長(zhǎng)江岸線宜昌江段五種不同類型水樣對(duì)稀有鯽胚胎的毒性

王能漢 鄧巧玲 范垚城 唐海濱 雷 磊 曹 宏

(1. 中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

長(zhǎng)江作為我國(guó)第一大河, 在我國(guó)社會(huì)發(fā)展中有重要的地位。然而, 近20年來(lái)其干線及支流的污水排放總量明顯增加, 雖經(jīng)一定程度的治理及控制,但其流域內(nèi)的河流及湖泊水質(zhì)改善程度依然效果不顯著[1]。最新的中國(guó)環(huán)保公報(bào)中顯示: 長(zhǎng)江流域的淡水資源中Ⅳ類水占9.0%, Ⅴ類水占1.8%, 劣Ⅴ類水占1.8%[2], 這幾類水是無(wú)法飲用且不能與人體直接接觸的, 特別是劣Ⅴ類水質(zhì)除調(diào)節(jié)局部氣候外,幾乎無(wú)其他功能[3]。長(zhǎng)江岸線在城市化和工業(yè)化以及農(nóng)業(yè)村鎮(zhèn)的道路建設(shè)過(guò)程中, 對(duì)水環(huán)境均造成了不同程度的影響。其污染面源類型涉及生活污水、工業(yè)污水、農(nóng)業(yè)面源污水、漁業(yè)污水、長(zhǎng)江航道等。為了對(duì)這幾種水質(zhì)綜合評(píng)價(jià), 除常規(guī)理化指標(biāo)外, 對(duì)污染河流進(jìn)行生物毒性檢測(cè)和分析尤為必要。

稀有鯽(Gobiocypris rarus)是一種我國(guó)特有的小型鯉科魚類,亦是優(yōu)良的模式動(dòng)物[4]。從1990年起, 稀有鯽就被作為我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)魚類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而進(jìn)行了目的培育, 目前該物種已有較多應(yīng)用于遺傳學(xué)、基礎(chǔ)生物學(xué)、毒理學(xué)、病理學(xué)等領(lǐng)域的研究報(bào)道[5]。同時(shí), 稀有鯽已被我國(guó)環(huán)境保護(hù)部列為新化學(xué)物質(zhì)測(cè)試推薦魚種[6,7], 首個(gè)關(guān)于使用稀有鯽的測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)—化學(xué)品稀有鯽急性毒性試驗(yàn)(GB/T29763—2013)目前也已經(jīng)正式公布并實(shí)施[8]。本研究以稀有鯽胚胎為試驗(yàn)對(duì)象, 參考國(guó)際經(jīng)濟(jì)與合作組織(Organization for Economic Cooperation and Development, OECD)在2013 年頒布的《魚類胚胎急性毒性試驗(yàn)方法》(OECD TG 236,Fish Embryo Acute Toxicity Test, FET)[9], 檢測(cè)長(zhǎng)江岸線宜昌江段五種不同污染類型的典型水樣對(duì)稀有鯽胚胎的毒性效應(yīng), 探討其水質(zhì)毒性檢測(cè)的有效方法, 并為長(zhǎng)江岸線宜昌江段水體污染的綜合評(píng)價(jià)及后續(xù)治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 水樣采集及水質(zhì)分析

結(jié)合污水監(jiān)測(cè)點(diǎn)布設(shè)的原則[10], 共在宜昌江段設(shè)計(jì)5個(gè)采樣點(diǎn), 5個(gè)采樣點(diǎn)水樣包含長(zhǎng)江城鎮(zhèn)開發(fā)過(guò)程的幾種典型代表水樣: 市政管網(wǎng)生活污水、工業(yè)污水、農(nóng)業(yè)面源污水、漁業(yè)污水和長(zhǎng)江航道水樣。采樣時(shí)間是2019年3月26—27日, 根據(jù)采樣點(diǎn)編號(hào)為1#、2#、3#、4#、5#水樣。取得的水樣用棕色玻璃瓶密封后帶回, 并放入4℃冷庫(kù)保存以供取用,具體取樣地點(diǎn)如圖 1所示, 各組水樣詳細(xì)信息見表 1。

試驗(yàn)水樣的化學(xué)需氧量(Chemical oxygen demand, COD)、總氮(TN)、總磷(TP)、硝態(tài)氮(NO3-N)、氨氮(NH3-N)、亞硝態(tài)氮(NO2-N)和高錳酸鹽指數(shù)分別通過(guò)重鉻酸鹽反應(yīng)法、硫酸鹽氧化法、消解-抗壞血酸法、鎘反應(yīng)法、水楊酸法和重氮化法、酸性高錳酸鹽法完成。重金屬采樣微波消解法測(cè)定。農(nóng)藥殘留則采用UPLC超高效液相色譜法測(cè)定。

圖1 水體采樣點(diǎn)流域示意圖Fig. 1 Schematic diagram of the sampling sites

表1 水體采樣點(diǎn)的地理信息Tab. 1 The geographic information of the sampling sites

1.2 稀有鯽胚胎的急性毒性試驗(yàn)

健康的稀有鯽實(shí)驗(yàn)親魚來(lái)自于中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所稀有鯽普通級(jí)和清潔級(jí)資源保存基地培育的野生封閉群(IHB)系。每天投喂2次紅蟲, 光照12h。實(shí)驗(yàn)開始前期, 根據(jù)其產(chǎn)卵間隔節(jié)律和產(chǎn)前行為, 將親魚配對(duì), 并人工授精。人工授精90min內(nèi), 體視鏡(OLYMPUS BX53)鏡檢選擇處于16細(xì)胞期前, 無(wú)明顯不規(guī)則分裂或破損的受精卵用于急性毒性實(shí)驗(yàn)。

試驗(yàn)方法參考《魚類胚胎急性毒性試驗(yàn)方法》(OECD TG 236)。用滴管隨機(jī)挑選24 枚受精魚卵,轉(zhuǎn)移到24 孔細(xì)胞培養(yǎng)板(NEST), 每孔1個(gè)受精卵。其中第一排4個(gè)孔各加入2 mL空白對(duì)照組水樣作為對(duì)照組, 空白對(duì)照組水樣采用標(biāo)準(zhǔn)稀釋水, 配置方法如下: a. 氯化鈣溶液: 將11.76 g CaCl2·2H2O溶解于超純水中, 稀釋至1 L; b. 硫酸鎂溶液: 將4.93 g MgSO4·7H2O溶解于超純水中, 稀釋至1 L; c. 碳酸氫鈉溶液: 將2.59 g NaHCO3溶解于超純水中, 稀釋至1 L; d. 氯化鉀溶液: 將0.23 g KCl溶解于超純水中, 稀釋至1 L。將以上四種溶液各25 mL加以混合并用超純水稀釋至1 L[11]。

其余每一排4孔則分別加入不同的5組待檢水樣, 每孔2 mL, 每個(gè)24孔細(xì)胞板作為1組, 每孔各放置1枚魚卵, 共設(shè)3組平行。然后將孔板置于(25±1)℃光照培養(yǎng)箱中(珠江LRH-250-G)、光照比為12h﹕12h (白晝﹕黑夜) 的環(huán)境中暴露, 每24h 換1 次試驗(yàn)用水, 進(jìn)行為期96h的暴露試驗(yàn)。在試驗(yàn)的24h、48h、72h和96h時(shí)檢查胚胎的發(fā)育情況和存活率。采用體式顯微鏡觀察測(cè)試胚胎發(fā)育情況, 每24h記錄死亡胚胎數(shù)量、幼魚孵出數(shù)量及畸形幼魚數(shù)量, 并統(tǒng)計(jì)48h時(shí)胚胎心率。利用數(shù)碼相機(jī)連接體式顯微鏡(Carl Zeiss Stemi 508)對(duì)胚胎的損傷特征和幼魚的畸形特征進(jìn)行拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示, 使用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA), 組間比較采用Duncan’s多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)。以P<0.05為顯著性差異。

暴露實(shí)驗(yàn)中主要的統(tǒng)計(jì)指標(biāo)計(jì)算公式如下: 心率(次/分鐘)=15s心率×4; 孵化率(%)=(孵化個(gè)體/受精卵數(shù))×100; 畸形率(%)=(畸形個(gè)體數(shù)/受精卵數(shù))×100; 存活率(%)=(存活數(shù)/受精卵數(shù))×100。

2 結(jié)果

2.1 水樣的理化指標(biāo)

我們對(duì)水樣進(jìn)行了常規(guī)污染物的檢測(cè), 表 2顯示了五組水樣的常規(guī)污染物檢測(cè)結(jié)果。同時(shí), 我們將部分指標(biāo)與Ⅲ類地表水指標(biāo)進(jìn)行了比較, 發(fā)現(xiàn):1#水樣各項(xiàng)基本達(dá)到Ⅲ類地表水指標(biāo); 2#水樣總磷超標(biāo)外, 其他各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到Ⅲ類地表水指標(biāo);3#和4#水樣各項(xiàng)指標(biāo)全面超標(biāo), 水質(zhì)較差; 5#水樣在總磷和高錳酸鹽指數(shù)存在一定程度的超標(biāo)(圖 2)。同時(shí), 我們還檢測(cè)了各組水樣中的重金屬含量(表 3),發(fā)現(xiàn)3#水樣中各項(xiàng)重金屬指標(biāo)均高于其他組。

表2 各水樣的常規(guī)污染物信息Tab. 2 The concentration of several conventional pollutants in each sample (mg/L)

圖2 各水樣的常規(guī)污染物指標(biāo)與Ⅲ類地表水的對(duì)比Fig. 2 The conventional pollutants index among the level III standard surface water in each sample

2.2 生物毒性

本實(shí)驗(yàn)在暴露處理48h后, 統(tǒng)計(jì)了各組稀有鯽胚胎的心率(圖 3)。4#水樣胚胎心率最低,3#水樣其次, 二者相對(duì)于對(duì)照組均有極顯著的降低(P<0.01)。

同時(shí), 我們?cè)?2h后, 統(tǒng)計(jì)了各組水樣處理后的稀有鯽胚胎孵化率(圖 4)。2#水樣胚胎孵化率變化趨勢(shì)總體上與對(duì)照組最為接近, 受到影響最小。1#、5#水樣胚胎的整體孵化率一定程度低于對(duì)照組, 而3#、4#水樣胚胎整體上孵化率顯著低于其他組(P<0.05)。

研究發(fā)現(xiàn), 經(jīng)過(guò)猇亭工業(yè)污水長(zhǎng)江排污口的3#水樣和取自猇亭生活污水管網(wǎng)的4#水樣處理后的稀有鯽胚胎, 在其發(fā)育過(guò)程中出現(xiàn)了多種畸形癥狀, 例如脊椎彎曲、身體彎曲、卵黃囊水腫、卵黃囊吸收遲緩及魚鰾無(wú)法充氣等; 此外, 4#水樣處理后的稀有鯽胚胎相比較其他組, 還出現(xiàn)了多例心包腫大的畸形(圖 5)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), 4#水樣處理后的稀有鯽胚胎出現(xiàn)畸形率及發(fā)育遲緩的比例最高, 3#次之; 而相比較而言, 經(jīng)過(guò)1#、2#、5#水樣處理后的胚胎則幾乎無(wú)畸形癥狀出現(xiàn)(圖 6)。

在進(jìn)行完96h暴露實(shí)驗(yàn)后, 統(tǒng)計(jì)最終各組的成活率(圖 7)。結(jié)果顯示3#、4#水樣處理后的稀有鯽胚胎成活率最低, 而2#水樣處理后與對(duì)照組均無(wú)死亡現(xiàn)象, 1#、5#組處理后的稀有鯽胚胎成活率則略低于對(duì)照組。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2#水樣其生物毒性相對(duì)最少, 對(duì)稀有鯽胚胎發(fā)育幾乎無(wú)影響, 1#、5#其次, 3#工業(yè)污水水樣水質(zhì)較差, 4#生活污水水樣污染最嚴(yán)重, 對(duì)胚胎發(fā)育毒性最大。

3 討論

表3 各水樣中的重金屬質(zhì)量濃度Tab. 3 The heavy metal concentrations of each sample (μg/L)

圖3 各水樣對(duì)稀有鯽胚胎心率的影響Fig. 3 The effect of samples on the heart rate of the embryo of rare minnow

圖4 各水樣處理后的稀有鯽胚胎孵化率對(duì)比Fig. 4 The hatching rates of the embryo of rare minnow in different sample treated groups

圖5 發(fā)育異常的稀有鯽胚胎特征Fig. 5 The characteristics of malformation in the embryos of rare minnow

本次實(shí)驗(yàn)采集了長(zhǎng)江岸線宜昌段城鎮(zhèn)化過(guò)程中五種不同類型的典型水樣。其中, 生活污水取自宜昌市猇亭區(qū)的生活污水市政管網(wǎng), 其來(lái)源主要是家庭生活使用后產(chǎn)生的廢水,此類廢水中通常含有大量的氨鹽和磷酸鹽[12]。工業(yè)污水是取自宜昌市猇亭化工園區(qū)長(zhǎng)江排污口, 該園區(qū)主要有宜昌市興發(fā)化工集團(tuán)等企業(yè), 主要集中于磷化工系列產(chǎn)品的生產(chǎn)與開發(fā)。農(nóng)業(yè)面源污染的水樣及漁業(yè)污水分別取自于枝江市安福寺鎮(zhèn)的瑪瑙河及宜昌市夷陵區(qū)的黃柏河, 這類水體的污染主要來(lái)自農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動(dòng)中的氮素和磷素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、農(nóng)藥以及其他有機(jī)或無(wú)機(jī)污染物質(zhì)。包括化肥污染、農(nóng)藥污染、集約化養(yǎng)殖場(chǎng)污染。主要污染物是重金屬、硝酸鹽、氨鹽、有機(jī)磷、六六六、DDT、病毒、病原微生物、寄生蟲和塑料增塑劑等[13]。此外, 我們還采集了長(zhǎng)江宜昌白洋港江段的水樣, 這五組水樣能較為全面的反映在該季節(jié)長(zhǎng)江岸線宜昌江段各類型水體的總體污染狀況。

本研究針對(duì)五組水樣檢測(cè)了常規(guī)污染物及部分重金屬含量等指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn), 多種污染物共存時(shí)往往存在疊加、拮抗或協(xié)同等復(fù)合毒性作用[14]。此外, 單一的理化指標(biāo)不能反映多種污染物之間的聯(lián)合作用, 運(yùn)用生物對(duì)水體生物毒性進(jìn)行評(píng)估直接反映復(fù)雜體系中所有組分的綜合作用[15]。本研究利用五組水樣處理了稀有鯽胚胎, 結(jié)果顯示長(zhǎng)江宜昌白洋港江段、農(nóng)業(yè)面源及漁業(yè)區(qū)域水樣水質(zhì)相對(duì)較好, 而取自猇亭化工園區(qū)長(zhǎng)江排污口的3#水樣和猇亭區(qū)生活污水市政管網(wǎng)的生活污水(4#水樣)則水質(zhì)污染相對(duì)嚴(yán)重。

圖6 各水樣中稀有鯽胚胎畸形率及發(fā)育遲緩率的對(duì)比Fig. 6 The effects of samples on malformation and retardation rates of embryos of rare minnow

圖7 各水樣處理96h后的稀有鯽胚胎存活率對(duì)比Fig. 7 The survival rates of the embryos of rare minnow in different water sample treated (96h) groups

已有的研究表明, 稀有鯽胚胎在25℃環(huán)境下在發(fā)育到約34h時(shí), 進(jìn)入心臟搏動(dòng)期, 心臟完全形成并開始緩緩搏動(dòng)[16]。此次我們利用不同水樣處理后發(fā)現(xiàn), 48h時(shí)的心率結(jié)果顯示4#水樣處理后的胚胎心率最低, 3#水樣次之, 顯示出發(fā)育異常的特征。研究發(fā)現(xiàn), 4#水樣的氨氮指標(biāo)相對(duì)最高, 處理后的稀有鯽胚胎出現(xiàn)了大量的發(fā)育異常并且死亡率明顯增高。特別是4#水樣處理的稀有鯽胚胎出現(xiàn)了大量的心包腫大現(xiàn)象, 心率、畸形率和存活率等影響指標(biāo)上也更加嚴(yán)重, 說(shuō)明4#水樣中的高氨氮含量在對(duì)稀有鯽胚胎發(fā)育的生物毒性上起了主要作用。此外, 4#水樣處理后的胚胎存在提前破膜現(xiàn)象, 推測(cè)有可能是氨氮通過(guò)滲透卵膜, 改變胚胎細(xì)胞膜內(nèi)外滲透壓造成的[17,18]。

綜合本次試驗(yàn)所有結(jié)果, 我們發(fā)現(xiàn)2#(長(zhǎng)江宜昌白洋港江段)水樣水質(zhì)最好, 污染相對(duì)最少, 對(duì)稀有鯽胚胎發(fā)育幾乎無(wú)影響; 1#(黃柏河, 漁業(yè)污水)水樣和5#(瑪瑙河, 農(nóng)村面源污染)水樣水質(zhì)相對(duì)較好; 3#水樣(猇亭化工園區(qū)工業(yè)污水)及4#水樣(猇亭區(qū)生活污水)的水質(zhì)最差, 特別是4#水樣, 其對(duì)稀有鯽胚胎發(fā)育毒性最大。因此, 對(duì)長(zhǎng)江岸線宜昌江段水污染治理提出的建議是: 該區(qū)域生活污水污染治理應(yīng)放在第一位, 其次工業(yè)污水污染。尤其需要優(yōu)先控制的指標(biāo)是生活污水中的氨氮含量。