性指數(shù)(Shannon’s information index,I)、觀測雜合度(Observed heterozygosity,Ho)、期望雜合度(Expected heterozygosity,He)、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)(Nei’s genetic diversity index,H)等。根據(jù)NEI[19]的方法計算標記位點的多態(tài)性信息含量(Polymorphism information content，PIC)。

1.2.6 聚類分析 統(tǒng)計電泳圖條帶，有、無分別記為1、0，形成矩陣，利用NTSYSpc 2.10軟件計算24個省沽油的遺傳相似系數(shù)(Genetic similarity coefficient ,GS)，采用UPGMA進行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅安縣省沽油SSR標記多態(tài)性位點分析

本研究利用21對引物對紅安縣不同地點24個省沽油樣本進行檢測，圖1為引物S086擴增產(chǎn)物電泳圖。共檢測到56個等位變異(表3)，每對引物等位變異數(shù)為2～5個，平均每對引物可檢測到2.95個等位變異，引物S100擴增等位變異最多，達到5個，其次是S052、S060、S086、S095，均為4個。21對引物的Ne為0.635 4～2.748 2個，平均為1.622 3個。各引物的PIC值為0.115 4～0.752 3，平均為0.438 9，12對引物檢測到的PIC超過平均值，占所有引物的57.14%。

圖1 紅安縣省沽油S086引物擴增產(chǎn)物檢測結(jié)果

表3 紅安縣省沽油的多樣性指數(shù)分析

2.2 紅安縣省沽油的遺傳多樣性分析

紅安縣省沽油的I為0.296 3～1.731 9，平均為0.772 9，最小的是引物S094，最大的為引物S086；Ho為0.102 7(S095)～0.412 3(S021)，平均值為0.241 5；He為0.129 7(S090)～0.413 9(S001)，平均值為0.250 2；H為0.157 4(S071)～0.762 5(S086)(表3)。所篩選出的21對SSR引物能較好地反映紅安縣不同地點間省沽油的遺傳多樣性信息。

2.3 紅安縣省沽油的聚類分析

進行聚類分析發(fā)現(xiàn)(圖2)，紅安縣省沽油的GS值為0.58～0.93，平均值為0.78。其中，C04和C16、C05和C06的GS值最大(0.93)，距離最近；C05與C20的GS最小(0.58)，距離最遠。將紅安縣省沽油分為兩大類，C20(上觀音墩)、C17(張家崗)和C23(段家凹)3個地點的省沽油聚為第Ⅰ類，其余地點省沽油聚為第Ⅱ類。第Ⅱ類可再分為兩類，C09(石林寺)、C22(塘塆)、C24(上屋沖)、C11(沙嶺咀)、C19(李家灣)、C21(彭唐)、C12(仰天窩)、C14(新屋沖)聚為Ⅱ-1類,C01(李家凹)、C02(中程崗)、C10(上孫家)、C18(西河口)、C03(黃獅沖)、C04(和平場)、C08(暗沖)、C16(高山崗)、C13(汪家)、C15(董家盆水庫)、C05(況家寨)、C06(黑沖)、C07(窯包山)聚為Ⅱ-2類。

圖2 紅安縣省沽油的聚類分析

3 結(jié)論與討論

本研究利用21對SSR引物對紅安縣不同地點的24個省沽油樣本進行遺傳多樣性研究，平均每對引物擴增出2.95個等位變異，Ne平均為1.622 3個，I平均值為0.772 9，H平均值為0.361 8。與陳龍燦等[12](Ne=1.271，H=0.165，I=0.257))、李鳳鳴等[13](Ne=1.325 3，H=0.196 4，I=0.302 3)、葉歡等[14](Ne=1.431 9，H=0.265 3，I=0.411 8)研究結(jié)果相比，湖北省紅安縣野生省沽油的遺傳多樣性水平較高。省沽油主要為蟲媒植物，各地種群之間相隔一定距離，不能進行廣泛的基因交流，遺傳多樣性的保護應以種群間為主，種群內(nèi)為輔。

本研究將紅安縣的24個省沽油分樣本為兩大類，C20(上觀音墩)、C17(張家崗)和C23(段家凹)3個地點的省沽油聚為第Ⅰ類，其余地點省沽油聚為第Ⅱ類。不同種源的省沽油種子的脂肪酸含量等性狀有較大的差異[20]，通過聚類分析可篩選出優(yōu)良種質(zhì)進行人工馴化栽培，推進紅安縣的林業(yè)經(jīng)濟發(fā)展。