乳癖平顆粒質(zhì)量標準研究

胡 斌，胡 婧，鄧 莉，馬 攀

（中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院藥劑科，重慶 400038）

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海精科實業(yè)有限公司）；BT124S 型電子天平（精度為 0.1 mg），BP 211D 型電子天平（精度為0.01 mg），均由賽多利斯科學儀器有限公司生產(chǎn)；KQ-4000KDE型高功率數(shù)控清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）；硅膠G薄層板（青島海浪硅膠干燥劑廠）；聚酰胺薄膜（浙江省臺州市路橋四甲生化塑料廠）。

1.2 試藥

表兒茶素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為 110878-200102，純度為 100.0%）；枸櫞酸對照品（批號為 100396-200302，純度為 100.0% ），芒柄花素對照品（批號為 111703-200603，純度為 100.0% ），均購自中國食品藥品檢定研究院；山楂對照藥材（批號為121138-200905），雞血藤對照藥材（批號為121173-200903），均購自中國藥品生物制品檢定所；乳癖平顆粒（批號分別為 180805，180815，180820，180826，180828，180910，180912，180916，180920，180928，我院院內(nèi)制劑）；乙腈、甲醇（色譜純，美國 Tedia公司）；超純水、其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

山楂：取樣品10g，加甲醇20mL，超聲處理15min，濾過，取濾液作為供試品溶液。取處方中除山楂藥材以外的其余藥材，制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取山楂對照藥材0.1 g，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。再取枸櫞酸對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.125 mg的對照品溶液。取上述4種溶液各8 μL，分別點于同一塊聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯 -甲醇 -甲酸（10∶4∶1，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以0.1%溴甲酚綠乙醇溶液，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

圖1 薄層色譜圖

雞血藤：取樣品10 g，加乙醚 100 mL，超聲處理30 min，分取乙醚層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。取處方中除雞血藤藥材以外的其余藥材，制成陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。另取雞血藤對照藥材4 g，加水煎煮2次，濃縮至10 mL，加乙醚20 mL，按供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液。再取芒柄花素對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的對照品溶液。取上述4種溶液各20 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-氯仿 -乙酸乙酯（20∶3∶12，V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈下（254 nm）檢視。供試品溶液色譜中，在與對照品溶液、對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil C18柱（200 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.1% 磷酸溶液（11 ∶89，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

取表兒茶素對照品（批號為 110878-200102）10.27 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋、溶解、定容并搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.4108 mg／mL的表兒茶素對照品貯備液；取貯備液1 mL，置25 mL容量瓶中，用甲醇稀釋成每1 mL含16.43 μg的對照品溶液。取乳癖平顆粒，研細，取2.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（60 kHz）處理 30 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例取缺山楂、雞血藤的各藥材，加水煎煮，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

作為小學教師，應當走出傳統(tǒng)教學模式的束縛，做到以人為本，重視學生的主體地位，真正結(jié)合學生的認知能力、心理特點和年齡特性，合理開發(fā)和利用教育資源，通過信息化、多媒體的教學手段，來讓學生真正參與其中，發(fā)揮他們的主觀能動性，通過多樣化、個性化的信息學習體驗，來幫助學生更深入地學習理論知識。

圖2 反相高效液相色譜圖

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別取 2.2.2項下 3種溶液各 20 μL，進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果見圖2。

線性關(guān)系考察：取表兒茶素對照品10.27 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入甲醇稀釋、溶解并定容至刻度，得質(zhì)量濃度為 410.8 μg／mL 的溶液。分別取 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，稀釋至 10 mL，制成質(zhì)量濃度為8.216，16.432，24.648，32.864，41.080 μg ／mL 的對照品溶液，進樣20 μL，記錄色譜圖，以進樣質(zhì)量濃度為橫坐標（C）、峰面積為縱坐標（A）繪制標準曲線，得回歸方程A＝14.25C＋2.58，r＝0.999 9（n＝5）。結(jié)果表明，表兒茶素質(zhì)量濃度在 8.216 ～41.08 μg／mL 范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗：精密吸取同一對照品溶液20 μL，按擬訂色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積。結(jié)果的RSD為0.76%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（批號為180910）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，于常溫下放置 0，2，4，6，12，24 h后進樣，測定峰面積。結(jié)果的RSD為1.88%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復性試驗：取乳癖平顆粒（批號為180910）共6份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果測得表兒茶素含量平均值為0.271 8 mg／g，RSD為1.89%（n＝6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取 6 份已知含量（0.271 8 mg ／g）的乳癖平顆粒（批號為 180910）1.0 g，精密稱定，另取表兒茶素對照品12.10 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，取5 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得對照品溶液（每1 mL含表兒茶素0.242 0 mg）。精密量取對照品溶液1 mL，置各樣品中，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果見表1。

表1 表兒茶素加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

分別取10批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果批號分別為 180805，180815，180820，180826，180828，180910，180912，180916，180920，180928 的樣品中每 10 g 表兒茶素的含量平均值約為1.40 mg?？紤]到中藥材原料含量季節(jié)性強、波動大，以平均值下浮20%制訂本制劑的含量限度，故暫定每袋顆粒（10 g）中表兒茶素不得低于1.12 mg。

3 討論

3.1 薄層色譜條件選擇

在進行TLC鑒別時，考慮可能保留的成分為水溶性成分，根據(jù)文獻［4-6］與預試驗結(jié)果綜合分析，確定鑒別成分為山楂中的枸櫞酸和雞血藤中的芒柄花素。在山楂的TLC鑒別中，曾嘗試了以展開劑三氯甲烷-甲醇 -甲酸（10 ∶1 ∶0.1，V／V／V）［7］為基礎，調(diào)整比例，在硅膠G板上展開，分離效果不好，干擾大，把硅膠G板變?yōu)榫埘０繁∧ず?，發(fā)現(xiàn)聚酰胺薄膜對枸櫞酸這種極性化合物有特異的分辨能力，分離效果明顯改變。優(yōu)化展開劑，用極性更大更環(huán)保的乙酸乙酯代替三氯甲烷，調(diào)節(jié)各組分比例，展開劑變?yōu)橐宜嵋阴?甲醇-甲酸（10∶4∶1，V／V／V）后，薄層色譜效果明顯變好，顯色后黃色斑點清晰，無干擾，分離度好。在雞血藤的TLC鑒別中，嘗試了多種展開劑［8-11］，雜質(zhì)多，干擾大，改用乙醚代替乙酸乙酯提取后，雜質(zhì)明顯減少，調(diào)整展開劑后，分離度好，無干擾，定為最優(yōu)條件。

3.2 HPLC條件選擇

曾對聚酰胺柱色譜法［12］與超聲提取法進行了比較，發(fā)現(xiàn)聚酰胺柱色譜法能很好地去除供試品中的雜質(zhì)，但耗時長，損失大；超聲提取法方便、快捷，但雜質(zhì)含量較高，考慮到實際生產(chǎn)檢驗需要，選取了快捷、高效、方便的超聲提取法，通過改變HPLC條件［12-15］，達到測定目的。

3.3 指標成分選擇

曾以枸櫞酸［7，16-17］、芒柄花素［9］、熊果酸［18］及金絲桃苷［19-20］為主要指標成分，采用HPLC法對其進行測定。枸櫞酸對照品9 min后出峰，樣品成分復雜且含量在此處干擾峰多，曾試過多種提純方法，效果不明顯；芒柄花素、金絲桃苷及熊果苷均是對照品出峰正常，供試品中均無相應峰出現(xiàn)?？紤]枸櫞酸、芒柄花素都是TLC鑒別的成分，含量、穩(wěn)定性都應優(yōu)于其他成分，應成為后期研究的重點。

3.4 提取方法及提取條件選擇

提取方法考察：取乳癖平顆粒（批號為180910）2.0g，精密稱定，分別采用超聲（60 kHz）處理30 min和加熱回流30 min的方法處理，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果加熱回流和超聲提取表兒茶素含量分別為0.23，0.24 mg／g?？梢?，2 種方法的提取率無明顯差異，因超聲處理較簡便，故采用超聲方法進行提取。

提取溶劑考察：取乳癖平顆粒（批號為180910）2.0g，精密稱定，分別用100%甲醇，80%甲醇，50%甲醇，30%甲醇各 25 mL，超聲（60 kHz）提取 30 min，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果表兒茶素含量分別為0.08，0.15，0.23，0.19 mg ／g?？梢?，采用 50% 甲醇提取時表兒茶素提取率較高，且雜質(zhì)較少，故選用50%甲醇作為提取溶劑。

提取溶劑量考察：取乳癖平顆粒（批號為180910）2.0 g，精密稱定，分別加入 50% 甲醇 10，20，25，30，40，50 mL，超聲（60 kHz）提取 30 min，按擬訂色譜條件進樣測定，計算含量。結(jié)果表兒茶素含量分別為0.20，0.22，0.23，0.23，0.23，0.24 mg ／g。可見，加入 50% 甲醇量為25 mL時，能基本將表兒茶素提取完全，故選用25 mL 50%甲醇為提取溶劑量。

提取時間考察：取乳癖平顆粒（批號為180910）2.0g，精密稱定，加入50%甲醇25 mL，分別超聲（60 kHz）提取 10，20，30，40，50，60 min，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果表兒茶素含量分別為 0.218，0.223，0.240，0.235，0.236，0.238 mg／g。可見，30 min 后，提取量無明顯變化，故提取時間確定為30 min。

3.5 方法評價

本研究中建立的質(zhì)量標準可控性好，操作簡單、快速，結(jié)果準確，可用于乳癖平顆粒的質(zhì)量控制。