雨生紅球藻蝦青素酰基轉(zhuǎn)移酶的鑒定與功能研究

曹 黎 馬海燕 魏自旺 趙 亮 伍小穎嚴(yán)海龍 胡 強(qiáng) 韓丹翔

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所藻類生物技術(shù)和生物能源中心, 武漢 430072; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

在自然界中, 蝦青素由一部分的微藻、植物、真菌及細(xì)菌合成, 而在微藻中的分布尤為廣泛。目前已知的能夠合成蝦青素的微藻包括新綠藻(Neochloris wimmeri)、柵藻(Scenedesmus vacuolatus)、小球藻(Chlorella zofingiensis)、原管藻(Protosiphon botryoides)和雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)等[1]。蝦青素在微藻細(xì)胞中的積累, 是單細(xì)胞光合生物抵抗環(huán)境脅迫的一種重要保護(hù)機(jī)制。以雨生紅球藻為例, 其在氮和磷等營養(yǎng)缺乏以及高光、高鹽、高溫和干燥脅迫條件下可以誘導(dǎo)蝦青素的積累, 最高可達(dá)干重的4%[2,3]。

近年來, 雨生紅球藻中許多與類胡蘿卜素和蝦青素生物合成相關(guān)的編碼基因已經(jīng)被鑒定, 這也使其成為研究蝦青素生物合成與調(diào)控的模式生物[4]。目前對(duì)雨生紅球藻蝦青素生物合成調(diào)控的研究大多數(shù)集中在基因表達(dá)調(diào)控上。研究發(fā)現(xiàn), 雨生紅球藻中大多數(shù)涉及類胡蘿卜素生物合成的基因, 受到非生物脅迫條件(如高光、高鹽等)在轉(zhuǎn)錄水平上的正向調(diào)控[5,6]。轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控被認(rèn)為受自由基的形成的控制[7]。另外, 通過一系列的光合電子傳遞的抑制劑研究表明, 質(zhì)體醌的氧化還原狀態(tài)也能調(diào)控類胡蘿卜素合成基因的表達(dá)[8]。

最新研究表明蝦青素和脂肪酸生物合成這兩個(gè)途徑是通過形成蝦青素酯相互作用的, 表明蝦青素的生物合成可能存在代謝水平的調(diào)控。一旦蝦青素酯的合成受到抑制, 細(xì)胞內(nèi)游離的蝦青素過多積累, 從而對(duì)蝦青素生物合成起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)[9]。研究發(fā)現(xiàn)在蝦青素合成的體外酶活測(cè)定體系中添加甘油二酯酰基轉(zhuǎn)移酶(Diacylglycerol Acyltransferase, DGAT)特異性抑制劑黃腐酚(Xanthohumol)和A922500, 對(duì)蝦青素酯和蝦青素的凈合成起到抑制作用[10—12]。該結(jié)果表明蝦青素酯的形成即蝦青素的?；赡苁怯蒁GAT所催化。

DGAT是甘油三酯(Triacylglycerol, TAG)合成過程中的限速酶, 能夠催化甘油二酯的酰基化反應(yīng)。目前有一些DGAT已經(jīng)被鑒定, 包括Ⅰ型的DGAT1和Ⅱ型的DGAT2[13]。它們催化了相同的生物學(xué)反應(yīng), 但是在序列上并沒有明顯的相似性[14]。DGAT1作為膜結(jié)合Acyl-CoA-?；D(zhuǎn)移酶(Membrane bound O-acyltransferase, MBOAT)家族的一員, 具有廣泛的底物選擇性, 是一種多功能酶[15]。DGAT2首次是在一種油性真菌拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)中被發(fā)現(xiàn)[16]。通過對(duì)目前已知基因組藻的比較分析表明在真核藻類中DGAT2比DGAT1更為普遍存在, 比如萊茵衣藻Chlamydomonas reinhardtii具有5個(gè)DGAT2, 其中的2個(gè)拷貝在缺氮條件下表達(dá)上調(diào)[17,18]。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上, 首次克隆了雨生紅球藻II型DGAT編碼基因(DGTT2)cDNA全長(zhǎng)序列, 并通過體內(nèi)外的酶活分析體系初步確認(rèn)了其功能, 為深入研究蝦青素酯化過程奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雨生紅球藻H. pluvialis316由本實(shí)驗(yàn)室保藏。TAG合成缺陷型酵母Saccharomyces cerevisiaeH1246(MATαare1-Δ::HIS3are2-Δ::LEU2dga1-Δ::KanMX4 Iro1-Δ::TRP1 ADE2 ura3TAG-SE-)[19]和酵母表達(dá)載體pYES2/CT均購自美國Invitrogen公司。pYES2/CT-CrDGTT2-H1246過表達(dá)酵母轉(zhuǎn)化子由北京大學(xué)劉進(jìn)老師惠贈(zèng)。

1.2 DGTT2基因引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增

將萊茵衣藻DGAT2家族中的CrDGTT1(Cre12.g557750), CrDGTT2(Cre02.g121200), CrDGTT3(Cre06.g299050)和CrDGTT4(Cre03.g205050)的氨基酸序列依次在雨生紅球藻高光脅迫下的轉(zhuǎn)錄本中進(jìn)行比對(duì), 得到一個(gè)與CrDGTT2氨基酸序列高度匹配的轉(zhuǎn)錄本。該轉(zhuǎn)錄本含有第一個(gè)起始密碼子ATG、終止密碼子, 部分5′-UTR和3′-UTR。接著設(shè)計(jì)上下游引物(5′-cggaattcATGGGTGTCGCAACG AATGC-3′/5′-gctctagaCTGGATCTCCAGGGGCT TGTC-3′, 由上海生工生物技術(shù)有限公司合成), 并以雨生紅球藻cDNA庫為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR體系(25 μL)如下: Premix(Vazyme Biotech)12.5 μL,ddH2O 9.5 μL, 上游引物1 μL, 下游引物1 μL,cDNA模板1 μL。反應(yīng)條件為98℃預(yù)變性2min,98℃變性30s, 59℃退火30s, 72℃延伸1min, 共35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min, 4℃保存。PCR產(chǎn)物用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè), 切膠純化回收目的片段, 然后將產(chǎn)物與pMD18-T載體連接, 并轉(zhuǎn)化至DH5α中, 氨芐抗性平板篩選陽性克隆并進(jìn)行菌液PCR鑒定, 最后送往上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

1.3 DGTT2基因序列分析

利用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)的BLASTP工具進(jìn)行同源基因氨基酸序列的查找。利用ExPASy(http://web.expasy.org/protparam/)軟件預(yù)測(cè)蛋白分子量及等電點(diǎn)。利用SMART(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)軟件預(yù)測(cè)蛋白跨膜結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN 6.0進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)以及MEGA 6.0軟件中的鄰接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.4 酵母菌株的轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)和誘導(dǎo)

將測(cè)序正確的pMD18-T-HpDGTT2經(jīng)雙酶切后克隆到酵母表達(dá)載體pYES2/CT并轉(zhuǎn)化至酵母S.cerevisiaeH1246, 實(shí)驗(yàn)操作根據(jù)試劑盒說明書(Invitrogen, USA)進(jìn)行。將酵母株pYES2/CT-H1246、pYES2/CT-HpDGTT2-H1246以及pYES2/CTCrDGTT2-H1246接種于酵母Sc-Ura生長(zhǎng)培養(yǎng)基中(北京泛基諾科技有限公司), 培養(yǎng)條件為30℃,250 r/min培養(yǎng)12h至16h, 然后轉(zhuǎn)接至酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基(北京泛基諾科技有限公司)中并使其接種初始濃度A600為0.4。pYES2/CT-HpDGTT2-H1246、陽性對(duì)照pYES2/CT-CrDGTT2-H1246及空載pYES2/CT-H1246酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)時(shí)間分別為12h、12h和24h。

1.5 外源脂肪酸喂養(yǎng)HpDGTT2和CrDGTT2酵母轉(zhuǎn)化子

pYES2/CT-HpDGTT2-H1246和pYES2/CTCrDGTT2-H1246被轉(zhuǎn)接至誘導(dǎo)培養(yǎng)基后, 將終濃度為90 μmol/L的外源脂肪酸C16﹕1(n7), C18﹕2和C18﹕3(n3)[脂肪酸均溶解于0.1 g/L牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)]添加入酵母培養(yǎng)物中, 分別取培養(yǎng)0和24h的培養(yǎng)物經(jīng)10 μmol/L的BODIPY 409/503(Invitrogen, USA)進(jìn)行染色后拍照以觀察脂滴的合成。

1.6 酵母微粒體的提取與蛋白免疫印跡(Westernblotting)驗(yàn)證

將誘導(dǎo)收獲的酵母經(jīng)4000×g, 2min離心后去除上清。用PBS磷酸緩沖液輕輕重懸酵母, 經(jīng)4000×g, 2min離心后去除上清; 然后將菌體重懸于酵母裂解緩沖液[5%(w/v)甘油, 20 mmol/L Tris-HCl(pH=8.0)、0.3 mol/L (NH4)2SO4、10 mmol/L MgCl2+蛋白酶抑制劑, 購自Roche公司], 經(jīng)低溫超高壓細(xì)胞破碎儀破碎(1000 bar預(yù)破碎一次, 1800 bar破碎3至4次), 收集細(xì)胞勻漿, 經(jīng)3000×g, 10min,4℃離心, 將上清轉(zhuǎn)移至干凈的超離管; 經(jīng)10000×g,30min, 4℃離心去除線粒體, 將上清轉(zhuǎn)移至干凈的超離管; 100000×g, 60min, 4℃離心去除上清, 收集沉淀得到酵母微粒體。用制備的酵母的微粒體做蛋白免疫印跡, 其中將轉(zhuǎn)化空載的酵母的微粒體作為對(duì)照, 以確認(rèn)HpDGTT2在酵母中的表達(dá)。蛋白免疫印記的操作過程為取20 μL的酵母微粒體, 加入60 μL的緩沖液A和40 μL的緩沖液B于震蕩儀上震蕩30min使其充分混合, 其中緩沖液A組分為0.1 mol/L Na2CO3和0.1 mol/L二硫蘇糖醇(DL-Dithiothreitol, DTT); 緩沖液B組分為30%(m/v)蔗糖和5%(w/v)十二烷基硫酸鈉(Sodium dodecyl sulfate,SDS); 然后加入20 μL 6×蛋白質(zhì)上樣緩沖液(Trans-Gen Biotech), 于65℃金屬浴10min, 接著20000×g,4℃, 10min離心后取上清上樣至聚丙烯酰胺凝膠中電泳。

1.7 雨生紅球藻的培養(yǎng)和誘導(dǎo)

將雨生紅球藻H. pluvialis316以初始接種濃度約5×104cells/mL接種于12 L的平板光生物反應(yīng)器中, 培養(yǎng)基為BG-11(Blue-Green Medium)完全培養(yǎng)基[20], 培養(yǎng)溫度為20℃, CO2通氣量為2%(v/v), 光強(qiáng)控制在20 μmol photons/(m2·s)。經(jīng)4－5d的生長(zhǎng)細(xì)胞濃度約1.1×105cells/mL, 經(jīng)3000×g, 3min離心去除上清收集藻細(xì)胞, 用PBS磷酸緩沖液洗1至2次后將細(xì)胞輕柔重懸于BG-11缺氮培養(yǎng)基中, 光強(qiáng)控制在200 μmol photons/(m2·s), 高光缺氮誘導(dǎo)13h后離心(3000×g, 3 min)收集雨生紅球藻細(xì)胞, 再經(jīng)磷酸緩沖液PBS清洗1至2次。3000×g, 3min離心后去掉上清收獲藻細(xì)胞。

1.8 雨生紅球藻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的制備

將經(jīng)生長(zhǎng)和誘導(dǎo)收獲的雨生紅球藻細(xì)胞重懸于藻裂解緩沖液(10 mmol/L Tris-HCl, pH=7.4、5 mmol/L Na2EDTA、0.1%(w/v)BSA+蛋白酶抑制劑, 購自Roche公司), 經(jīng)低溫超高壓細(xì)胞破碎儀破碎(1000 bar預(yù)破碎1次, 1400 bar破碎3至4次)。收集細(xì)胞勻漿, 經(jīng)3000×g, 10min, 4℃離心。將離心后的上清轉(zhuǎn)移至干凈的超離管中, 經(jīng)10000×g, 14min,4℃離心去除線粒體; 然后將上清依次用18%和25%(w/v)的蔗糖溶液懸托, 經(jīng)100000×g, 60min, 4℃超速離心后, 收集原蔗糖濃度18%以及18%和25%界面層位置所在處的溶液, 將其轉(zhuǎn)移至干凈的超離管中, 再次經(jīng)100000×g, 60min, 4℃超速離心后去掉上清, 收集沉淀得到雨生紅球藻的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。借助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器特異性蛋白Marker, 蛋白免疫印跡檢測(cè)分離得到的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的質(zhì)量。

1.9 雨生紅球藻蝦青素?；捏w外酶學(xué)分析體系的建立

體外酶學(xué)分析體系的建立將分離出的雨生紅球藻的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為蝦青素酰基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)測(cè)定的粗酶, 將蝦青素單體(HPLC級(jí), 純度≥97%,Sigma-Aldrich)和?；o酶A(Acyl-CoA)(Sigma-Aldrich)作為蝦青素酯合成的前體。體外酶學(xué)分析體系的建立如下: 將制備好的雨生紅球藻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與蝦青素分子(溶解在氯仿中)在正己烷和機(jī)械力的作用下融合。在一個(gè)總體積為600 μL的反應(yīng)體系中,其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白總量約500 μg, 蛋白濃度用CB-X protein assay kit(GBiosciences, http://www.gbiosciences.com)來測(cè)量, 根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作。蝦青素單體和?；o酶A(18﹕1-CoA, n9)在反應(yīng)體系中終濃度為250 μmol/L, 其中將以水代替?；o酶A的反應(yīng)體系作為對(duì)照組。

利用體外酶學(xué)分析體系鑒定蝦青素?；D(zhuǎn)移酶將含有重組HpDGTT2的酵母微粒體(蛋白總量約為600 μg)分別添加至上述體系中進(jìn)行蝦青素?；D(zhuǎn)移酶酶活檢測(cè)。其中將空載表達(dá)載體pYES2/CT-H1246的酵母微粒體作為蝦青素?；D(zhuǎn)移酶活反應(yīng)的對(duì)照組。以上實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件為30℃,250 r/min, 反應(yīng)時(shí)間90min。雨生紅球藻蝦青素酰基化的體外酶活反應(yīng)完成后, 用1.8 mL甲醇終止反應(yīng), 再加入4.8 mL氯仿, 在震蕩儀上水平震蕩10min來提取反應(yīng)體系中的色素。經(jīng)1000×g, 3min離心后吸取有機(jī)層轉(zhuǎn)移至干凈的玻璃管中, 溶解于有機(jī)試劑中的色素經(jīng)氮?dú)獯蹈珊? 復(fù)溶于300 μL甲醇﹕二氯甲烷=3﹕1(v/v)(HPLC級(jí), Sigma-Aldrich, USA), 然后用高效液相色譜儀來對(duì)反應(yīng)體系中的色素組分進(jìn)行定性和定量的分析。

高效液相色譜檢測(cè)條件根據(jù)不同類胡蘿卜素保留時(shí)間和480 nm吸收光下光譜圖的差異,可以鑒定出游離蝦青素及蝦青素酯所對(duì)應(yīng)的色譜峰[21]。在本研究當(dāng)類胡蘿卜素的分離洗脫程序?yàn)? 0—8min流動(dòng)相為100%A; 8—14min流動(dòng)相由100%A切換為100%B; 14—38min流動(dòng)相為100%B; 38—40min流動(dòng)相由100%B切換為100%A; 40—45min流動(dòng)相為100%A。A相為二氯甲烷﹕甲醇﹕乙腈﹕水=5﹕85﹕5.5﹕4.5(v/v); B相為二氯甲烷﹕甲醇﹕乙腈﹕水=25﹕28﹕42.5﹕4.5(v/v), 分離洗脫流速為1 mL/min。

1.10 酶活性的表征

利用雨生紅球藻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜建立體外反應(yīng)體系雨生紅球藻蝦青素?；捏w外酶活反應(yīng)完成后, 用甲醇終止反應(yīng), 用氯仿來提取反應(yīng)體系中的色素, 然后用高效液相色譜儀來對(duì)反應(yīng)體系中的色素組分進(jìn)行定性和定量的分析。根據(jù)不同色素保留時(shí)間和480 nm吸收光下光譜圖的差異, 可以鑒定出蝦青素酯所對(duì)應(yīng)的色譜峰。每個(gè)色譜峰對(duì)應(yīng)的峰面積數(shù)值大小可以表征色素的含量[22]。在以雨生紅球藻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜建立反應(yīng)體系時(shí), 將以水代替酰基輔酶A的反應(yīng)體系作為對(duì)照組。分別統(tǒng)計(jì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的蝦青素酯的含量并進(jìn)行比較分析。

利用體外分析體系鑒定蝦青素?；D(zhuǎn)移酶將實(shí)驗(yàn)組(HpDGTT2微粒體+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為酶源)所生成的蝦青素酯的含量相對(duì)于對(duì)照組(空載微粒體+內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為酶源)蝦青素酯的含量的比值作為評(píng)價(jià)Hp-DGTT2酵母微粒體活性的依據(jù)。若其比值大于1,則表明HpDGTT2有效地參與了反應(yīng), 從而初步確定HpDGTT2為蝦青素?；D(zhuǎn)移酶。以上每組各設(shè)置4組技術(shù)重復(fù)并進(jìn)行t-test, 如果P<0.05則認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 雨生紅球藻DGTT2基因全長(zhǎng)擴(kuò)增和序列分析

以雨生紅球藻cDNA為模板, 設(shè)計(jì)引物DGTT2-Y-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 獲得雨生紅球藻DGTT2基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1017 bp, 共編碼338個(gè)氨基酸, 其相對(duì)分子質(zhì)量為37.82326 kD, 理論等電點(diǎn)(Isoelecric point)為9.75。通過TMHMM軟件預(yù)測(cè)DGTT2編碼了1個(gè)3次跨膜蛋白。通過DNAMAN6.0進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)DGTT2包含一段高度保守的“YFP”結(jié)構(gòu)域和一段與DGAT2/MGAT活性功能相關(guān)的“FPHG”結(jié)構(gòu)域(圖 1)[23]。

雨生紅球藻DGTT2氨基酸序列經(jīng)NCBI中Protein Blast比對(duì), 發(fā)現(xiàn)其與萊茵衣藻的DGTT2(CrDGTT2)具有最高的同源性, 相似性高達(dá)97%。利用軟件ClustalW與其他23種生物的DGAT2氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 并用MEGA6.0軟件以鄰位相接法(Neighbor-joining method)構(gòu)建了DGAT2基因氨基酸的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。如圖 2所示, HpDGTT2與萊茵衣藻中的同源基因CrDGTT2形成聚類, 該類群與由單細(xì)胞綠藻Monoraphidium neglectumdDGAT2和月牙藻Raphidocelis subcapitataDGAT2所組成的類群構(gòu)成姐妹群。

2.2 HpDGTT2在TAG合成缺陷型酵母Saccharomyces cerevisiae H1246中的表達(dá)

用提取的pYES2/CT-HpDGTT2-H1246酵母的微粒體用做蛋白免疫印跡檢測(cè), 以確認(rèn)HpDGTT2的表達(dá)。結(jié)果表明HpDGTT2在酵母中成功表達(dá)而且可在微粒體中檢測(cè)到, HpDGTT2編碼的融合蛋白分子大小分別約為38 kD(圖 3A), 與預(yù)測(cè)的結(jié)果基本一致。為了檢測(cè)HpDGTT2是否具有DGAT功能參與TAG的合成, 本研究對(duì)酵母細(xì)胞進(jìn)行了熒光染色和顯微觀察。由于雨生紅球藻的甘油三酯富含C16﹕1(n7)、C18﹕2和C18﹕3(n3), 而這些脂肪酸在酵母細(xì)胞中含量低[24,25], 因此在酵母培養(yǎng)體系中添加了以上三種外源的脂肪酸, 以避免由于脂肪酸缺乏導(dǎo)致無法檢測(cè)到TAG合成的情況發(fā)生。本研究還將CrDGTT2過表達(dá)酵母(以及脂肪酸喂養(yǎng)組)作為TAG合成的正對(duì)照[26]。結(jié)果顯示無論是否添加外源脂肪酸, 過表達(dá)HpDGTT2均未能回補(bǔ)S. cerevisiaeH1246的TAG合成缺陷的表型(圖 3B), 而過表達(dá)陽性對(duì)照CrDGTT2酵母轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)了產(chǎn)油的表型(圖 3C), 說明HpDGTT2不具備合成TAG的功能。

2.3 HpDGTT2具有蝦青素?；D(zhuǎn)移酶的功能

當(dāng)用HPLC對(duì)雨生紅球藻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的色素組成進(jìn)行分析時(shí), 發(fā)現(xiàn)在本研究中所使用的HPLC色素檢測(cè)系統(tǒng)中, 蝦青素在保留時(shí)間3min左右時(shí)出峰, 而蝦青素酯的出峰時(shí)間在12—28min左右(圖 4A)。將雨生紅球藻分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為粗酶建立蝦青素酯的體外酶活測(cè)定方法時(shí), 首先利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)細(xì)胞器特異性蛋白標(biāo)記物BIP對(duì)分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行免疫印跡, 結(jié)果顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)制備質(zhì)量良好(圖 4B)。體外酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 相比于對(duì)照組, 實(shí)驗(yàn)組的蝦青素酯的絕對(duì)含量在反應(yīng)的90min內(nèi)呈現(xiàn)了明顯的增加(圖 4C)。

將空載pYES2/CT和pYES2/CT-HpDGTT2酵母微粒體添加到雨生紅球藻分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為粗酶建立蝦青素酯的體外酶活測(cè)定方法時(shí), 發(fā)現(xiàn)添加Hp-DGTT2酵母微粒體使反應(yīng)體系中保留時(shí)間為20.8min,21.1min, 24.3min對(duì)應(yīng)的蝦青素酯的含量分別提高了13.79%、9.56%和25.86%(P<0.05, 圖 5)。這一結(jié)果說明HpDGTT2具有蝦青素?；D(zhuǎn)移酶的功能。

圖2 鄰接法構(gòu)建HpDGTT2氨基酸系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(Bootstrap=1000)Fig. 2 Phylogenetic tree constructed from the HpDGTT2 amino acid with the neighbor-joining method (Bootstrap=1000)

3 討論

基于HpDGAT可能催化蝦青素的酯化過程的科學(xué)假設(shè), 本研究克隆了雨生紅球藻II型DGAT編碼基因HpDGTT2。生物信息學(xué)分析表明HpDGTT2屬于溶血磷脂?；D(zhuǎn)移酶(Lysophospholipid Acyltransferases, LPLAT)超家族, 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析顯示HpDGTT2與CrDGTT2親緣關(guān)系較近。氨基酸序列以及活性位點(diǎn)的高度相似性說明二者可能具有相似的功能。然而通過酵母的回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)HpDGTT2不具有典型的DGAT功能, 即以甘油二酯和酰基輔酶A為底物合成甘油三酯, 這與CrDGTT2形成了明顯的對(duì)比。這一發(fā)現(xiàn)說明在進(jìn)化的過程中, HpDGTT2基因可能發(fā)生了分化并獲得了新的功能。

進(jìn)一步通過體外酶活實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)HpDGTT2可能具有蝦青素?；D(zhuǎn)移酶的功能, 即以蝦青素和?；o酶A為底物催化蝦青素酯的形成。盡管過去的研究成功建立了以β-carotene為前體合成蝦青素的體外酶活測(cè)定體系[27,28]，但是蝦青素?；拿富顪y(cè)定尚未見報(bào)道, 這也是鑒定蝦青素酰基轉(zhuǎn)移酶編碼基因所面臨的最大困難。已有的研究表明,蝦青素的?；l(fā)生在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上[29—30], 因此本研究首先采用了分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為正對(duì)照建立蝦青素酰基化的酶活測(cè)定方法。在蝦青素酰基化的體外酶學(xué)實(shí)驗(yàn)最初的探索階段, 本研究參照過去蝦青素生物合成的酶活的測(cè)定方法, 將外源蝦青素和卵磷脂制成脂質(zhì)體, 以增加底物的水溶性, 使其充分地參與到蝦青素?；姆磻?yīng)體系當(dāng)中。結(jié)果表明,實(shí)驗(yàn)組中蝦青素酯的含量在反應(yīng)時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)的上升趨勢(shì), 說明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蝦青素?；D(zhuǎn)移酶催化了蝦青素酯的合成(結(jié)果未顯示)。然而, 這樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性差, 成功率低, 說明與β-carotene不同的是被脂質(zhì)體包被的蝦青素分子可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的酰基轉(zhuǎn)移酶接觸并發(fā)生反應(yīng)的幾率并不高。因此, 本研究進(jìn)一步嘗試改進(jìn)了促使蝦青素分子進(jìn)入反應(yīng)體系中的方式, 即在正己烷的作用下用機(jī)械研磨的方式將蝦青素分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜融合, 以增加蝦青素分子與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的?；D(zhuǎn)移酶接觸并發(fā)生反應(yīng)的幾率。酶學(xué)分析發(fā)現(xiàn)以機(jī)械研磨的方式可以使雨生紅球藻內(nèi)質(zhì)網(wǎng)?；D(zhuǎn)移酶有效地參與到蝦青素?；姆磻?yīng)體系中, 即采用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為正對(duì)照的實(shí)驗(yàn)?zāi)芊€(wěn)定、可重復(fù)地檢測(cè)出蝦青素?；D(zhuǎn)移酶活性。隨后在此反應(yīng)體系中加入表達(dá)有HpDGTT2的酵母的微粒體, 發(fā)現(xiàn)其使某些特定的保留時(shí)間下蝦青素酯發(fā)生顯著凈增。通過成功建立蝦青素?；捏w外酶活分析體系, HpDGTT2被初步鑒定為蝦青素?；D(zhuǎn)移酶。

圖3 HpDGTT2和CrDGTT2在S. cerevisiae H1246中的表達(dá)及功能回補(bǔ)分析Fig. 3 Expression of HpDGTT2 and CrDGTT2 in S. cerevisiae H1246 and functional complementation analysis

圖4 蝦青素?；w外酶活分析體系建立Fig. 4 Establishment of astaxanthin acylation in an in vitro enzymatic assay system

圖5 添加含有HpDGTT2的酵母微粒體導(dǎo)致反應(yīng)體系保留時(shí)間分別為20.8min、21.1min 和24.3min的蝦青素酯含量的凈增加(*, P<0.05)Fig. 5 Addition of the yeast microsomes harboring HpDGTT2 led to a net increase in the content of astaxanthin esters with retention times of 20.8min, 21.1min and 24.3min (*, P<0.05)

在大多數(shù)生物體內(nèi), DGAT2主要負(fù)責(zé)甘油三酯TAG的生物合成[31]。大多數(shù)已知的真核藻類含有多個(gè)DGAT2拷貝, 例如在偽矮海鏈藻(T. pseudonana), 三角褐指藻(Phaeodactylum triconutum),微擬球藻(Nanochloropsis oceanica)中分別有4和6和11個(gè)DGAT2編碼基因[32,33], 而這些數(shù)目眾多的DGAT基因在行使甘油三酯合成的功能之外是否還具有其他的功能是有待回答的科學(xué)問題。在過去一系列針對(duì)包括海洋微擬球藻、萊茵衣藻的研究中就發(fā)現(xiàn)部分DGAT基因在體外酶活的測(cè)試中并未顯示出典型的催化甘油三酯合成的活性, 在體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)油條件下, 部分DGAT基因在轉(zhuǎn)錄水平上也沒有任何響應(yīng)[34], 這表明這些DGAT基因可能在進(jìn)化過程中獲得了新的未知功能, 而具體的機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。

目前對(duì)于類胡蘿卜素(包括蝦青素分子)酯的形成的相關(guān)研究非常有限。但是對(duì)比長(zhǎng)鏈的碳?xì)浠衔锏孽；^程的研究不難發(fā)現(xiàn)DGAT可能在這一類化合物?；倪^程中扮演非常重要的作用。例如, 在哺乳動(dòng)物中, 視黃醇(類胡蘿卜素的降解產(chǎn)物)可以被?；癁橐朁S醇酯[35], 而且這一過程是被DGAT1催化的, 其具有視黃醇酰基轉(zhuǎn)移酶(Acyl-CoA: Retinol acyltransferase, ARAT)的活性[36]。鼠科的DGAT1也具有多種?；D(zhuǎn)移酶活性, 包括甘油單酯?；D(zhuǎn)移酶(Acyl-CoA: Monoacylglycerol acyltransferase, MGAT)活性合成甘油二酯DAG; 蠟?；D(zhuǎn)移酶活性合成蠟酯。類似地, 在哺乳動(dòng)物,植物和微生物中的DGAT2能夠利用廣泛的?；荏w[37], 例如破囊壺菌(Thraustochytrium aureum)的DGAT2能夠利用脂肪醇和?；o酶A生成蠟酯類物質(zhì)[38]。而對(duì)擬南芥的兩個(gè)葉綠醇?；D(zhuǎn)移酶(Phytyl ester synthase, PES)的酶學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它們都具有典型的Ⅰ型和Ⅱ型的DGAT功能, 即利用?；o酶A為?；w, 甘油二酯DAG或者其他含有羥基的分子如甘油單酯(Monoacylglycerol, MAG)和醇類為?；荏w, 形成含有酯鍵的脂類分子[39]。這些信息也進(jìn)一步反映了雨生紅球藻中蝦青素的?；磻?yīng)極有可能是由DGAT催化的。

本研究克隆了雨生紅球藻DGTT2編碼區(qū)全長(zhǎng),其氨基酸序列和活性位點(diǎn)雖然與萊茵衣藻DGTT2高度相似, 但是在以酵母為表達(dá)宿主的異源體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)到其TAG合成活性, 其不具有DGAT功能。而在以雨生紅球藻分離的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為粗酶成功建立蝦青素?；捏w外分析體系時(shí),HpDGTT2卻展示出了蝦青素酰基轉(zhuǎn)移酶的活性。這些結(jié)果表明HpDGTT2可能參與到蝦青素酯的生物合成中, 但是其生物合成代謝調(diào)控有待進(jìn)一步研究。值得一提地是HpDGTT2酵母微粒體作用的蝦青素酯的保留時(shí)間相對(duì)靠后, 主要是一些蝦青素雙酯。這說明HpDGTT2可能主要以蝦青素單酯為前體合成雙酯。因此在未來的研究當(dāng)中, 制備蝦青素單酯用作體外反應(yīng)研究HpDGTT2功能值得嘗試。