高效液相色譜法測定止咳平喘合劑中4種成分含量

朱正華，王，張 馨

（云南省曲靖市食品藥品檢驗檢測中心，云南 曲靖 655000）

止咳平喘合劑是云南省曲靖市中醫(yī)醫(yī)院研制的院內制劑，由苦杏仁、陳皮、前胡、法半夏、化橘紅、重樓、炙瓜蔞皮等組方，具有祛痰降氣、止咳平喘的功效，用于治療感冒咳嗽、咽干痰稠、喘促胸悶、久咳不止［1］。方中主藥為陳皮、化橘紅、當歸，其中，陳皮、化橘紅來源于同蕓香科不同種，均含有豐富的揮發(fā)油及黃酮類化合物，陳皮主要含有橙皮苷、新橙皮苷，化橘紅主要含柚皮苷、新橙皮苷及少量橙皮苷，且結構非常相似。陳皮和化橘紅的揮發(fā)油有刺激性祛痰作用，辛散溫通，氣香而燥，既能行肺氣之壅滯，又能燥濕濁而化痰，故常用于治療痰濕阻肺、咳嗽痰多、胸膈滿悶、頭目眩暈等證；當歸可活血通絡祛瘀［2-7］。諸藥合用，宣降得宜，祛邪而不傷正，扶正而不留邪，溫而不燥，潤而不膩，令肺氣調暢，咳嗽自止。本研究中參照文獻［8-13］，以阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷為定量控制指標，采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法進行含量測定，可為止咳平喘合劑的質量標準研究提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），包括G1311A系列四元泵、G1315D DAD檢測器、G1316A柱溫箱、G1329A自動進樣器、二極管（分辨率為0.74 nm，波長精度為1 nm）；KQ-300UDB型雙頻數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為120～300 W，頻率為 45／80 kHz）；Mettle MS205DU 型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司，精度為0.1 mg 和 0.01 mg）；Purelab FLex 3 型一體式超純水儀（英國ELGA公司，制水符合實驗室一級水要求）。

圖1 高效液相色譜圖

1.2 試藥

阿魏酸對照品（批號為110733-201614，含量為99.0% ），蕓 香 柚 皮 苷 對 照 品 （ChromaDex，批 號 為00014230-803，含量為 100.0% ），柚皮苷對照品（批號為 110722-201613，含量為 94.3%），橙皮苷對照品（批號為110721-201818，含量為96.2%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇（色譜純，德國默克公司，批號為1046707 936）；冰醋酸（分析純，四川西隴科學有限公司，批號為190610，含量不低于99.5%）；水為超純水；止咳平喘合劑（云南省曲靖市中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，批號分別為 181003，181108，181206）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODS Hypersil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -5% 醋酸（20 ∶80，V／V）；流速：1.0 mL ／min；柱溫：35 ℃；檢測波長：283，323 nm；進樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

對照品溶液：取阿魏酸對照品12.40 mg，蕓香柚皮苷對照品 17.20 mg，柚皮苷對照品 17.03 mg，橙皮苷對照品13.68 mg，精密稱定，分別置4個10 mL容量瓶中，加甲醇使溶解，定容，搖勻，分別精密量取0.1，0.5，3.0，5.0 mL 置同一 25 mL 容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液（阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷質量濃度分別為 4.910，34.400，192.700，263.200 μg ／mL）。

供試品溶液：精密量取樣品（批號為181003）10 mL，置50 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率為 300 W，頻率為 40 kHz）5 min，加甲醇溶解，定容，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對照品溶液：按止咳平喘合劑的處方工藝，稱取除陳皮、化橘紅、當歸以外的其他藥材，按處方制備陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

系統(tǒng)適用性試驗及專屬性考察：取2.2項下3種溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進樣，記錄色譜圖。阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷的保留時間依次為8.9，11.7，14.0，17.0 min，理論板數(shù)依次為 9 211，6 238，6 507，6 167。4 種成分均分離完全，陰性對照品溶液在與混合對照品溶液相應峰處未見色譜峰出現(xiàn)，表明制劑中其他藥物及輔料對測定無干擾。色譜圖見圖1。

線性關系考察：精密吸取混合對照品溶液0，1.25，2.5，5，10 mL，置 10 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。按擬訂色譜條件進樣測定，以質量濃度（C）為橫坐標、峰面積（A）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

表1 4種成分線性關系考察結果

精密度試驗：精密吸取混合對照品溶液，連續(xù)進樣5次。結果阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD分別為 0.34%，1.10%，0.45%，0.29%（n＝5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取同一批（批號為181003）樣品5份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷含量的RSD分別為 0.36% ，0.85% ，0.82% ，0.40%（n＝5），表明方法重復性良好。

穩(wěn)定性試驗：依法制備供試品溶液，分別于配制后0，4，8，12，16，24，48 h 時進樣測定，記錄峰面積。結果阿魏酸、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷峰面積的RSD分別為 0.86%，0.82%，0.71%，0.62%（n＝7），表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：分別量取已知含量的樣品（批號為181003）5.0 mL，共 6 份，分別加入單標對照品溶液（阿魏酸 49.104 μg ／mL，蕓香柚皮苷 275.20 μg ／mL，橙皮苷 658.00 μg ／mL）各 1 mL，擬訂單標溶液柚皮苷（1 606.0 μg ／mL）1.5 mL，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，并計算回收率。結果見表2。

表2 加樣回收試驗結果（n＝6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，各3份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別進樣，記錄峰面積，以外標法計算各成分含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（n＝3）

3 討論

檢測波長選擇：曾采用單波長283 nm檢測，但供試品溶液中阿魏酸含量偏低，色譜峰偏小，故采用雙波長檢測，于阿魏酸最大吸收波長（323 nm）峰面積增大，利于檢出，且精密度好。

流動相選擇：曾采用乙腈、甲醇分別和0.1%磷酸、5%醋酸配比，最后確定流動相為甲醇-5%醋酸（20∶80，V／V），其基線平穩(wěn)，主成分峰形及分離效果較好。

樣品提?。合群罂疾炝思状汲曁崛?、50%甲醇超聲提取及加水振搖混勻。發(fā)現(xiàn)3種提取方式對于主成分含量均無顯著影響，考慮到樣品制備與對照品溶液制備溶劑應盡可能相同，故選擇甲醇為溶劑進行超聲提取。

取樣量確定：樣品處理過程中，4種成分的含量極差稍大，經反復試驗，最后確定取樣量為10 mL，稀釋至50 mL。

在測定過程中，樣品的分離度較好，陰性樣品無干擾。該方法簡便、快捷、準確，可控制該處方中多味藥材的質量。