基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討白花蛇舌草治療口腔癌的作用機(jī)制*

顧 磊 ，廖 維 ，周建萍

（1.武警重慶市消防總隊(duì)醫(yī)院口腔科，重慶 401120； 2.中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院麻醉科，重慶 400037； 3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院，重慶 401147）

口腔癌是臨床常見的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致患者死亡的重要原因［1］，具有高發(fā)病率、高致死率的特點(diǎn)［2-3］，臨床多采用手術(shù)切除、放射線治療、化學(xué)治療、中藥治療等方式治療。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，癌癥多由熱、毒、痰、瘀及體虛等因素誘發(fā)［4］，中藥以其療效確切、應(yīng)用廣泛、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，受到臨床醫(yī)師和科研人員的廣泛關(guān)注［5］。白花蛇舌草Oldenlandia diffusa屬茜草科植物，為臨床治療癌癥的常用藥物之一［6］，廣泛用于治療結(jié)直腸癌［7］、白血病［8］、肝癌［9］、肺癌［10］、卵巢癌［11］、乳腺癌［12］等。TING 等［9］對(duì)臺(tái)灣地區(qū)中草藥處方頻度進(jìn)行橫斷面分析發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草治療肝癌具有顯著療效。此外，白花蛇舌草具有抗增殖［13］、促凋亡［11，14-15］抗炎［16-17］、抗氧化［18］、抗血管生成［19］、調(diào)節(jié)免疫功能［16，20-23］等多種抗癌作用機(jī)制；其提取物可通過激活p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制癌細(xì)胞的生長［13］，還可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞功能，從而抑制小鼠腎癌細(xì)胞生長。鑒于白花蛇舌草在抗腫瘤治療中的廣泛應(yīng)用及其良好的臨床療效，本研究中采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法整體、系統(tǒng)地闡述藥物、靶點(diǎn)和疾病間的關(guān)系［24-25］，直觀地呈現(xiàn)藥物靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)［26］，探討了白花蛇舌草治療口腔癌的作用機(jī)制及其藥用價(jià)值，為白花蛇舌草治療口腔癌藥效機(jī)制的定位和產(chǎn)生協(xié)同作用的潛在蛋白靶點(diǎn)的確定提供新的研究方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集構(gòu)建

數(shù)據(jù)集收集：檢索 HIT（http：／／lifecenter.biosino.org／hit／）［27］、中藥綜合資源數(shù)據(jù)庫（TCMID，http：／／www.megabionet.org／tcmid ／）［28］數(shù)據(jù)庫，PubMed 數(shù)據(jù)庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov ／）［29］和中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平合（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http：／／lsp.nwu.edu.cn ／）［30］，從生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中收集白花蛇舌草的化合物成分，構(gòu)建白花蛇舌草化合物數(shù)據(jù)集。

化合物篩選：根據(jù)毒藥物動(dòng)力學(xué)（ADME）藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)，口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性指數(shù)（DL）≥0.18，血腦屏障（BBB）＞ -0.3，可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)目（RBN）≤10，分子極性表面積（PSA）≤60，對(duì)化合物進(jìn)行初篩，剔除重復(fù)出現(xiàn)的化合物成分。進(jìn)一步運(yùn)用PubChem數(shù)據(jù)庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）查詢獲得化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式［31］，基于化學(xué)結(jié)構(gòu)式，運(yùn)用TargetNet數(shù)據(jù)庫（http：／／targetnet.scbdd.com）［32］，根據(jù)里賓斯基五規(guī)則對(duì)化合物的成藥性進(jìn)行評(píng)分。

1.2 靶點(diǎn)預(yù)測

通過搜索TCMSP數(shù)據(jù)庫中白花蛇舌草化合物的名稱，獲得其對(duì)應(yīng)的靶蛋白信息；在基于當(dāng)前化學(xué)基因組學(xué)數(shù)據(jù)構(gòu)建大量的QSAR模型來預(yù)測化合物靶點(diǎn)的TargetNet數(shù)據(jù)庫中檢索，并篩選 Prob≥0.9 的靶點(diǎn)［32］。運(yùn) 用 Pharmmapper 數(shù) 據(jù) 庫 （http：／／lilab-ecust.edu.cn ／Pharmmapper／）［33］，通過反向藥效團(tuán)映射方法識(shí)別小分子的潛在靶點(diǎn)。

1.3 靶點(diǎn)收集及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)建立

采用 DiseaseGene Network 數(shù)據(jù)庫（http：／／www.disgenet.org ／）［34］和 DrugBank 數(shù) 據(jù) 庫 （https：／／www.drugbank.ca ／）［35］，搜索與“Oral Cavity Carcinoma”相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，采用GeneMANIA數(shù)據(jù)庫（http：／／genemania.org ／）［36］建立與已獲取疾病靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的靶點(diǎn)。基于收集的口腔癌相關(guān)靶點(diǎn)，采用STRING數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org ／）［37］建立 PPI網(wǎng)絡(luò)，作為基因映射的背景網(wǎng)絡(luò)。

1.4 預(yù)測靶點(diǎn)的基因映射提取及PPI網(wǎng)絡(luò)建立

采用Cytoscape軟件將白花蛇舌草化合物的靶點(diǎn)映射在口腔癌疾病靶點(diǎn)的PPI背景網(wǎng)絡(luò)上，提取白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點(diǎn)，并將其在STRING數(shù)據(jù)庫建立PPI網(wǎng)絡(luò)［37］，進(jìn)一步研究具有高置信度（＞ 0.7）的 PPI。

1.5 拓?fù)浞治雠c富集分析

拓?fù)浞治觯翰捎肅ytoscape軟件，對(duì)獲取的上述相關(guān)靶點(diǎn)，計(jì)算“Degree”“ClosenessCentrality”“Betweenness Centrality”3個(gè)拓?fù)湫再|(zhì)，選取3個(gè)指標(biāo)均大于中位數(shù)的靶點(diǎn)［38］，篩選出具有拓?fù)渲匾缘腍ub節(jié)點(diǎn)，將其定義為白花蛇舌草治療口腔癌的核心靶點(diǎn)。

富集分析：采用 DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：／／david.ncifcrf.gov ／）［39］對(duì)生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC），分子功能（MF）及作用通路進(jìn)行富集分析。P＜0.05為白花蛇舌草治療口腔癌的相關(guān)作用通路；P＜0.01和FDR＜1為白花蛇舌草治療口腔癌的核心作用通路。

基于收集獲得的白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點(diǎn)，采用 KEGG 數(shù)據(jù)庫（http：／／www.kegg.jp ／）［40］搜索并建立核心通路的路線圖，標(biāo)注通路內(nèi)的預(yù)測作用靶點(diǎn)。

1.6 “靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)建立

基于收集獲得的預(yù)測靶點(diǎn)及富集分析核心作用通路，采用Cytoscape軟件建立白花蛇舌草治療口腔癌的“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)集構(gòu)建及靶點(diǎn)預(yù)測

通過 HIT，TCMID，PubMed，TCMSP 數(shù)據(jù)庫，共獲得93種白花蛇舌草化學(xué)成分，根據(jù)ADME藥物篩選標(biāo)準(zhǔn)及里賓斯基五規(guī)則，共篩選出32種具有良好成藥性的化學(xué)成分?；诖?，采用3種方法預(yù)測白花蛇舌草的靶點(diǎn)信息，獲得1 468個(gè)靶點(diǎn)信息，刪除不同化合物間的重復(fù)靶點(diǎn)，共獲得353個(gè)白花蛇舌草的預(yù)測靶點(diǎn)。

2.2 口腔癌疾病相關(guān)靶點(diǎn)及PPI網(wǎng)絡(luò)的建立

檢索DiseaseGene Network和DrugBank數(shù)據(jù)庫，共收集獲得281個(gè)口腔癌的預(yù)測靶點(diǎn)，采用STRING數(shù)據(jù)庫建立口腔癌的PPI網(wǎng)絡(luò)，獲得1個(gè)具有281個(gè)節(jié)點(diǎn)、4 096條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)。詳見圖1。

2.3 基因映射結(jié)果與拓?fù)浞治鼋Y(jié)果

基因映射：采用Cytoscape軟件，將353個(gè)白花蛇舌草預(yù)測靶點(diǎn)映射在以口腔癌PPI網(wǎng)絡(luò)為背景的網(wǎng)絡(luò)上，共獲得200個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)，占口腔癌疾病靶點(diǎn)的71.17% 。詳見圖 2。

拓?fù)浞治觯喊谆ㄉ呱嗖葜委熆谇话┑?00個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)中，“Degree”中位數(shù)為 23，“Closeness Centrality”中位數(shù)為 0.476 534 985，“Betweenness Centrality”中位數(shù)為0.002 067 075，其中，“Degree”“Closeness Centrality”“Betweenness Centrality均大于中位數(shù)，且具有重要拓?fù)湟饬x的節(jié)點(diǎn)共75個(gè)，即為Hub節(jié)點(diǎn)，為白花蛇舌草治療口腔癌的核心靶點(diǎn)。

圖1 口腔癌281個(gè)靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 基因映射提取白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點(diǎn)

2.4 預(yù)測靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)建立、富集分析結(jié)果及“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)建立

基于已獲得的200個(gè)白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點(diǎn)信息，建立PPI網(wǎng)絡(luò)，得1個(gè)具有200個(gè)節(jié)點(diǎn)、2 604條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，選擇高置信度PPI，得1個(gè)具有200個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 204條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)，詳見圖3。對(duì)預(yù)測靶點(diǎn)信息進(jìn)行富集分析，P＜0.05時(shí)包括336個(gè) BP、38個(gè) CC、105個(gè) MF、25條相關(guān)作用通路，P＜0.01及FDR ＜0.01時(shí)包括 51個(gè) BP、7個(gè) CC、31個(gè) MF、4條核心作用通路?；诖?，構(gòu)建白花蛇舌草治療口腔癌的“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖4?；谠贙EGG建立的4個(gè)核心作用通路的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖，建立白花蛇舌草治療口腔癌的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖5。

圖3 白花蛇舌草治療口腔癌的預(yù)測靶點(diǎn)高置信度PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 白花蛇舌草治療口腔癌“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖

3 討論

本研究中，根據(jù)里賓斯基五規(guī)則和ADME參數(shù)［30，32］篩選出白花蛇舌草中32種具有良好成藥性的不同化合物成分，根據(jù)這些化合物成分，采用TCMSP，TargetNet，Pharmmapper數(shù)據(jù)庫檢索，收集到353個(gè)白花蛇舌草靶點(diǎn)，結(jié)合在DiseaseGene Network及DrugBank數(shù)據(jù)庫收集的281個(gè)口腔癌相關(guān)靶點(diǎn)，通過基因映射獲得了白花蛇舌草治療口腔癌的200個(gè)預(yù)測靶點(diǎn)，由此建立了一個(gè)具有200個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 204條邊的高置信度PPI網(wǎng)絡(luò)，通過拓?fù)浞治?，獲得了白花蛇舌草治療口腔癌的75個(gè)核心靶點(diǎn)。

富集分析結(jié)果顯示，白花蛇舌草治療口腔癌主要作用于胞漿、核質(zhì)、細(xì)胞器膜、質(zhì)膜、細(xì)胞核等7個(gè)細(xì)胞成分，涉及了包括凋亡、增殖、炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激等51個(gè)生物過程及31個(gè)分子功能，這與已有的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果一致［13-16］，其還參與如類固醇、單萜類、雜環(huán)類等多種物質(zhì)的生物代謝過程，這些代謝過程也一定程度上促進(jìn)了白花蛇舌草的抗癌作用，LIEW等［41］研究發(fā)現(xiàn)，單萜吲哚生物堿具有顯著的細(xì)胞生長抑制作用，且對(duì)癌細(xì)胞具有靶向選擇性。通路富集分析結(jié)果表明，HIF-1 signaling pathway，Prolactin signaling pathway，Estrogen signaling pathway，TNF signaling pathway為核心作用通路。HIF-1 signaling pathway可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥、氧化應(yīng)激及細(xì)胞周期等發(fā)揮抗癌作用。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1通路的激活可誘導(dǎo)癌細(xì)胞線粒體解偶聯(lián)從而發(fā)揮抗癌作用，核心靶點(diǎn)HIF-1被認(rèn)為具有廣泛前景的抗腫瘤藥物靶點(diǎn)［42］。ALBADARI等［43］研究認(rèn)為，HIF-1／2抑制劑及HIFs調(diào)節(jié)的廣泛復(fù)雜性有利于開發(fā)更精確的抗癌治療方法。Prolactin signaling pathway及Estrogen signaling pathway被認(rèn)為是參與乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤的經(jīng)典作用通路［44-45］。YAMAGUCHI等［46］研究發(fā)現(xiàn)，阻斷 Estrogen signaling pathway 可顯著降低芳香化酶基因表達(dá)，從而抑制癌細(xì)胞的生長，這2條通路與 p53 signaling pathway，PI3K signaling pathway，MAPK signaling pathway等多條通路間存在復(fù)雜的交互作用，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［47-49］。TNF signaling pathway在腫瘤相關(guān)研究中一直是被關(guān)注的焦點(diǎn)，ROBAYE等［50］及TARTAGLIA等［51］研究發(fā)現(xiàn)，TNFR1可觸發(fā)腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制。MONTFORT等［52］研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中輸送高濃度的腫瘤壞死因子能顯著提高免疫治療效果，TNF signaling pathway不僅是與炎癥、凋亡密切相關(guān)的信號(hào)通路，與PI3K-Akt signaling pathway間的交叉作用還參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)［53］。WANG 等［54］研究發(fā)現(xiàn)，通過 TNF-α ／NF-κB 與 PI3K／AKT signaling pathway逆轉(zhuǎn)EMT可抑制癌細(xì)胞的侵襲與遷移。

圖5 白花蛇舌草治療口腔癌的可視化通路網(wǎng)絡(luò)圖

綜上所述，本研究中通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法建立了白花蛇舌草治療口腔癌的可視化“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)圖及作用機(jī)制圖，并明確了白花蛇舌草治療口腔癌的多通路、多靶點(diǎn)的作用機(jī)制，白花蛇舌草治療口腔癌藥效機(jī)制的定位和協(xié)同作用的潛在蛋白靶點(diǎn)與通路。