黃花敗醬有效成分提取及其體外抗氧化研究

劉 偉，武 賀，張巧群，秦鋅悅，關曉暄

黃花敗醬（Patrinia scabiosaefolia Fisch），是敗醬草中的一種，屬于敗醬科敗醬屬植物，主要產(chǎn)于吉林、黑龍江、遼寧、內(nèi)蒙古等地.其性屬于微寒，味道苦、辛，歸肺、大腸、肝經(jīng)，具有清熱解毒、破瘀排膿的作用［1］.隨著對黃花敗醬的深入研究，目前已經(jīng)確定，敗醬草中主要含有皂苷類、黃酮類、甾醇、環(huán)烯醚萜和揮發(fā)油類等多種主要的藥用成分［2］.黃花敗醬中通常以皂苷類物質成分為主，在原料中其含量達到7.02%［3］，其黃酮含量只達到2.35%［4］.黃酮類化合物是一類存在于植物中具有還原性的化合物，在植物體外和體內(nèi)都有較強的抗氧化性和藥理作用，對人毒副作用較小，實驗證明，黃酮類化合物還具有降血糖、降血脂、抗心律失常、加強機體免疫力等保健功能.本實驗以正交實驗設計，測定黃酮含量和總皂苷含量（以齊墩果酸計），以獲得提取黃花敗醬有效成分的最佳方式，提高有效成分得率，并進一步測定抗氧化作用，為開發(fā)黃花敗醬資源奠定理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

黃花敗醬采自吉林省通化市白雞峰國家森林公園，由通化師范學院張立秋老師鑒定確認.蘆丁標準品（北京索萊寶），DPPH（合肥博美生物），其余試劑均為分析純試劑.

1.2 方法

（1）黃花敗醬有效成分的提取.將新鮮黃花敗醬全草在室內(nèi)陰干，研磨成粉末，以試劑類型、試劑用量、抽提時間（2 h 一次）為因素進行正交試驗［4］，抽提溫度為100 ℃，具體情況如表1 和表2 所示.用濾紙包裹黃花敗醬粉末，裝入提取管，向提取瓶加入相應試劑，組裝好索氏抽提器，100 ℃抽提，第一次虹吸出現(xiàn)時計時，所得提取液使用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，經(jīng)細菌濾器（0.2 μm）過濾并以無菌水定容至1 g/mL.

表1 因素水平表

（2）黃花敗醬黃酮含量的測定.用70%乙醇配制濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁標準品溶液，精確吸取0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.8 mL 蘆丁標準品溶液，加入5%亞硝酸鈉溶液0.08 mL，搖勻放置6 min 后，加入10% 硝酸鋁溶液0.08 mL 后，搖勻放置6 min，再加4%氫氧化鈉溶液1.00 mL，加水稀釋至2.5 mL，搖勻放置15 min 后，以不加蘆丁的空白為對照比，測定510 nm 處吸光度，繪制成標準曲線［6］.精確吸取10 倍樣品稀釋溶液0.5 mL，測定其吸光度，依據(jù)標準曲線測得樣品中黃酮的含量，依據(jù)文獻［5］計算黃酮含量.

（3）黃花敗醬中齊墩果酸含量的測定.用分析天平精確稱取齊墩果酸標準品0.2 g，加入甲醇溶解稀釋并定容至10 mL，精確吸取上述溶液1 mL，加入甲醇定容至100 mL，制成齊墩果酸標準品溶液（0.2 mg/mL）.分別吸取10倍稀釋液和標準品溶液各0.5 mL，加熱使溶劑全部蒸發(fā)，加入5% 香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，70 ℃水浴15 min.冰水冷卻2～3 min，加入冰醋酸5 mL.酶標儀190～900 nm 上掃描，可得紫外吸收光譜.易知供試品最大吸收波長548 nm，與齊墩果酸標準品一致.參照文獻［6］方法繪制標準曲線.

（4）黃花敗醬乙醇提取物的體外抗氧化研究.分別配制2.5～40 mg/mL 不同濃度黃花敗醬乙醇提取物，超氧陰離子自由基清除率采用鄰苯三酚自氧化法進行測定，DPPH·清除實驗參照文獻［7］方法.

2 結果與分析

2.1 黃花敗醬乙醇提取物中黃酮含量的測定

利用蘆丁標準品繪制曲線為Y=0.0475X+0.0294，R=0.9944.

表2 黃花敗醬中黃酮提取試驗設計及結果

由表2 可知，不同因素水平對黃花敗醬黃酮提取的影響由大到小分別為C>A>B.根據(jù)正交試驗初步確定黃花敗醬中黃酮的最佳提取工藝條件為A3B1C2，即乙醇濃度95%、料液比1∶7.5、時間4 h.

2.2 黃花敗醬乙醇提取物中齊墩果酸含量的測定

利用齊墩果酸標準品繪制曲線為Y=0.1031X+0.0985，R=0.994.黃花敗醬中齊墩果酸提取試驗設計結果如表3 所示.

表3 黃花敗醬中齊墩果酸提取試驗設計及結果

由表3 可知，不同因素對黃花敗醬中齊墩果酸提取的影響由大到小分別為A>C>B.根據(jù)正交試驗初步確定敗醬草中黃酮類物質最佳提取工藝條件為A1B3C3，即乙醇濃度100%、料液比1∶10、時間6 h.

2.3 黃花敗醬乙醇提取物對DPPH·、超氧陰離子自由基清除率的影響

以正交實驗設計的9 組實驗提取物中黃酮及齊墩果酸含量最高的3、7、8 號樣品為材料，制備2.5 mg/mL、5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、40 mg/mL 濃度的稀釋液，分別測定其對DPPH·、超氧陰離子自由基和羥自由基清除率的影響.結果表明，黃花敗醬乙醇提取物對DPPH·清除率較高，當樣品濃度為40 mg/mL 時，DPPH·清除率可達80%，且存在劑量依賴性（見圖1）；當樣品濃度為10 mg/mL 時對超氧陰離子自由基清除率可達到90%（見圖2）.

圖1 黃花敗醬乙醇提取物對DPPH·清除率

圖2 黃花敗醬乙醇提取物對超氧陰離子清除率

3 討論

本文確定當條件為乙醇濃度95%、料液比1∶7.5、時間4 h 黃酮提取效率最高，含量為23.444 mg/mL，條件為乙醇濃度100%、料液比1∶10、時間6 h 齊墩果酸提取效率最高，含量為8.501 mg/mL，這與文獻［8］報道的結果基本一致.體外抗氧化實驗表明，黃花敗醬乙醇提取物抗氧化活性較好，DPPH·自由基清除率可達79.08%，超氧陰離子自由基清除率可達90%，這要高出文獻［9］報道的抗氧化活性，但其中的抗氧化活性物質及作用機制還有待進一步研究.