天然食用香料草莓酸對黃曲霉的抑菌作用研究

馬衛(wèi)賓?，張 迪，謝巖黎，趙文紅，孫淑敏

（河南工業(yè)大學糧油食品學院，河南省糧油食品安全檢測與控制重點實驗室，河南 鄭州 450001）

黃曲霉能夠侵染谷物、干果、飼料等食品，并產生致癌性代謝產物黃曲霉毒素[1]，不僅造成食品質量劣變和經濟價值損失，還嚴重影響人類及動物的健康[2]。據聯合國糧食及農業(yè)組織統(tǒng)計，全世界大約有四分之一的谷物受到真菌及其毒素污染，導致巨大的經濟損失，例如美國每年因為真菌毒素污染造成的損失約10億美元[3]。我國是糧食生產大國，在糧食采收、儲藏和運輸等環(huán)節(jié)發(fā)生的黃曲霉毒素污染造成了很大的損失和危害[4-5]。因此，急需尋找安全有效的方法控制糧油食品中黃曲霉及其毒素的污染。盡管人工合成抑菌劑已經被廣泛用于控制食品中的微生物污染，但有研究表明不合理地使用人工合成殺菌劑可能會對人類健康及環(huán)境產生潛在不良影響，包括降解周期長、毒性殘留和耐藥性[6-7]。目前，研發(fā)安全有效的天然抑菌劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的人工合成抑菌劑已成為食品領域的一個研究熱點，其中植物源抑菌化合物由于具有安全性高等優(yōu)點，已越來越受到重視[8-9]。

植物源有機酸作為防腐劑在食品中的應用已有上百年的歷史，例如苯甲酸、肉桂酸及其衍生物[10]。王勇[11]等報道了 14種小分子有機酸對 6種植物病原真菌的抑菌活性，發(fā)現枯茗酸的抑菌活性最好，苯甲酸和肉桂酸次之。目前在食品領域常用的防腐劑多為有機酸及其鹽類，其中山梨酸及其鉀鹽由于抑菌性能好，并且安全性高，是FAO和WHO推薦的食品防腐劑[12]。草莓酸（反式-2-甲基-2-戊烯酸）天然存在于草莓的香味成分中，是美國食用香料與天然提取物制造者協(xié)會（FEMA）認可的安全食用香料，也是我國《食品安全國家標準食品添加劑使用標準》GB 2760—2014附錄中允許使用的食用香料。草莓酸具有新鮮草莓香氣，且?guī)в刑饾櫟臐{果樣香氣和酸味，是配制草莓香精的主香原料。作為一種天然有機酸類食用香料，關于草莓酸抑菌活性的研究未見報道。本實驗室在前期工作中對天然有機酸的抑菌活性進行了篩選，發(fā)現草莓酸活性較好，具有進一步研究的價值。在此基礎上，本文以食品工業(yè)常用防腐劑山梨酸為陽性對照，評價了草莓酸對人工培養(yǎng)基和儲藏花生中黃曲霉生長和侵染的控制作用，為將其開發(fā)成為天然、綠色、安全的食品防腐劑或糧食防霉劑提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

草莓酸（純度≥98%）：西亞化學科技有限公司；山梨酸（純度≥99%）：上海麥克林生化科技有限公司（兩種化合物的化學結構式見圖 1所示）；黃曲霉菌：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心提供。

圖1 供試化合物結構式

察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g、硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、氯化鉀0.5 g、硫酸鎂0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1 000 mL。

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療機械廠；SW-CJ-2D型雙人單面凈化工作臺：蘇州凈化設備有限公司；GZX-DH-400BS型電熱恒溫干燥箱：上海躍進醫(yī)療器械有限公司；MJ-250-I 霉菌培養(yǎng)箱：河南兄弟儀器設備有限公司；AL104電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黃曲霉孢子懸浮液制備

將于-20 ℃保存的黃曲霉菌取出，靜置至室溫，于恒溫培養(yǎng)箱（28±2）℃活化24 h后接種于察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)6 d；無菌接種環(huán)刮取平板表面，并用 0.1%吐溫80的水溶液洗脫，三層無菌擦鏡紙過濾除去菌絲，制得孢子懸浮液；用血球計數板測定稀釋至孢子懸浮液濃度為106～107個/mL[13]。

1.2.2 草莓酸對黃曲霉的離體抑菌活性測定

參照文獻[14-15]中的方法并稍加改進，具體為：根據設定的抑菌實驗所用梯度濃度，分別稱取相應質量的草莓酸并將其溶于1 mL無水乙醇中，然后緩慢加入到4 mL 20%的吐溫80水溶液中，充分渦旋至完全混勻，制得草莓酸測試母液；同樣方法設置山梨酸陽性對照組（準備實驗表明所用溶劑體系對供試菌種生長無影響，故正式實驗不再設溶劑對照組）。用移液槍吸取1 mL測試母液滴加到無菌培養(yǎng)皿中與19 mL滅菌察氏培養(yǎng)基混勻，同時設空白對照組（20 mL滅菌察氏培養(yǎng)基），冷凝后備用。用移液槍吸取5 μL新鮮孢子懸浮液，接種至制備的培養(yǎng)基表面中間，（28±2）℃條件下培養(yǎng)8 d。每處理設置3個重復，十字交叉法測量菌落直徑。按照以下公式計算抑菌率：

抑菌率(% ) = （dc-dt） /dc×100%

式中：dc為對照組中菌絲平均直徑（cm）；dt為實驗組中菌絲平均直徑（cm）。

1.2.3 草莓酸對儲藏花生中黃曲霉的抑菌活性

參照文獻中的方法[7,16]并稍加改進，具體為：挑選顆粒飽滿無霉菌污染的花生粒，用1%次氯酸鈉溶液浸泡2 min消毒種子表面，無菌水沖洗干凈后浸泡4 h調節(jié)水分含量，無菌環(huán)境下晾干花生粒表面水分備用。取1mL測試化合物母液（配制方法同1.2.2）加入到19 mL孢子懸浮液中充分混勻，立刻將經過消毒和水分調質的花生粒浸入到含藥孢子懸浮液中并稍加攪拌，1 min后取出花生粒在無菌環(huán)境下置于滅菌濾紙上，每個濃度取14～16?；ㄉ椒庞谂囵B(yǎng)皿中，用 Parafilm迅速密封，（28±2）℃條件下培養(yǎng)5 d。設置空白對照，每處理設置3個重復。以花生粒表面是否長出肉眼可見菌絲為標準，每隔24 h觀察并統(tǒng)計受黃曲霉污染的霉變花生粒數量。按照以下公式計算霉變率：

花生霉變率(%)= C /T× 100%

式中：C為霉變花生粒數量（粒），T為花生?？倲盗浚＃?。

1.3 數據分析

采用Excel和Origin 8.5軟件對數據進行分析和作圖。

2 結果與討論

2.1 草莓酸與山梨酸對黃曲霉菌的離體抑菌活性

最小抑菌濃度（Minimum Inhibition Concentration，MIC）是測定化合物抑菌活性的重要參數[17]。對比研究不同作用濃度及作用時間條件下，草莓酸與山梨酸對黃曲霉的離體抑菌活性，進而確定二者的MIC。圖2-A表明，供試濃度梯度下，草莓酸與山梨酸均對黃曲霉生長顯示出抑制效果，并且二者對黃曲霉生長的抑制作用呈濃度依賴性。通過對比圖2-A數據可知，隨著供試濃度的增大，草莓酸濃度達到0.6 g/L時，對黃曲霉生長抑制率為100%，而山梨酸在濃度達到1.0 g/L時，能夠完全抑制黃曲霉的生長。由此可知二者對黃曲霉的MIC分別為0.6和1.0 g/L。根據圖2-B的數據以及圖2-C的實物照片，可以看出隨著兩種化合物作用濃度的增加，黃曲霉的生長受到抑制的程度逐漸加深；同時，隨著培養(yǎng)時間的延長，黃曲霉菌絲生長的菌落直徑不斷變大，但與空白對照組相比，處理組黃曲霉菌落直徑變化受到不同程度抑制，菌絲生長速率明顯變慢，生長狀況出現延遲。如草莓酸0.4 g/L、山梨酸0.8 g/L濃度下，培養(yǎng)8 d時的黃曲霉菌落大小與空白對照培養(yǎng)2 d的菌落大小相當，菌絲生長延遲了大約6 d。從以上結果可以看出，離體條件下草莓酸對黃曲霉的抑菌活性要優(yōu)于食品工業(yè)常用防腐劑山梨酸。

2.2 草莓酸與山梨酸對儲藏花生中黃曲霉的抑菌活性

基于草莓酸對黃曲霉的離體抑菌活性研究結果，進一步研究了草莓酸對儲藏花生中黃曲霉生長的實際控制效果，并與山梨酸進行了對比。由圖3-A可知花生霉變率隨著草莓酸和山梨酸濃度的增加而逐漸降低。當其草莓酸濃度為 10.0 g/L時，能夠完全抑制儲藏花生中黃曲霉的侵染；草莓酸在5.0 g/L時能夠使花生的霉變率降低50%以上。陽性對照山梨酸在濃度達到20.0 g/L時，能夠完全抑制黃曲霉在花生上的生長；在 5.0～15.0 g/L濃度范圍內，山梨酸能使花生霉變率有不同程度的降低。圖3-C展示了培養(yǎng)5 d后不同濃度草莓酸和山梨酸處理對儲藏花生霉變率影響的實物照片，可以看出空白對照組中的花生已經全部被黃曲霉污染，菌絲布滿花生表面；而草莓酸和山梨酸能夠有效控制黃曲霉對花生的侵染，使花生中的黃曲霉生長變緩，降低花生的霉變率。

根據圖3-B的數據曲線變化趨勢可以發(fā)現，當兩種化合物作用濃度低于完全抑制濃度時，隨著培養(yǎng)時間的延長，花生的霉變率逐漸增加；但與空白對照組相比，處理組花生霉變率的增長趨勢明顯變慢，花生發(fā)生霉變的時間出現不同程度的延遲。通過對比圖3中的數據可知，草莓酸對花生中黃曲霉侵染的抑制效果要優(yōu)陽性對照山梨酸。本研究結果表明草莓酸對黃曲霉具有良好的抑制活性，為研發(fā)新型有機酸類食品防腐劑提供了基礎和參考，值得進一步深入研究。

圖2 山梨酸與草莓酸不同作用濃度（A）、不同作用時間（B）對黃曲霉的離體抑菌活性及實物照片（C）

圖3 山梨酸與草莓酸在不同作用濃度（A）及作用時間（B）條件下對花生儲藏過程中黃曲霉的控制作用及實物照片（C）

草莓酸和山梨酸均為短鏈脂肪酸，二者有著相似的化學結構，但本研究發(fā)現草莓酸對黃曲霉的抑制活性優(yōu)于山梨酸，這種活性上的差異可以在構效關系方面作進一步探討。有研究人員通過對比研究 30余種飽和或不飽和脂肪酸對大腸桿菌和白色念珠菌的抑菌活性，發(fā)現碳鏈長度、雙鍵數目、雙鍵位置以及取代基團的不同對其抑菌活性有非常大的影響[18]。寧正祥[19]等對含α,β-不飽和羰基化合物分子結構特性及其抗菌活性進行研究，發(fā)現這類防腐劑的抗菌活性與分子疏水性和分子最低空軌道能量有關。于輝[20]通過量子化學研究，表明 1,3-丁二烯的交替碳碳雙鍵骨架對山梨酸的羧基提供有力的支持，羧基和C1的電子云密度較大，是山梨酸的抗菌活性中心。草莓酸的化學結構比山梨酸少一個碳碳雙鍵，但在α碳位置多一個甲基，這種結構上的變化對抑菌活性的影響機理值得進一步研究，可為抑菌活性化合物的結構優(yōu)化提供借鑒和啟發(fā)。

3 結論

本研究以黃曲霉菌為供試菌種，并以山梨酸為陽性對照，采用生長速率法測定了天然食品香料草莓酸對黃曲霉菌的離體抑菌活性，并在實驗室條件下評估了該化合物對儲藏花生中黃曲霉菌的控制作用發(fā)現草莓酸的抑菌活性優(yōu)于山梨酸。離體條件下草莓酸對黃曲霉的最小抑菌濃度為0.6 g/L，山梨酸為1.0 g/L。花生儲藏防霉試驗表明，草莓酸對儲藏花生中黃曲霉侵染和生長的有效控制濃度為10.0 g/L，山梨酸在20.0 g/L時才能完全抑制黃曲霉在儲藏花生中的生長。

盡管山梨酸、苯甲酸等防腐劑已在食品工業(yè)得到了廣泛的應用，但仍有一些問題需要進一步解決。比如安全性問題，有些防腐劑對人體具有潛在毒性，如苯甲酸及其鹽類具有一定的致突變作用和遺傳毒性[21]。山梨酸比苯甲酸安全性更高，但山梨酸對霉菌、酵母生長具有較好抑制作用，對細菌作用卻不強[22]。隨著消費者對食品安全的要求越來越高，尋找和開發(fā)廣譜、安全、高效的新型食品防腐劑已成為食品行業(yè)關注的研究熱點[23]。本實驗室近年來圍繞天然食品防腐劑和糧食防霉劑進行了持續(xù)研究，并取得一些進展[24-25]。本研究選用的草莓酸存在于草莓的香味物質組分中，并且是一種天然食用香料，在安全性方面具有優(yōu)勢。后期可進一步研究草莓酸鈉鹽、鉀鹽的抑菌活性，并且擴大抑菌譜的篩選，為其實際應用提供基礎和依據。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網、萬方、維普、超星等數據庫下載獲取。