乳鴿源綠膿桿菌的分離與鑒定

李冰心 程柏叢 王 俊 楊秀環(huán) 孫夢(mèng)許

（1.北京市大興區(qū)動(dòng)物疾病控制中心 北京 102600；2.北京市畜牧獸醫(yī)總站 北京 100107；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 北京 100193）

綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）又稱為銅綠假單胞菌，Gersard 于1882 年首次從傷口膿液中分離得到， 該菌廣泛存在于自然界的水和土壤中以及動(dòng)物腸道和皮膚表面， 是典型的人獸共患條件致病菌，通常引起人皮膚化膿性感染，常見(jiàn)于燒燙傷患者。隨著集約化養(yǎng)殖的快速發(fā)展，綠膿桿菌感染畜禽的報(bào)道日漸增多， 已有報(bào)道綠膿桿菌感染引起水貂出血性腸炎、 母狐流產(chǎn)和羊化膿性肺炎等嚴(yán)重疾病，若治療不當(dāng)病死率較高，造成嚴(yán)重?fù)p失[1-3]。 此外，近年來(lái)在我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)中，雛雞、雛鴨因早期疫苗接種而感染綠膿桿菌屢有發(fā)生[4-5]，但出生2～3 d 的乳鴿暴發(fā)綠膿桿菌感染， 造成大量乳鴿死亡的病例較少見(jiàn)。

2019 年6 月， 石家莊市某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)出殼的2 450 羽乳鴿出現(xiàn)發(fā)病，發(fā)病乳鴿生長(zhǎng)緩慢、精神不振，眼瞼腫脹，胸部、腹部皮膚可見(jiàn)腫塊，每天死亡最多時(shí)可達(dá)200 羽， 在出殼10 d 內(nèi)累計(jì)死亡超過(guò)30%。經(jīng)實(shí)驗(yàn)室病理剖檢和病原分離鑒定，確診為綠膿桿菌感染， 并對(duì)分離菌株進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)和毒力基因檢測(cè)等研究， 為預(yù)防和控制該病的流行提供參考依據(jù)。 現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 病料樣品來(lái)源 河北省石家莊市某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)送檢的死亡乳鴿。

1.2 主要試劑 Tryptic Soy Agar 培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和Tryptic Soy Broth 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)BD公司； 犢牛血清購(gòu)自北京政博偉業(yè)生物科技公司；2×Taq PCR-Mix（含染料）購(gòu)自北京康潤(rùn)生物科技公司；藥敏紙片購(gòu)自北京天壇生物制品股份有限公司。

1.3 細(xì)菌分離培養(yǎng)與純化 死亡乳鴿眼眶邊緣、胸部和腹部有乳白色腫塊， 切開(kāi)可見(jiàn)干酪樣物和血性滲出液，剖檢乳鴿發(fā)現(xiàn)肝臟腫大。無(wú)菌采集乳鴿體表局部病灶滲出液和肝臟組織， 分別劃線接種于含2%血清的TSA 平板和麥康凱平板， 置37 ℃溫箱培養(yǎng)16～24 h，觀察菌落形態(tài)特征。 挑取典型單一優(yōu)勢(shì)菌株的單菌落， 再次劃線接種于含2%血清的TSA平板進(jìn)一步純化培養(yǎng)，純化的細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色，鏡下觀察菌體形態(tài)特征。

1.4 病毒分離 無(wú)菌采集死亡乳鴿的肝臟和脾臟，用玻璃研磨器充分研磨成組織懸液，反復(fù)凍融3 次。8 000 r/min 離心5 min， 取上清液用0.22 μm 濾膜除菌。 過(guò)濾液經(jīng)尿囊腔接種3 枚9 日齡SPF 雞胚（0.2 mL/枚），每隔12 h 照胚一次，連續(xù)觀察5 d。 收取尿囊液繼續(xù)盲傳3 代。

1.5 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定 利用煮沸裂解法提取分離菌株的基因組DNA，作為PCR 的模板，以細(xì)菌16S rRNA 基因通用引物對(duì)細(xì)菌的16S rRNA 基因片段進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。引物序列：上游引物5'-CTAHAGGGTATCTAATCCT-3'，下游引物5'-GAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'， 目的條帶759 bp。PCR 反應(yīng)體系50 μL：2× Taq PCR-Mix 25 μL，上下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL，ddH2O 21 μL。 PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。 PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，符合目的大小的陽(yáng)性PCR 產(chǎn)物送到北京擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。 將分離菌株的16S rRNA 基因序列測(cè)序結(jié)果在NCBI 網(wǎng)站在線BLAST 比對(duì)

1.6 藥敏試驗(yàn) 采用K-B 紙片擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。 將純培養(yǎng)物接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37 ℃振蕩培養(yǎng)16~18 h 后將培養(yǎng)物稀釋成0.5 麥?zhǔn)蠁挝坏木骸?無(wú)菌條件下將菌液均勻涂布在TSA 培養(yǎng)基上，選取12 種抗生素，用無(wú)菌鑷子夾取藥敏紙片貼于培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)16~24 h 后， 測(cè)量抑菌圈直徑并根據(jù)CLSI 標(biāo)準(zhǔn)判斷敏感性。

2 結(jié) 果

2.1 臨床發(fā)病和死亡統(tǒng)計(jì) 2019 年6 月下旬，河北石家莊市某肉鴿養(yǎng)殖場(chǎng)出雛2 450 羽， 乳鴿從出殼第3 d 開(kāi)始出現(xiàn)死亡（60 羽）；隨后每天死亡數(shù)逐漸升高，在5 日齡時(shí)死亡乳鴿高達(dá)200 羽，后續(xù)每天死亡數(shù)量逐漸下降；到10 日齡時(shí)，該批乳鴿累計(jì)死亡率超過(guò)30%（750/2 450）。 發(fā)病乳鴿體溫升高，精神沉郁，死亡乳鴿外觀消瘦、脫水，眼眶邊緣、胸部和腹部有乳白色腫塊，切開(kāi)可見(jiàn)干酪樣物和血性滲出液，剖檢乳鴿發(fā)現(xiàn)肝臟出血腫大（見(jiàn)圖1）。

2.2 病原分離培養(yǎng)特征和形態(tài)觀察 從送檢的死亡乳鴿體表病灶和肝臟中分離到一株優(yōu)勢(shì)菌。 分離菌株在含血清的TSA 平板上生長(zhǎng)迅速， 形成光滑、濕潤(rùn)、中央隆起、邊緣不整齊的中等大小菌落。 菌落產(chǎn)生藍(lán)綠色色素，周?chē)囵B(yǎng)基呈淡綠色，有特殊芳香氣味。 該菌在麥康凱培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，呈無(wú)色、半透明的圓形菌落。 經(jīng)革蘭氏染色，鏡下可見(jiàn)兩端鈍圓、單個(gè)或成對(duì)的革蘭氏陰性短小桿菌。 將乳鴿肝臟和脾臟組織過(guò)濾液接種SPF 雞胚5 d 后，無(wú)雞胚死亡，盲傳三代后未見(jiàn)雞胚死亡。 無(wú)菌收集尿囊液檢測(cè)無(wú)血凝活性，表明未分離到病毒。

2.3 細(xì)菌16S rRNA 基因片段序列分析 通過(guò)PCR 擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因的保守序列， 擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)期大小基本相符（見(jiàn)圖2）。 對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，BLAST 比對(duì)結(jié)果顯示分離菌株與GenBank 中登錄的綠膿桿菌參考序列的同源性高達(dá)99.33%，表明分離菌株為綠膿桿菌。

圖1 死亡乳鴿病變圖

圖2 分離菌株16 S rRNA PCR 產(chǎn)物電泳圖

2.4 藥物敏感試驗(yàn)結(jié)果 選擇12 種抗生素進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離菌株對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、阿米卡星、諾氟沙星、氧氟沙星和慶大霉素敏感，對(duì)四環(huán)素、紅霉素、青霉素、阿奇霉素、氨芐西林和頭孢呋辛鈉等抗生素耐藥。

3 討 論

1）近年來(lái)，隨著肉鴿規(guī)模化養(yǎng)殖的發(fā)展，綠膿桿菌感染的病例屢有報(bào)道， 但多數(shù)感染發(fā)生在成年鴿或幼鴿，并常伴有共感染，而未見(jiàn)2~3 日齡乳鴿大批量感染死亡的報(bào)道。 根據(jù)臨床癥狀、 乳鴿剖檢病變、細(xì)菌分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)鑒定，確定了引起石家莊市某鴿場(chǎng)乳鴿死亡的原因是綠膿桿菌感染。

2）綠膿桿菌廣泛存在于土壤、空氣和水中以及動(dòng)物的腸道和皮膚，是一種條件性致病菌。該病的發(fā)生雖無(wú)明顯季節(jié)性，但與動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)狀況、飼養(yǎng)環(huán)境和應(yīng)激因素密切相關(guān)， 并且該菌在溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境中更容易繁殖。 趙振振等[6]報(bào)道了鎮(zhèn)江某鴿場(chǎng)因鴿群應(yīng)激、環(huán)境潮濕而引發(fā)的綠膿桿菌感染。 蘇飛[7]對(duì)江蘇某市18 日齡雛鴿暴發(fā)綠膿桿菌感染進(jìn)行了報(bào)道和有效治療。此次乳鴿感染發(fā)生在夏季多雨季節(jié)，潮濕的環(huán)境可能是誘發(fā)乳鴿感染綠膿桿菌的一個(gè)重要因素。 此外，育雛室衛(wèi)生條件差，沒(méi)有做好定期通風(fēng)和消毒為細(xì)菌滋生創(chuàng)造了良好條件， 加之乳鴿自身免疫力較弱，體表皮膚無(wú)羽毛的保護(hù)，極易通過(guò)外傷感染綠膿桿菌等條件致病菌。 因此，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，做好環(huán)境清潔、衛(wèi)生和消毒工作，以及避免鴿籠有尖銳物刺傷皮膚等是預(yù)防乳鴿綠膿桿菌感染的有效措施。

3）綠膿桿菌對(duì)外界環(huán)境的抵抗力非常強(qiáng)，對(duì)抗生素也容易產(chǎn)生耐藥性。 不同地區(qū)分離的綠膿桿菌因血清型不同和當(dāng)?shù)赜盟幥闆r不同導(dǎo)致對(duì)抗生素的耐藥性產(chǎn)生差異。有報(bào)道稱，雞源綠膿桿菌存在對(duì)慶大霉素、新霉素和磺胺類藥物產(chǎn)生耐藥性的現(xiàn)象。此次分離菌株與已報(bào)道的鴿源綠膿桿菌類似， 對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢吡肟、阿米卡星、諾氟沙星、氧氟沙星和慶大霉素等抗菌藥物敏感。為了避免耐藥菌株的出現(xiàn)，在綠膿桿菌的防控中應(yīng)選擇幾種高敏藥物交替混合使用，這樣才能有良好的治療效果。

表1 綠膿桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果