不同炮制方法對渝產(chǎn)黃精體外抗氧化作用的影響*

馮 婧，胡娟娟△，何先元，操復(fù)川

（1.重慶醫(yī)藥高等專科學(xué)校，重慶 401331； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331；3.重慶市中醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會，重慶 400021）

黃精為2015年版《中國藥典（一部）》收載的中藥品種，為百合科黃精滇黃精Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.、黃精Polygonatum sibiricumRed.或多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua的干燥根莖。黃精經(jīng)炮制后入藥，生黃精有麻味，刺入咽喉，蒸后補脾、潤肺、益腎的功效增強，可除去麻味，同時外觀顏色由淡黃色或黃棕色變?yōu)樽睾稚梁谏?。制黃精性平，味甘，歸脾、肺、腎經(jīng)，具有補氣養(yǎng)陰、健脾、潤肺、益腎之功效［1］，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，其具有降血糖［2］、抗疲勞［3］、提高免疫［4］等藥理作用。近年來，為實施重慶中藥產(chǎn)業(yè)振興，重慶大力發(fā)展多花黃精種植，先后在石柱、彭水、秀山等地建立了種植基地，致力將多花黃精發(fā)展為渝產(chǎn)道地藥材大品種，打造“渝產(chǎn)綠色中藥”品牌。本研究中通過對渝產(chǎn)黃精體外抗氧化作用的研究，比較渝產(chǎn)黃精采用不同炮制方法后多糖得率與不同炮制品的水提物與醇提物體外抗氧化作用的影響，為蒸黃精炮制工藝規(guī)范的制訂提供參考，同時也為進一步在當?shù)亻_展產(chǎn)地加工炮制一體化提供參考?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV-1750型紫外分光光度計（島津儀器＜蘇州＞有限公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為200 W，頻率為40 kHz）；FW-100型高速粉碎機（上海金鵬分析儀器有限公司）；HH-6型恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司，精度為萬分之一）；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

黃精生品采自重慶市石柱縣中藥材種植基地，經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)何先元教授鑒定為百合科多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua的干燥根莖；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2-2-聯(lián)氮 -二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司，批號分別為 M07334，G61826）；葡萄糖（上海強順化學(xué)試劑有限公司，批號為20090801）；維生素C（美國Accustandard公司，批號為24040）；紹興黃酒（浙江鑒湖釀酒有限公司，批號為115242）；水為去離子水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃精不同炮制品制備

清蒸黃精：查閱黃精炮制歷史沿革及文獻［5］，選擇2005年版《貴州省中藥飲片炮制規(guī)范》中的清蒸黃精方法［6］。取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，大小分開，略泡，潤透，置適宜容器中清蒸8 h，燜12 h，取出，切厚片，在70℃下干燥。得樣品A1。

酒蒸黃精（黃酒）［7-8］：1）黃酒蒸 4h，取原藥材潤 4h 后置密閉燉藥罐中，加入黃酒，攪拌均勻，武火2 h后文火2 h，關(guān)火，燜4 h；取出，晾至外干內(nèi)潤，切厚片，50℃烘干；每 100 kg黃精用黃酒 20 kg；得樣品 A2。2）黃酒蒸 6 h，取原藥材潤6 h后置密閉燉藥罐中，加入黃酒，攪拌均勻，武火2 h后文火4 h，關(guān)火，燜6 h；取出晾至外干內(nèi)潤，切厚片，50℃烘干；每100 kg黃精用黃酒20 kg；得樣品A3。3）黃酒蒸8 h，取原藥材潤8 h后置密閉燉藥罐中，加入黃酒，攪拌均勻，武火2h后文火6h，關(guān)火，燜8h；取出，晾至外干內(nèi)潤，切厚片，50℃烘干；每100 kg黃精用黃酒20 kg。得樣品A4。

九蒸九曬黃精［9］：取原藥材，除去雜質(zhì)，洗凈，與適量（約10%用量）黃酒與凈生品黃精拌勻，并燜潤至酒吸盡，每100 kg黃精用黃酒20 kg。第1次蒸制，蒸至黃精中央發(fā)虛為度，曬干（蒸制過程注意收集黃精汁），取出，曬至外皮微干，將黃精拌入黃精汁和適量黃酒，并燜潤至輔料吸盡。反復(fù)蒸制、曬干，按第1次蒸制、曬干方法；再蒸，再曬至外皮微干，再拌入黃精汁、適量黃酒，如此反復(fù)，蒸制曬8次。第2～8次蒸制需使用黃酒總量的70%。第9次蒸制、曬干，最后將剩余（20%用量）黃酒及黃精汁一起拌入，蒸至外表棕黑色，有光澤。得樣品A5。以上 5個炮制品（A1～A5）與生品黃精（樣品 A6），粉碎，過40目篩，備用。

2.2 黃精多糖含量測定［10］

2.2.1 溶液制備

取干燥至恒重的樣品細粉0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，置水浴中回流1 h，趁熱過濾，殘渣用80%熱乙醇洗滌3次，每次10 mL，將殘渣及濾紙置燒瓶中，加水150 mL，置沸水浴中回流1 h，趁熱濾過，殘渣及燒瓶用熱水洗滌4次，每次10 mL，合并濾液與洗液，放冷，轉(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

取105℃干燥至恒重的葡萄糖50 mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，即得0.5 mg／mL葡萄糖標準溶液。分別吸取 0.5，1.0，1.5，2.5，4.0 mL置25 mL容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻，得系列對照品溶液。

取蒽酮0.8 g，精密稱定，用濃硫酸溶解并定容至500 mL，即得蒽酮-硫酸試劑。

2.2.2 方法學(xué)考察

標準曲線繪制：精密移取上述系列對照品溶液各2 mL，于具塞試管內(nèi)，分別加蒽酮-硫酸試劑5 mL，密塞，搖勻，置冰水浴中冷卻5 min，于100℃中水浴加熱10 min，取出，于冰水浴中冷卻5 min，以蒸餾水作為空白對照，在582 nm波長處測定吸光度。以質(zhì)量濃度（X）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝8.445 8X＋0.005 4（r＝0.996 4）。

精密度試驗：精密移取對照品溶液（質(zhì)量濃度為80 μg／mL）2 mL，按擬訂色譜條件進樣測定，連續(xù)測定6次。結(jié)果吸光度的RSD為0.05%（n＝6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗：取樣品（編號為A1）適量，依法制備供試品溶液，共6份，每份2 mL，置具塞試管中，按擬訂色譜條件進樣測定。結(jié)果吸光度的RSD為0.09%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取樣品（編號為A1）適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件分別于放置 0，1，2，3，4，5，6 h時測定吸光度。結(jié)果多糖含量的RSD為0.07%（n＝6），表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗：取已知黃精多糖含量的樣品（編號為 A1）6 份，每份 0.25 g，精密稱定，分別加入一定量葡萄糖對照品溶液，依法制備供試品溶液，進樣測定，并計算回收率。結(jié)果見表1。

2.2.3 黃精多糖含量測定

取樣品（編號為A1～A6）適量，依法制備供試品溶液，共3份，各2 mL，按擬訂色譜條件進樣測定，并計算黃精多糖的含量。結(jié)果見表2。

表1 黃精多糖加樣回收試驗結(jié)果（n＝6）

表2 多糖含量測定結(jié)果

2.3 水溶性浸出物試驗

取樣品2 g，精密稱定，置250 mL錐形瓶中，精密加水100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h后連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定質(zhì)量，用水補足減失的質(zhì)量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干，于105℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定。以干燥品計算供試品中水溶性浸出物的含量（%），結(jié)果見表3。

表3 浸出物含量測定結(jié)果（%）

2.4 醇溶性浸出物試驗

取供試品2 g，精密稱定，置250 mL錐形燒瓶中，精密加入乙醇100 mL，塞緊，稱定質(zhì)量，靜置1 h后連接回流冷凝管，水浴至沸騰，保持微沸1 h。放冷后取下燒瓶，塞緊，再稱定質(zhì)量，用乙醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，用干燥器濾過。精密吸取濾液25 mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，在105℃下干燥3 h，移至干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定。以干燥品計算供試品中醇溶性浸出物的含量（%），結(jié)果見表3。

2.5 黃精不同炮制品體外抗氧化活性研究［11-12］

2.5.1 溶液制備

黃精樣品水提物：稱取黃精生品與各炮制品各2.0g，置錐形瓶中，加水50 mL，靜置1 h，80℃水浴回流1 h，濾液減壓濃縮至干，稱定質(zhì)量，備用。

黃精樣品醇提物：稱取黃精生品與各炮制品各2.0g，置錐形瓶中，加無水乙醇50 mL，靜置1 h，80℃水浴回流1 h，濾液減壓，濃縮至干，稱定質(zhì)量，備用。

供試品溶液：取上述黃精水提物和醇提物，精密稱定，分別用50%乙醇配制為質(zhì)量濃度為1.0 mg／mL的溶液，用 50%乙醇稀釋成質(zhì)量濃度分別為1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 mg ／mL 的溶液。

維生素C溶液：取維生素C適量，精密稱定，用無水乙醇衡釋，配制為質(zhì)量濃度分別為 1.0，0.8，0.6，0.4，0.2，0.1 mg ／mL 的溶液。

2.5.2 DPPH 自由基清除能力

用無水乙醇溶解DPPH，配制成質(zhì)量濃度為0.1mmol／mL的溶液，取2 mL不同質(zhì)量濃度的供試品溶液置試管中，再向試管中依次加入2 mLDPPH溶液，避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度（As），以供試品溶液加入2 mL 50%乙醇溶液為樣品對照組（Ab），以DPPH溶液加入等量無水乙醇溶液作為空白對照組（Ac），維生素C作為陽性對照。每組重復(fù)3次，求平均值，按公式計算DPPH清除率（%）。

結(jié)果見表4和圖1?？梢姡煌S精炮制品與生品的水提物和醇提物均有效提高了對DPPH自由基的清除率，其中九蒸九曬黃精（A5）水提物的清除率最高。不同炮制方法均不同程度地影響各提取物的抗氧化活性，九蒸九曬法對黃精水提物的抗氧化活性有顯著影響，而清蒸法對黃精醇提物的抗氧化活性有顯著影響。4種酒蒸法對黃精醇提物的抗氧化活性的影響不大。由圖1可見，將各黃精樣品抗氧化活性與維生素C進行比較，在測定濃度范圍內(nèi)，樣品與維生素C對DPPH自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而增強，但各樣品的清除能力均弱于維生素C。

2.5.3 ABTS 自由基清除能力

將ABTS和K2S2O8用去離子水分別溶解并混合，使其最終濃度分別為7 mmol／L與2 mmol／L，在室溫、避光條件下靜置12 h，得ABTS溶液。測定時，用磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH ＝7.4）稀釋，734 nm 波長處吸光度為0.7±0.02，于-4℃保存?zhèn)溆?。分別向試管中加入0.5mL 不同質(zhì)量濃度供試品溶液和1.5 mL ABTS工作液，于室溫下避光靜置6 min，在734 nm波長處測定吸光度（A0），以1.5 mL ABTS溶液加入0.5 mL無水乙醇作空白對照（A）。維生素C作陽性對照，每組重復(fù)3次，求平均值。按下列公式計算ABTS清除率。

結(jié)果見表4和圖2，可見，黃精的不同炮制品與生品的水提物和醇提物均能有效提高對ABTS自由基的清除率，其中九蒸九曬黃精（A5）水提物的清除率最高。不同炮制方法均不同程度地影響提取物的抗氧化活性，九蒸九曬法對黃精水提物的抗氧化活性有顯著影響，生品黃精醇提物的抗氧化活性較其他炮制品強。由圖2可見，將各種黃精樣品抗氧化活性與維生素C進行比較，在測定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，樣品與維生素C對ABTS自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增大而增強，但其清除能力均弱于維生素C。

表4 渝產(chǎn)黃精及其炮制品各提取物對DPPH自由基的清除能力（mg／mL）

圖1 黃精生品、各炮制品水提物和醇提物與維生素C對DPPH自由基的清除能力

2.6.3 總還原能力的測定

分別取不同質(zhì)量濃度供試品溶液0.5 mL，同時加入磷酸鹽緩沖液（0.2 mol／L，pH ＝6.6）2.5 mL 和 1%鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混勻，置50℃水浴20 min，加入10% 三氯乙酸 2.5 mL，室溫靜置 10 min，取 2.5 mL 反應(yīng)液，加入蒸餾水2.5 mL和0.1%氯化鐵溶液0.5 mL。反應(yīng)10 min，測定700 nm波長處的吸光度值，以吸光度值的大小來表示樣品還原能力的大小。維生素C作陽性對照，每組重復(fù)3次，求平均值。結(jié)果見圖3。可見，黃精生品與各炮制品的水提液、醇提液和維生素C的總還原能力隨質(zhì)量濃度的升高逐漸增強，總還原能力在測定范圍內(nèi)，生品與各炮制品的水提物與醇提物均弱于維生素C。水提物的還原能力中，以九蒸九曬黃精（A5）最強，酒蒸黃精（A2）次之。在醇提物的還原能力中，以酒蒸黃精（A3）最強。綜合比較，水提物的總還原能力優(yōu)于醇提物。

圖2 黃精生品、各炮制品水提物和醇提物與維生素C對ABTS自由基的清除能力

3 討論

本研究中首次選用不同炮制方法對渝產(chǎn)黃精進行炮制，并測定生品及各炮制品的多糖含量，同時以3種體外抗氧化試驗對渝產(chǎn)黃精生品及各炮制品的抗氧化作用進行評價。結(jié)果表明，增加蒸制次數(shù)與延長蒸制時間會使黃精多糖含量降低，其中生品黃精的多糖含量最高，傳統(tǒng)九蒸九曬黃精多糖含量低于生品黃精。體外抗氧化試驗表明，不同炮制方法的黃精水提物與醇提物均能提高對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力，其中，傳統(tǒng)九蒸九曬法的水提物在清除自由基能力和總還原能力上優(yōu)勢明顯。生品與各炮制品醇提物的清除自由基和總還原能力均遠低于各品種水提物，提示清除自由基能力和還原能力的差異可能與黃精炮制后其中的活性物質(zhì)種類（多糖類或水溶性成分）和含量的不同有關(guān)。

圖3 黃精生品、各炮制品水提物和醇提物與維生素C的總還原能力

綜上所述，傳統(tǒng)九蒸九曬法炮制的黃精在體外抗氧化作用上有明顯優(yōu)勢。2015年版《中國藥典（一部）》中，黃精的炮制品種只收錄了生品黃精和酒黃精，但其炮制工藝復(fù)雜，且中藥更應(yīng)講究藥效。黃精具有降血糖［13-14］、抗氧化［15］、提高免疫力［4］、抗疲勞［3］等功效，故需要綜合考量渝產(chǎn)黃精的化學(xué)成分和作用機制，以評價其藥效。本研究結(jié)果可為渝產(chǎn)黃精藥材炮制生產(chǎn)過程控制和質(zhì)量控制提供了參考，但其炮制前后與藥效相關(guān)的活性成分還需作進一步研究。