腐殖酸對(duì)沉積物中納米銀的釋放及其毒性的影響研究

黃嬌龍 劉夏薇 黃曼綺 鮑少攀 唐 巍 方 濤

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院, 襄陽 441000;3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

納米銀(Silver nanoparticles, AgNPs)在消費(fèi)品(水過濾器、油漆、化妝品、除臭劑、紡織品、食品包裝、功能化塑料、醫(yī)療器械、傷口敷料、洗衣機(jī)和冰箱等電器)、生物材料(各種生物醫(yī)學(xué)傳感器的開發(fā))和水處理等多個(gè)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[1]。據(jù)估計(jì), 2016年全球?qū)︺y的年需求量超過已2.76×107kg, 且當(dāng)前AgNPs的全球年產(chǎn)量為約為(3.6—4.5)×105kg[2—5]。含AgNPs產(chǎn)品的廣泛使用將不可避免地導(dǎo)致進(jìn)入到水環(huán)境中AgNPs增加, 從而引發(fā)了人們關(guān)于AgNPs水生態(tài)安全性的擔(dān)憂[6]。

進(jìn)入水環(huán)境的AgNPs可以發(fā)生同聚(與其他納米粒子聚集)或異聚(與天然礦物質(zhì)和有機(jī)膠體聚集)現(xiàn)象, 并最終可能沉降到沉積物表面[7]。對(duì)于不同深度沉積物樣品的分析表明, 進(jìn)入沉積物中的AgNPs絕大部分(>94%)積累在其表層(<5 mm)[8]。這些AgNPs對(duì)沉積物生態(tài)系統(tǒng)具有不容忽視的影響, 如研究人員發(fā)現(xiàn)沉積物中AgNPs不僅對(duì)底棲動(dòng)物具有急慢性毒性[9,10], 還對(duì)微生物的群落結(jié)構(gòu)和活性具有一定影響[11—14]。

進(jìn)入沉積物的AgNPs會(huì)發(fā)生一系列物理化學(xué)轉(zhuǎn)化, 如氧化溶解[15]、硫化[16—18]和氯化[19]。AgNPs也可與天然有機(jī)物(NOM)相互作用, 進(jìn)而使得AgNPs的環(huán)境行為和毒性發(fā)生改變[20—25]。NOM如腐殖酸(HA)和富里酸(FA), 廣泛分布于土壤、沉積物和水中, 但NOM如何影響沉積物中AgNPs的歸趨尚不清楚。

因此, 本研究主要關(guān)注沉積物中NOM對(duì)其中AgNPs釋放的影響, 并探明釋放出的AgNPs的毒性作用。研究將為揭示AgNPs在水環(huán)境中的遷移轉(zhuǎn)化和生態(tài)環(huán)境安全性評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與材料

JEM-2100型透射電子顯微鏡(TEM)、D/MXIIIA型X射線衍射儀(XRD)、Multiwave 3000微波消解儀、NexION300X電感耦合等離子體-質(zhì)譜儀(ICP-MS)、ROTINA380高速臺(tái)式離心機(jī)、OS20-Pro數(shù)字頂置式攪拌器、冷凍干燥機(jī)、arium basic型超純水儀、D3024R高速冷凍離心機(jī)和SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀。

本研究中所用的納米銀溶液購自上海滬正納米科技有限公司(中國, 上海)。硝酸銀(AgNO3)、碳酸鈣(CaCO3)購自國藥控股有限公司(中國, 北京), 純度達(dá)到99.8%。電子級(jí)硝酸(HNO3)購自蘇州晶瑞化學(xué)股份有限公司(中國, 江蘇), UP級(jí), 含量為68.0%—70.0%。腐殖酸(HA), 灰分低于10%, 購自天津光復(fù)精細(xì)化工研究所(中國, 天津)。所有購買的化學(xué)品均為分析純及以上。實(shí)驗(yàn)中所用的玻璃儀器和塑料儀器使用前均經(jīng)10%HNO3浸泡24h以上。

1.2 受試生物

野生型成年斑馬魚[體重: (0.3±0.03) g, wt; 長(zhǎng)度: (3.3±0.07) cm]來自中國科學(xué)院水生生物研究所。實(shí)驗(yàn)前, 將斑馬魚放入脫氯水中, 使其在與后續(xù)試驗(yàn)相同的條件下適應(yīng)10d, 適應(yīng)期間沒有魚死亡。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中, 光暗循環(huán)為14﹕10, 水溫保持在(26.6±0.2)℃, pH穩(wěn)定在7.59±0.07, 并且溶解氧(DO)含量保持在5 mg/L以上。每天用新孵化的鹽水蝦(Artemia salina)喂食2次。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

配制沉積物 本研究所使用的沉積物是經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)化學(xué)品測(cè)試導(dǎo)則219《沉積物-水系統(tǒng)中搖蚊毒性試驗(yàn) 加標(biāo)于沉積物法》(英文版)中所提出的配制沉積物[26]。同時(shí)根據(jù)Hund-Rinke等[27]提出的修改意見: 降低沉積物中有機(jī)質(zhì)含量(泥炭占5%降低到2%)。因此, 本研究中所使用的配制沉積物的組分為: 78%石英砂、20%高嶺石黏土和2%泥炭。通過550℃煅燒來去除配制沉積物中的天然有機(jī)物[28], 通過引入腐殖酸來增加配制沉積物中天然有機(jī)物含量[29], 得到本研究使用的4種腐殖酸含量不同的配制沉積物: 0、1%、5%和10%。配制沉積物實(shí)際測(cè)得的有機(jī)質(zhì)和含水率如表 1所示。實(shí)驗(yàn)前, 沉積物在與后續(xù)試驗(yàn)相同的條件下陳化7d。

加標(biāo)沉積物沉積物中AgNPs的濃度設(shè)定為100 μg/g Ag dw(dw, 干重), 該濃度的選取是基于預(yù)測(cè)沉積物中AgNPs濃度為87.8—614.4 μg/g[13]和先前的研究[10,22]。沉積物加標(biāo)方法參照Cong等[22]的方法, 即將一定體積的銀溶液加入到已知質(zhì)量的沉積物中, 用干凈的木鏟攪拌, 攪拌均勻后得到目標(biāo)沉積物濃度。對(duì)于AgNPs處理組, 我們分別添加了200 mL AgNPs溶液。對(duì)于銀離子處理組, 我們分別添加了200 mL AgNO3溶液。沉積物加標(biāo)后,對(duì)每種加標(biāo)濃度的沉積物進(jìn)行定量檢測(cè)(表 1), 處理組之間加標(biāo)沉積物濃度無顯著性差異(P>0.05),具有可比性。

表1 實(shí)驗(yàn)中配制沉積物實(shí)際的有機(jī)質(zhì)、含水率和加標(biāo)Ag濃度(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab. 1 The actual organic matter, water content and the concentration of spiked Ag of the formulated sediments in the experiment (Mean ± SEM, n=3)

水-沉積物微宇宙系統(tǒng)的建立實(shí)驗(yàn)中對(duì)沉積物共進(jìn)行了6種處理, 分為HA處理組(0HA+AgNPs組、1%HA+AgNPs組、5%HA+AgNPs組和10%HA+AgNPs組)和Ag處理組(5%HA+None Ag組、5%HA+AgNPs組和5%HA+AgNO3組)兩大部分。所有處理組沉積物中銀濃度均為100 μg/g Ag dw, 每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行。實(shí)驗(yàn)在40 cm×25 cm×25 cm的玻璃缸中進(jìn)行, 將2 kg(干重)對(duì)照或加標(biāo)的沉積物引入玻璃缸中(沉積物的厚度為2—3 cm), 然后在48h后小心地加入脫氯自來水(11.6 L, 水柱高度為12 cm), 在加水過程中盡量避免擾動(dòng)沉積物表面。為了防止斑馬魚直接接觸沉積物中的AgNPs, 在沉積物上方安裝了一塊玻璃孔板(孔徑為2 mm)。所有裝置放在恒溫(25℃)條件下。遵循Simpson等[30]的建議, 加標(biāo)沉積物+上覆水系統(tǒng)在引入受試生物之前平衡10d, 以達(dá)到接近平衡的條件, 平衡期與暴露期在相同條件下進(jìn)行。待系統(tǒng)平衡10d后, 將540只斑馬魚均勻且隨機(jī)地引入到18個(gè)水-沉積物微宇宙系統(tǒng)中, 連續(xù)暴露30d。在暴露期間, 溫度保持在(26.6±0.2)℃, pH穩(wěn)定在7.59±0.07, 并且用充氧泵持續(xù)充氣使DO含量保持在5 mg/L以上。在暴露的第15天和第30天時(shí), 各取樣1次, 每次取15條魚,冰上解剖, 以獲得斑馬魚的肝臟、腦、鰓和腸道組織, 并用濾紙吸干多余水分。將所有組織在液氮中冷凍并保存在-80℃直至分析。用來測(cè)量斑馬魚組織中的銀積累以及組織中的抗氧化酶活性, 并分析斑馬魚的腸道微生物群落。

1.4 銀濃度的測(cè)定

水樣: 于15d和30d時(shí)在各個(gè)微宇宙系統(tǒng)中采集14 mL水樣, 其中4 mL水樣用來測(cè)水中可溶性Ag的含量[12]。簡(jiǎn)言之, 將4 mL水在超濾管(Millipore Amicon Ultra-4 3 Kda)中以7500 r/min離心30min,然后用電子級(jí)硝酸消化, 并在加熱板上130℃加熱趕酸, 冷卻后, 超純水定容使硝酸終濃度為2%, 通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS, NexION 300X, PekinElmer, USA)測(cè)定消化液中Ag的濃度。另外10 mL水樣按照Cambier等[31]描述的方法分析水中的總Ag含量, 消化及測(cè)定方法與可溶性Ag相同。

沉積物樣品: 用注射器在各個(gè)體系中采集約10 g沉積物樣品, 冷凍干燥并研磨, 過100目篩后保存于-20℃下待測(cè)。沉積物中Ag濃度測(cè)定參照Cong等[32]的方法進(jìn)行, 即稱取0.1 g待測(cè)沉積物于聚四氟乙烯管中, 加入電子級(jí)硝酸, 微波消解后轉(zhuǎn)移到電熱板130℃加熱趕酸, 冷卻后, 超純水定容使硝酸終濃度為2%, 然后用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS,NexION300X, PekinElmer, USA)測(cè)定消化液中Ag的濃度。

組織樣品: 斑馬魚組織(肝臟, 腦, 鰓和腸道)中的Ag積累根據(jù)Brittle等[33]的方法測(cè)量。即稱取一定質(zhì)量的組織樣品, 分別加入到玻璃燒杯中消解。消解過程分為三步, 第一步為冷消解, 加入5 mL電子級(jí)硝酸, 在室溫條件下放置15min; 第二步為熱消解, 將燒杯放置在180℃的加熱板上消解, 直至所有的固體物質(zhì)都溶解完全; 第三步, 將消解溫度降至80℃, 直至消解液體積<200 μL時(shí)停止消解, 冷卻后加水定容使溶液中硝酸的終濃度為2%, 然后通過ICP-MS測(cè)定消解液中Ag濃度。

1.5 生物標(biāo)志物的測(cè)定

取冷凍的組織樣品, 準(zhǔn)確稱取組織樣品質(zhì)量,按重量(g)﹕體積(mL)=1﹕9的比例, 加入9倍體積的生理鹽水, 使用手持式均質(zhì)/分散機(jī)(SCILOGEX, D-160, Berlin, USA), 在冰水浴條件下將斑馬魚組織樣品(肝臟, 腦和鰓)勻漿。然后使用高速冷凍離心機(jī)將組織勻漿在4℃下以3500 r/min離心15min, 取上清液即得10%組織勻漿。盡快測(cè)定以確定酶活性和蛋白質(zhì)水平[34]。具體的測(cè)量操作和計(jì)算按照南京建成生物工程研究所(中國, 江蘇)試劑盒的說明書進(jìn)行。

1.6 腸道微生物群落組成的測(cè)定

按照TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase說明書從斑馬魚腸道樣品中提取微生物DNA, DNA濃度和純度利用NanoDrop2000進(jìn)行檢測(cè), 利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量。使用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAG GCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGT WTCTAAT-3′)通過熱循環(huán)PCR系統(tǒng)(GeneAmp 9700,ABI, USA)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4高變區(qū)。PCR反應(yīng)在含有4 μL5×FastPfu緩沖液, 2 μL 2.5 mmol/L dNTPs, 0.8 μL正向引物(5 μmol/L), 0.8 μL反向引物(5 μmol/L), 0.4 μL FastPfu聚合酶, 0.2 μL BSA和10 ng模板DNA的20 μL混合物中進(jìn)行。PCR條件如下: 在95℃變性3min, 29個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(95℃變性30s, 55℃退火30s, 72℃延伸45s), 最后72℃延伸10min, 保持10℃直到停止。

根據(jù)Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd(中國上海)的標(biāo)準(zhǔn)方案, 在Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina, San Diego, USA)上對(duì)純化的擴(kuò)增子進(jìn)行測(cè)序。使用UPARSE(版本7.1 http://drive5.com/uparse/)對(duì)操作分類單位(OTU)進(jìn)行聚類, 具有97%的相似性截止值, 并使用UCHIME識(shí)別和移除嵌合序列。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)均表示為平均值(Mean)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。使用IBM SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件(SPSS, Chicago, IL,U S A)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析?；跀?shù)據(jù)的正態(tài)性(Kolmogorov-smirnov和Levene檢驗(yàn))和單因素方差分析(ANOVA)與事后最小顯著性差異(LSD)多重比較檢驗(yàn)評(píng)估各處理組之間的差異。統(tǒng)計(jì)顯著性在0.05的置信水平下確定。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米銀的表征結(jié)果

通過分析不同區(qū)域的205個(gè)顆粒的TEM圖像獲得尺寸分布, 觀察到該溶液中納米顆粒的尺寸為正態(tài)分布, 平均粒徑為(21±0.2) nm (圖 1d)。圖 1e為X射線衍射圖, AgNPs在38.16°、44.26°、64.62°和77.48°處顯示XRD衍射峰, 對(duì)應(yīng)于(111)、(200)、(220)和(311)的晶面。這些峰與面心立方(FCC)結(jié)構(gòu)很好地吻合[35]。

2.2 沉積物中納米銀向水柱的釋放

所有處理組的水柱中總Ag濃度在15d時(shí)為(0.01±0.01)—(2.53±0.52) μg/L, 在30d時(shí)為(0.01±0.00)—(1.05±0.10) μg/L(圖 2)。15d時(shí), 除5%HA+None Ag組外, 各組的Ag濃度顯著低于30d時(shí)的濃度。在實(shí)驗(yàn)中, 從沉積物中釋放到水柱中Ag為沉積物中總銀的0.02%, 與以前的研究結(jié)果類似[10,22]。不同實(shí)驗(yàn)組中釋放的Ag量存在差異, 因此我們進(jìn)一步研究了HA對(duì)沉積物中AgNPs釋放的影響。

圖1 納米粒子的表征Fig. 1 Characterization of nanoparticles

圖2 水柱中Ag的濃度Fig. 2 Ag concentration in the water column

2.3 沉積物中腐殖酸的含量對(duì)納米銀向水柱釋放的影響

由圖 2可見, 在第15天時(shí), 沉積物HA含量為0、1%、5%和10%的AgNPs處理組中釋放的Ag濃度分別為(0.38±0.07)、(1.16±0.15)、(1.92±0.15)和(2.53±0.52) μg/L。在第30天時(shí), 沉積物HA含量為0、1%、5%和10%的AgNPs處理組中Ag濃度分別為(0.54±0.09)、(0.51±0.12)、(1.05±0.10)和(0.80±0.19) μg/L。在15d時(shí), 隨著沉積物中HA含量的增加, 水柱中Ag的濃度顯著增加。在30d時(shí), 除0HA+AgNPs組外, 其他HA處理組水柱中的Ag濃度顯著減少, 其中5%HA+AgNPs組水柱中Ag濃度顯著高于其他組?？傮w而言, HA的存在促進(jìn)了沉積物中AgNPs向水柱的釋放, 且高HA含量(5%和10%)下的促進(jìn)作用更強(qiáng)。以前的研究表明, NPs可以與環(huán)境中多種類型的有機(jī)配體相互作用, 可能使NPs形成表面涂層[36],并通過電荷和空間穩(wěn)定化減少聚集[37—40]。作為一種天然有機(jī)配體, HA與AgNPs結(jié)合減少了AgNPs聚集, 增強(qiáng)了AgNPs的遷移性。一方面, HA是一種天然的金屬絡(luò)合劑, Li等[25]提出HA的氮和羧基官能團(tuán)可以結(jié)合在AgNPs的表面層以增加AgNPs-HA的穩(wěn)定性; 另一方面, HA是一種弱酸性物質(zhì), 沉積物中pH的降低可能會(huì)導(dǎo)致Ag+的釋放。因此, HA的存在, 增強(qiáng)了AgNPs的遷移性和穩(wěn)定性, 使其更容易釋放到水柱中, 并在水柱中停留。值得注意的是,在相同的HA含量下, AgNO3處理組的Ag含量顯著低于AgNPs處理組。

AgNPs在地表水中的濃度估計(jì)值為2.2 μg/L[41,42]。美國環(huán)境保護(hù)署將淡水和海水中Ag的急性水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)定為3.2和1.9 μg/L[43,44]。此外, 已經(jīng)證明AgNPs在μg/L濃度下即可產(chǎn)生毒性作用[45]。在本研究中, 0HA + AgNPs處理組釋放的Ag為(0.38±0.07) μg/L, 10%HA + AgNPs處理組釋放的Ag達(dá)到(2.53±0.52) μg/L, 這與Ag的急性水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)濃度非常接近。

2.4 釋放到水柱中的Ag在斑馬魚組織中的積累和分布

如圖 3所示, 肝臟和腸道中的Ag積累高于鰓和腦中的Ag積累, 這與之前的一些研究相似[46,47]。斑馬魚對(duì)PVP包被的AgNPs的飲食暴露也導(dǎo)致Ag在肝臟和腸道中的顯著積累[48]。因?yàn)槟c道的表面積大, 食物的消化也發(fā)生在腸道中, 而且Ag可以吸附在食物和沉積物顆粒上, 所以Ag容易在腸道中積累[49]?；虮磉_(dá)分析顯示AgNPs通過改變編碼酶和蛋白質(zhì)基因的功能引起斑馬魚的腸道毒性[49]。Ag在腸道被吸收后, 通過血管運(yùn)輸?shù)礁闻K, 并在肝臟中積聚[50]。Cambier等[31]證實(shí)了這一結(jié)果。在沉積物HA含量相同的條件下, 暴露30d后, AgNO3處理組中斑馬魚肝臟和腦中的Ag積累顯著高于AgNPs處理組; 而腸道中的Ag積累則剛好相反。這可能是AgNPs和Ag+在不同組織中的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方式不一樣。沉積物中在AgNPs濃度相同的條件下, 暴露30d后, 10%HA+AgNPs組中斑馬魚肝臟的Ag積累顯著高于其他處理組, 表明沉積物中HA含量越高,斑馬魚肝臟中的Ag積累更多, HA促進(jìn)了AgNPs在斑馬魚體內(nèi)的積累。

在暴露15d后, 在肝臟、腦、鰓和腸道組織中檢測(cè)到最高Ag濃度分別為(0.54±0.04)、(0.03±0.01)、(0.05±0.02)和(0.97±0.01) μg/g Ag wt(wt, 濕重, 下同)。暴露30d后, 斑馬魚肝臟、腦、鰓和腸道組織中Ag的濃度分別增加到(1.24±0.04)、(0.07±0.04)、(0.04±0.02)和(1.14±0.09) μg/g Ag wt。這與其他研究結(jié)果一致[46,47,51]。在30d內(nèi), 整個(gè)斑馬魚體內(nèi)Ag的積累達(dá)到(0.54±0.04) μg/g Ag dw。例如, 在水性暴露中, 暴露于麥芽糖涂覆的AgNPs(20 nm)中21d的斑馬魚體內(nèi)Ag濃度為0.88 μg/g Ag dw[52]。當(dāng)用0.3和0.5 mg/L AgNPs暴露于河水時(shí), 斑馬魚分別積累了(1.31±0.64)和(10.7±7.50) μg/g的Ag[53]。暴露于100和10 μg/L AgNPs懸浮液的雄性斑馬魚的累積值分別為(0.16±0.08)和(0.87±0.29) μg/g Ag dw[54]。斑馬魚飲食(鹽水蝦)暴露于100 μg/L Ag 21d后體內(nèi)積累了1.39 μg/g dw的Ag[48]。我們發(fā)現(xiàn), 盡管暴露途徑不同, 但AgNPs在魚類組織中主要積累在肝臟和腸道的趨勢(shì)是一致的, 在腦和鰓組織中的積累則較少。

圖3 Ag在斑馬魚組織(肝、腦、鰓和腸)中的積累Fig. 3 Accumulation of Ag in tissues (liver, brain, gill and intestine) of zebrafish

2.5 釋放到水柱中的銀對(duì)斑馬魚組織的氧化應(yīng)激效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)中沒有發(fā)現(xiàn)由于銀暴露引起的斑馬魚死亡, 因此我們檢測(cè)了Ag是否在斑馬魚中引起氧化毒性。如圖 4所示, 在沉積物HA含量相同的條件下,暴露30d后, AgNPs處理組中斑馬魚肝臟的CAT和SOD活性顯著低于無銀組, 而AgNO3處理組則無顯著性差異。Devi等[55]報(bào)告了類似的結(jié)果, 他們觀察到斑馬魚暴露于100 μg/L PVP-AgNPs(22—26 nm)15d會(huì)降低肝臟中的CAT和SOD活性。此外, Zeng等[53]證明斑馬魚長(zhǎng)期暴露于高濃度(1.5—2 mg/L)的PVP-AgNPs可降低CAT和SOD活性。實(shí)際上,SOD是對(duì)抗活性氧(ROS)的第一道防線, 在此過程中CAT用來分解過氧化氫, 使機(jī)體免受損傷。這些酶的活性降低體現(xiàn)了氧化應(yīng)激效應(yīng)的增加[53]。因此, 斑馬魚肝臟中SOD和CAT活性的降低可能是由于AgNPs引起的氧化應(yīng)激效應(yīng)增加。在一般情況下, 生物體受到外源脅迫, 氧化應(yīng)激效應(yīng)增加。但當(dāng)氧化脅迫的程度超過機(jī)體/細(xì)胞的承受能力時(shí),其氧化應(yīng)激體系不足以產(chǎn)生足夠的反饋, 此時(shí), 氧化應(yīng)激效應(yīng)反而會(huì)降低[56]。但在本研究中, Ag處理組中斑馬魚肝臟CAT和SOD的活性顯著降低(圖 5)。這可能是由于AgNPs引起的長(zhǎng)期壓力, 氧化損傷超出細(xì)胞耐受范圍。酶活性水平的降低與氧化應(yīng)激的增加相對(duì)應(yīng), García-Sánchez等[56]觀察到類似的結(jié)果。Cao等[57]也發(fā)現(xiàn), 在大多數(shù)時(shí)間, 暴露于離子液中的斑馬魚與對(duì)照組相比, 抗氧化酶的活性顯著下降。沉積物中AgNPs濃度相同時(shí), 暴露期間, 隨著沉積物HA含量從0升高到5%, 斑馬魚肝臟中的CAT和SOD活性無顯著變化, 但當(dāng)HA含量升高到10%時(shí), 斑馬魚肝臟的CAT和SOD活性顯著降低。這表明沉積物HA含量越高, 斑馬魚肝臟受到的氧化應(yīng)激效應(yīng)更強(qiáng)。

在本研究中, 盡管肝臟中SOD和CAT的活性降低, 但它們?cè)谀X和鰓中沒有顯著變化。此外, Na+K+-ATP和Ca2+Mg2+- ATP的活性在肝臟、腦和鰓中也沒有顯著變化(圖 5)。

圖4 斑馬魚組織(肝、腦和鰓)中的酶活性(CAT和SOD)Fig. 4 Enzymatic activity (CAT and SOD) in tissues (liver, brain and gill) of zebrafish

2.6 釋放到水柱中的銀對(duì)斑馬魚腸道微生物的影響

腸道內(nèi)的微生物菌群對(duì)機(jī)體的健康起著重要作用[58]。積累在腸道中的銀會(huì)對(duì)其本身造成一定的影響, 同時(shí)也可能會(huì)對(duì)生存在其中的微生物造成影響。因此, 我們研究了沉積物中釋放到水柱中的Ag對(duì)斑馬魚腸道微生物群的影響。如圖 6所示, 放線菌和變形桿菌是主要的腸道微生物群, 其次是梭桿菌門和厚壁菌門, 還包括衣原體門和擬桿菌門。這與其他水性暴露研究中的斑馬魚腸道微生物群的物種組成大致相同[59,60]。然而, 在我們的研究中,與其他水性暴露研究相比, 沉積物的存在有利于放線菌的定植, 因此放線菌為該條件下的優(yōu)勢(shì)物種。如表 2所示, 隨著沉積物中HA含量的升高, 斑馬魚腸道微生物的ACE指數(shù)、Chao指數(shù)、Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Coverage指數(shù)均無明顯的變化。在相同的HA含量下, AgNPs處理組和AgNO3處理組與無銀組之間的微生物多樣性無顯著性差異(P>0.05), 表明AgNPs/Ag+暴露不會(huì)顯著影響腸道微生物群的多樣性和豐度。然而, Udayangani等[60]的研究發(fā)現(xiàn), 殼聚糖銀納米復(fù)合材料(CAgNCs)的膳食補(bǔ)充劑顯著降低了變形菌的豐度, 并增加了梭桿菌和擬桿菌的豐度, 這可能與這項(xiàng)研究中使用的AgNPs濃度更高有關(guān)。

圖5 斑馬魚組織(肝、腦和鰓)中Na+ K+ - ATP和Ca2+ Mg2+- ATP的活性Fig. 5 Enzymatic activity (Na+K+-ATP and Ca2+Mg2+-ATP) in tissues (liver, brain and gill) of zebrafish

圖6 門水平下斑馬魚腸道微生物組成Fig. 6 Intestinal microbiota composition of zebrafish at the phylum level

如圖 7所示, 處理組之間的群落組成沒有顯著差異, 但PCA結(jié)果顯示在HA含量相同的條件下,AgNPs處理組具有與無銀組顯著不同的結(jié)構(gòu)。這表明AgNPs能夠影響斑馬魚的腸道微生物群的結(jié)構(gòu)。在HA含量相同的情況下, 無銀組(5%HA+None Ag組)與銀處理組(5%HA+AgNPs組)具有顯著不同的群落結(jié)構(gòu)。在AgNPs含量相同的情況下,10%HA+AgNPs處理組與0HA+AgNPs處理組之間的差異最大, 表明沉積物HA含量越高, 釋放到水柱中的Ag對(duì)斑馬魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響越大。

表2 斑馬魚腸道微生物的α多樣性(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab. 2 Alpha diversity of intestinal microbiota in zebrafish (Mean±SEM, n=3)

圖7 斑馬魚腸道微生物結(jié)構(gòu)的PCA分析Fig. 7 PCA analysis of intestinal microbiota structure in zebrafish

2.7 腐殖酸對(duì)釋放到水柱中銀的毒性效應(yīng)的影響

我們的研究發(fā)現(xiàn)添加HA可促進(jìn)Ag在斑馬魚體內(nèi)的積累。在暴露30d后, 肝臟和腸道中的Ag積累分別達(dá)到(1.24±0.04) μg/g wt(10%HA+AgNPs處理組)和(1.14±0.09) μg/g wt(5%HA+AgNPs處理組)。這些結(jié)果表明具有較高HA含量的沉積物, 釋放到水柱中的Ag濃度更高, 斑馬魚組織中Ag的積累也更高。在AgNO3處理組中高HA含量下釋放到水柱中的Ag也具有相似的趨勢(shì)。

具有高HA含量的沉積物, 釋放到水柱中Ag濃度更高, 暴露其中的斑馬魚的肝臟組織中Ag積累增加, 并引起斑馬魚肝臟組織中CAT和SOD活性降低,造成斑馬魚組織氧化應(yīng)激效應(yīng)。

由圖 7可知, 沉積物HA含量越低, 處理組所包含的區(qū)域離對(duì)照組的距離越近; 沉積物HA含量越高, 處理組所包含的區(qū)域離對(duì)照組的距離越遠(yuǎn)。因此, 從沉積物釋放到水柱中的Ag影響了斑馬魚腸道微生物的群落結(jié)構(gòu)。相比于低HA含量來說, 沉積物HA含量高, 釋放到水柱中的Ag更多, 在腸道中的Ag積累也更高, 對(duì)斑馬魚腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響更大。

3 結(jié)論

沉積物中的AgNPs可以釋放到水柱中, 且沉積物中HA能夠促進(jìn)AgNPs的釋放。釋放到水柱中的Ag能夠在斑馬魚的肝臟、腦、鰓和腸道等組織中積累, 并能導(dǎo)致斑馬魚肝臟產(chǎn)生一定程度的氧化應(yīng)激反應(yīng), 還能夠改變斑馬魚的腸道微生物群落結(jié)構(gòu)。值得注意的是, HA濃度越高, 斑馬魚組織積累Ag越多, 腸道微生物結(jié)構(gòu)變化更大。這些結(jié)果意味著匯集到沉積物中的AgNPs是一個(gè)潛在污染源, 環(huán)境條件(如NOM)變化可導(dǎo)致其環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)顯著增加,應(yīng)予以重視。