水域生態(tài)學(xué)中生物穩(wěn)定同位素樣品采集、處理與保存

徐 軍 王玉玉 王 康 曾慶飛 張 敏 張 歡

(1. 中國科學(xué)院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 北京林業(yè)大學(xué)生態(tài)與自然保護學(xué)院, 北京 100083; 3. 中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所, 南京 210008; 4. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 武漢 430070; 5. 南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330031)

穩(wěn)定同位素分析是確定生態(tài)系統(tǒng)食物網(wǎng)中生物營養(yǎng)級和能量流動途徑的重要技術(shù)[1—4]。通過分析、模擬與比較生物營養(yǎng)生態(tài)位與營養(yǎng)關(guān)系的變化可以了解人為干擾如何影響能量從食物網(wǎng)底層到頂級捕食者的流動[5,6]。然而, 對營養(yǎng)生態(tài)位的長時間尺度或大空間對比的研究較為困難。一方面, 營養(yǎng)生態(tài)位研究可能來自不同研究人員、不同采樣和處理方法, 這種不一致性增加了生物樣品分析結(jié)果的不確定性, 妨礙了調(diào)查結(jié)果的比較; 另一方面, 使用已存檔的生物樣本進行營養(yǎng)生態(tài)位研究有助于研究人員獲得生態(tài)系統(tǒng)生物營養(yǎng)生態(tài)位基準特征, 對認識不同時間格局下生物在食物網(wǎng)中功能具有重要意義。然而, 由于同位素分析自身的特點, 樣本的儲存(凍干、烘干或防腐劑保存)本身可能會更改同位素特征, 進而影響對營養(yǎng)生態(tài)位的評價[7]。

就碳、氮穩(wěn)定同位素而言, 其隨營養(yǎng)級的變化通常分別0.4‰和3.4‰[3], 而已有研究報道的樣品處理與保存的同位素變異許多已經(jīng)超出了營養(yǎng)級間的變異[8,9]。此外, 許多研究也發(fā)現(xiàn)較小的同位素變異與重要的食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能改變相關(guān)聯(lián)。例如, Vander Zenden[10]發(fā)現(xiàn)外來魚類引起湖泊食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)的改變, 進而導(dǎo)致土著捕食魚類碳、氮穩(wěn)定同位素發(fā)生了1.8‰和0.6‰的變化。Perga和Gerdeaux[11]也報道了Lake Geneva在恢復(fù)其寡營養(yǎng)水平的過程中,Coregonus lavaretus(L.)的碳穩(wěn)定同位素每十年平均改變僅為1‰。這些研究均表明, 生態(tài)系統(tǒng)干擾在短時間內(nèi)不一定會導(dǎo)致在生物營養(yǎng)生態(tài)位發(fā)生巨大改變。因此, 準確認識樣品采集、處理與保存過程中影響穩(wěn)定同位素分析的可能因素,并避免這類差異, 對準確評估食物網(wǎng)中生物營養(yǎng)生態(tài)位及正確理解人類活動引起的食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能變化就有重要意義[12]。

基于上述可能由于樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的樣品穩(wěn)定同位素的變化, 本文主要目的為:(1)通過同位素質(zhì)量平衡模型的模擬, 直觀展示由于樣品采集、處理與保存引起的潛在同位素變異對評價生物營養(yǎng)生態(tài)位的影響, 并分析這種不確定性的效應(yīng); (2)綜合現(xiàn)有水域生態(tài)系統(tǒng)研究中常見類群的常用樣品采集、處理與保存的思路與技術(shù)手段,探討各種因素引起同位素變異的原因與差異; (3)確定適用性較強的樣品采集、處理與保存程序, 用于多空間尺度、長時間系列的同位素生態(tài)學(xué)比較研究的對比、校驗與修正。

1 水域生態(tài)系統(tǒng)中同位素特征與不確定性分析

1.1 影響因素的復(fù)雜性與多樣性

隨著穩(wěn)定同位素質(zhì)譜的出現(xiàn)和發(fā)展, 科學(xué)家得以精確地測量某種元素的穩(wěn)定性同位素比值在不同物質(zhì)中的含量, 并結(jié)合穩(wěn)定性同位素獨特的物理性質(zhì)和化學(xué)性質(zhì), 例如同位素質(zhì)量平衡效應(yīng)(Equilibration)以及同位素分餾效應(yīng)(Fractionation), 探討生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量流動規(guī)律[13]。在水域生態(tài)系統(tǒng)中, 影響浮游植物、底棲藻類與水生高等植物等初級生產(chǎn)者的穩(wěn)定同位素特征的因素非常多, 例如葉綠素、磷和CO2濃度、光強和水的流速、地下水的上涌、水華的爆發(fā)和洪水、無機碳源, 以及微生物碳源[14]。在光合作用過程中, 植物葉片表層周圍的CO2擴散作用也會影響植物的穩(wěn)定性同位素比率, 例如底棲藻類通常處于一種CO2限制的條件中, 所以底棲藻類區(qū)分12CO2和13CO2的能力較差。而相對于底棲藻類, 浮游藻類處于一種CO2相對充足的條件中, 所以浮游藻類可以選擇性地吸收更易于進行光合作用的12CO2。因此, 相對于浮游藻類, 底棲藻類的δ13C較高[15]。生物化學(xué)過程是影響消費者與其食物之間同位素分餾的主要因素。例如呼吸作用所產(chǎn)生的二氧化碳中13C含量相對動物自身的13C組成較低[16], 因而可用于解釋消費者相對食物碳穩(wěn)定性同位素比率增大的現(xiàn)象[16]。存在于成脂過程中丙酮酸氧化反應(yīng)中對13C的重同位素歧視作用[16]導(dǎo)致了生物體內(nèi)脂類含量相對較高的組織比脂類含量低的組織碳穩(wěn)定性同位素比率低。動物細胞內(nèi)谷氨酸和天冬氨酸之間的轉(zhuǎn)氨作用過程中,14NH2比15NH2快1.0083倍, 這導(dǎo)致了食物缺乏的情況下動物組織15N的增加[17]。與食物相比, 消費者的氮穩(wěn)定性同位素比率約增加3‰—5‰,這可能是因為消費者的排泄物中尿素和氨的氮穩(wěn)定性同位素相對較低, 從而導(dǎo)致了高營養(yǎng)級生物的氮穩(wěn)定性同位素相對較高[18]。此外生物體內(nèi)的穩(wěn)定性同位素特征還受到不同水域生態(tài)系統(tǒng)類型、寄主和宿主之間的特殊營養(yǎng)關(guān)系、生物個體或種群水平食性轉(zhuǎn)變、代謝機能、棲息地、餌料的質(zhì)量等一系列因素的影響[14,19]。

1.2 不確定性對食物來源貢獻的敏感性分析

為了舉例說明樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的穩(wěn)定同位素變化對評價生物營養(yǎng)生態(tài)位的影響,我們首先定義穩(wěn)定同位素不確定性為真值與檢測值之間的同位素差異, 即由于樣品采集、處理和保存引起的生物穩(wěn)定同位素變化(圖 1a)。這張圖反映的是消費者樣品采集的不確定性(U)與樣品真值(T)之間的穩(wěn)定同位素變異, 以及不確定性的度量與二者的關(guān)系; 在此基礎(chǔ)上, 我們進一步定義了一個基于穩(wěn)定同位素的食物網(wǎng), 包括一個消費者(T)及4個潛在食物來源(數(shù)字, 圖 1b), 其中A、B、C、D分別為定義的四種不確定性條件。通過使用基于同位素質(zhì)量平衡建立的Isosource模型[20]對該食物網(wǎng)中生物營養(yǎng)來源模擬。從圖 2可以看出, 生物的4種食物來源相對比例在真實條件和其他不同的不確定性條件下的變化。由于D這種極端情形已經(jīng)分布在食物來源的同位素范圍之外, 因此無法給出其分布頻次特征圖。

以上4個案例反映了在一個簡單食物網(wǎng)中捕食者對4種食物來源利用的特征。通過IsoSource模型的模擬和預(yù)測, 我們可以看到由于捕食者自身同位素特征的不確定性對評價食物來源幅度和方向均會產(chǎn)生一定水平的影響。這種對生物營養(yǎng)生態(tài)位的判別不確定性取決于生物穩(wěn)定同位素組成變異的幅度, 同樣也受到食物自身的穩(wěn)定同位素變異的影響。因此, 由于樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的樣品穩(wěn)定同位素的不確定性會影響對所研究的系統(tǒng)不同生物營養(yǎng)生態(tài)位的判斷。通過減小樣品采集、處理與保存所導(dǎo)致的樣品穩(wěn)定同位素的不確定性對于減小評判生物營養(yǎng)生態(tài)位的變異至關(guān)重要; 同時也有助于同位素數(shù)據(jù)的解釋和對食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)與功能的正確認識。

2 生物樣品的采集

2.1 樣品采集與保存的容器

由于穩(wěn)定同位素分析所需樣品量非常少, 樣品受到污染的風(fēng)險相對較高[21]。因此所有樣品采集裝置及樣品容器(例如Eppendorf管、錫紙和玻璃管等)都應(yīng)預(yù)先使用10%HCl浸泡30min, 用去離子水反復(fù)清洗3次, 然后干燥備用。此外, 玻璃器皿(抽濾裝置、過濾漏斗和小玻璃瓶等)應(yīng)在在馬弗爐中450℃預(yù)燒4h備用。這兩種處理方法主要用于消除無機和有機碳和氮的影響[7]。樣品容器的標簽通常包含以下信息, 如樣品編號、取樣時間、取樣地點、取樣類型、分析項目、現(xiàn)場處理方式和采樣人, 并且與采樣現(xiàn)場記錄和其他樣品記錄相對應(yīng),例如坐標、天氣、水體理化特征等。

圖1 不確定性度量及消費者與四種食物來源的營養(yǎng)關(guān)系定義Fig. 1 Measurement of uncertainty and the defined trophic system composed of one consumer and its four potential food sources

圖2 消費者四種食物來源不同情境下的分布頻次特征Fig. 2 Frequency of consumer’s four food sources in different contexts

2.2 初級生產(chǎn)者

懸浮顆粒有機物是水體中生物地球化學(xué)循環(huán)的重要組成部分, 是食物網(wǎng)底層最重要的物質(zhì)與能量提供者[22]。采集懸浮顆粒有機物樣品需使用玻璃纖維濾膜。濾膜孔徑大小根據(jù)實驗設(shè)計方案決定。因為不同來源或批次的濾膜可能包含大量且不同的碳或氮的污染, 所以采集前濾膜在馬弗爐中450℃預(yù)燒4h備用。水樣首先經(jīng)200—250 μm浮游生物網(wǎng)預(yù)過濾, 以避免懸浮顆粒有機物顆粒大小的非均質(zhì)性。預(yù)過濾水樣如果無法在采樣現(xiàn)場立即過濾, 則應(yīng)及時低溫避光運回實驗室, 并在12h內(nèi)完成過濾。水樣過濾前搖勻使用。過濾后懸浮顆粒有機物濾膜直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如不能及時干燥, 濾膜則需低溫保存(-20℃)。在懸浮顆粒有機物含量較低的情況下, 可以在濾膜烘干前或后將表面有機物剝離或刮離下來, 這樣一方面可以降低濾膜本身對樣品中碳或氮含量的稀釋作用, 同時也可以延長元素分析儀-同位素質(zhì)譜聯(lián)用儀中燃燒系統(tǒng)的使用壽命[23]。

應(yīng)在采樣地點用浮游生物網(wǎng)(根據(jù)實際需要選擇網(wǎng)孔大小)收集足夠的藻類材料。在顯微鏡下將非藻類顆粒物用毛吸管手動吸出。將剩余部分過濾到孔徑為10—30 μm的濾膜上, 然后存儲在液態(tài)氮中。在實驗室中用離心方法(1min, 10000×g)進一步將藻類與其他有機顆粒分離。將離心管上部綠色部分分離鏡檢, 再次手動移除非藻類物質(zhì), 并用去離子水沖洗, 如此反復(fù)3次。最后鏡檢記錄藻類樣品優(yōu)勢種組成[24]。浮游生物學(xué)家也設(shè)計了多種特殊的離心裝置來收集藻類細胞[25]; 同時, 還有藻類群體色素特殊化合物的同位素分析[26]以及流式細胞分離耦聯(lián)同位素分析[27]等方法。這些方法需要特殊儀器設(shè)備, 生態(tài)系統(tǒng)研究中的應(yīng)用具有一定局限性。此外, 也有學(xué)者利用光誘導(dǎo)遷移方法分離沉積物底棲藻類, 但也受到生物類型以及牧食者對藻類攝食習(xí)性等因素的限制[23,28]。藻類樣品直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如不能及時干燥, 濾膜則需低溫保存(-20℃)。

其他常見初級生產(chǎn)者包括水生維管束植物、附著藻類以及沉積物有機物等等。水生維管束植物的樣品相對較易獲得。取活體水生維管束植物的葉片或整株。將其表面附著藻刮洗后, 用去離子水反復(fù)沖洗3次。水生維管束植物樣品直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如不能及時干燥, 濾膜則需低溫保存(-20℃)。附著藻類通常采集方法為現(xiàn)場刮取或刷洗水生植物、石頭或其他非生物表面的附著物獲得。用去離子水或現(xiàn)場過濾的水樣沖洗附著藻類3次, 直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥。如生物量較低可過濾至預(yù)燒的濾膜上后進行烘干或保存[28]。沉積物有機物采集方法為現(xiàn)場用沉積物采集器獲得表層或柱狀樣品, 用500目篩網(wǎng)過篩, 去除大型底棲動物活體或殘骸, 以及大尺寸顆粒, 以便獲得均勻性較高的穩(wěn)定同位素樣品。樣品放入酸洗容器, 低溫運輸?shù)綄嶒炇? 直接烘干至恒重(60℃, 48h)或冷凍干燥[28]。

2.3 消費者

底棲動物大型底棲動物樣品通常用彼得森采泥器采集表層沉積物, 經(jīng)分樣篩原位手動分檢,鑒定生活史階段及種屬特征[29]。分離樣品量需根據(jù)物種個體大小以及儀器分析精度來確定。在樣品收集過程中應(yīng)注意水體基本特征, 包括生境特征和底棲動物生活史。以搖蚊幼蟲為例, 幼蟲期需要30—50個個體混合才能滿足一次穩(wěn)定同位素測試,混合樣品可以避免種間差異的影響; 而對于三、四齡幼蟲也可以進行個體測定, 一方面可以反映相對較長時間的攝食特征, 同時也可以觀測個體食性的差異[30]。

浮游動物浮游動物樣品的收集可以根據(jù)實際情況選擇不同孔徑大小的浮游生物網(wǎng)進行。在樣品收集后, 保持活體低溫保鮮(4℃)運輸?shù)綄嶒炇? 進行活體鏡鑒與分離。如果是為了獲取混合浮游動物樣品, 則需通過鏡鑒出去肉眼可見的非浮游動物物質(zhì), 例如碎屑。如果是為了獲得優(yōu)勢種類樣品, 則可以通過微毛細管, 在解剖鏡或顯微鏡下挑取分離。由于個體大小的差異, 分析所需單個測試樣品可能有數(shù)十個到幾百個組成。分離純化后的浮游動物樣品放置在盛有去離子水的器皿中, 等待進一步處理[31]。分離樣品3—5份待測, 樣品的浮游動物種類、大小等信息同步記錄[32]。

魚類就魚類樣品而言, 由于魚類個體的不同組織間同位素特征值有所不同, 因此選擇何種組織進行分析將會影響對營養(yǎng)關(guān)系的解釋。通常取魚類背部白色肌肉來指示個體穩(wěn)定同位素特征。如果魚類個體較小, 則取魚類整體(去除腸含物或內(nèi)臟)作為同位素分析對象。在許多情況下, 由于不能傷害魚類(如受保護魚類), 則采集魚類其他組織, 例如鰭條、血液、體表黏液和鱗片等等。由于不同組織的同位素周轉(zhuǎn)特征差異顯著, 可導(dǎo)致其同位素與個體同位素產(chǎn)生差異, 從而影響對數(shù)據(jù)的解釋。例如黏液穩(wěn)定同位素周轉(zhuǎn)要遠遠快于其肌肉[33]。那么這些同位素周轉(zhuǎn)快的組織(如胰腺、血液、體表黏液等)通?？梢杂脕碇甘旧锝?數(shù)天至數(shù)周)的營養(yǎng)生態(tài)位; 而同位素周轉(zhuǎn)慢的組織(如肌肉和鱗片等)其同位素特征可以指示中長期(數(shù)月至數(shù)年)的營養(yǎng)生態(tài)位[34]。需要注意的一點就是, 不同組織同位素特征的差異一方面是由于同位素周轉(zhuǎn)周期不同引起的, 另外一種因素就是不同組織脂類含量變化引起的。在同一個體的某一組織中, 脂類通常比蛋白質(zhì)和碳水化合物等物質(zhì)的碳穩(wěn)定同位素偏低。因此, 在同位素分析前對不同組織或器官進行去脂處理(參見去脂部分)[35]。

3 生物樣品的處理

3.1 腸道排空

腸含物對小個體生物穩(wěn)定同位素可能存在一定影響。通常在生產(chǎn)力較高的水體這種影響相對較高。因此, 浮游動物與底棲動物經(jīng)分離后需要在去離子水中暫養(yǎng)。暫養(yǎng)時間視個體大小而定。通常浮游動物需要4h以上, 而底棲動物需要12h以上。暫養(yǎng)結(jié)束后可通過顯微鏡鏡鑒確定是否完全排空[36,37]。本過程也適用于其他以個體為分析對象的小型生物。在暫養(yǎng)過程中, 需及時移除水體中的糞便, 以避免某些生物的自食糞便的特點。

3.2 酸化

由于有機樣品采集過程中易受到碳酸鹽的潛在影響而改變樣品的穩(wěn)定同位素特征[38]。因此需要對易受此類影響的樣品, 包括沉積物有機物、懸浮顆粒有機物、有機碎屑和大型水生植物等, 進行酸化處理。由于酸化處理會在某種程度上改變氮同位素的含量[39], 因此建議酸化樣品前將樣品分為兩個部分, 一部分酸化后用于碳穩(wěn)定同位素的分析,另一部分不酸化用于其他同位素分析[38]。酸化采用1 mol/L HCl, 過量加入樣品后直至反應(yīng)結(jié)束氣泡消失, 用去離子水沖洗3次后待用[40]。

3.3 去脂

生物組織中脂類δ13C值相對于其他生物化學(xué)物質(zhì)較低, 其原因為在脂類合成過程中丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A時存在重同位素歧視效應(yīng)[16]。此外, 動物脂肪蓄積反映了生活史不同時期的能力需求, 受到生境、大小和生長時期的多種因素影響。因此組織中脂類含量可以影響樣品δ13C, 并可能導(dǎo)致對生物營養(yǎng)生態(tài)位的錯誤解釋。因此, 在分析樣品同位素之前在分析之前對樣品進行脂類提取, 主要方法有chloroform-methanol[41]和hexane-isopropanol[42]。通常, 當樣品C:N>4時, 可參考使用脂類含量的校正公式[43—46]。通過比較脂類提取前后的白色肌肉組織的同位素比率, 研究人員發(fā)現(xiàn)由于白色肌肉組織脂類含量較低所以同位素變化無顯著差異[45]。但是脂類含量受到多種因素影響, 因此特定研究仍需要確定特定物種各生活時期的修正系數(shù), 以保證分析和解釋的準確性[12]。

4 生物樣品的保存

樣品從采集、處理到檢測之前的需要經(jīng)過保存過程, 才可以在實驗室進行分析。此外, 博物館與各類科研機構(gòu)標本館中也保存了大量的樣品。因此, 如果上述各類過程中保存技術(shù)會改變的樣品同位素特征, 那么也會導(dǎo)致隨后對生物營養(yǎng)生態(tài)位的誤判, 以及影響對食物網(wǎng)歷史變化特征的重建[8]。

4.1 冷凍與烘干

在樣品采集、處理與運輸?shù)倪^程中冷凍、冷凍干燥和烘干保存是現(xiàn)階段最理想的方法[21]。盡管絕大多數(shù)報道均認為冷凍或凍干不影響樣品的同位素組成[8,48—50], 也有報道表明冷凍在短期內(nèi)不影響同位素特征, 長時間保存也會影響同位素特征, 特別是對于無脊椎動物的保存(例如浮游動物)[8,35]。其原因推測為在解凍處理過程中, 樣品細胞破裂導(dǎo)致部分同位素流失所引起的[35]。在過去的20年間, 樣品保存使用最多的方法就是低溫烘干的方法。通常采用60℃烘箱24—48h。這取決于樣品的大小與含水量, 其原則為烘干至恒重。近期研究表明魚類肌肉樣品烘干長期保存對穩(wěn)定同位素組成沒有任何影響, 因此烘干可以作為首選的保存方法[51]。但是烘干對無脊椎動物的保存效果, 仍需進一步研究確定。我們建議使用60℃對樣品進行烘干, 以保證烘干的穩(wěn)定性和結(jié)果的可比性[51,52]。

4.2 乙醇與福爾馬林

許多研究表明乙醇和福爾馬林保存會顯著影響樣品的穩(wěn)定同位素含量。主要可能的因素為乙醇和福爾馬林自身的碳可能會污染樣品本身從而影響他們的δ13C值, 加上乙醇和福爾馬林作為一種溶劑會溶解出樣品自身的一些有機物質(zhì), 例如脂類或蛋白質(zhì)[45,51]。因此, 這兩種保存方法并不適合用于穩(wěn)定同位素樣品的保存[8,47,53]。同時, 福爾馬林對人體有危害作用, 乙醇由于易燃不適和長途攜帶。但是由于博物館或標本館中用此類方法保存了大量的生物樣本[45], 而實際上這兩種保存方法在一定時間后相對穩(wěn)定[8,48,51,54], 因此在分析此類長期保存的樣本之前, 必須了解樣本的保存方法、時間、樣品類型, 進而開展保存實驗, 一起獲得合理的校正因子[8,48,51,54]。

4.3 腌漬

在許多偏遠地區(qū)采樣過程中, 由于供電無法保證, 所以冷凍或烘干保存收到一定限制, 因此腌漬這種保存方法就顯得十分必要了。通常使用飽和氯化鈉水溶液保存樣品[8]。研究表明飽和氯化鈉水溶液保存對魚類肌肉穩(wěn)定同位素含量沒有顯著影響[54]。但直接用氯化鈉腌制則存在影響生物組織穩(wěn)定同位素的可能[8,54]。因此, 在使用此類方法是需要判斷樣品的類型對此類保存方法的響應(yīng)[49,54]。

4.4 進樣前處理

進行樣品同位素分析前, 第一, 對樣品中的結(jié)締組織進行清理; 第二, 所有化學(xué)方法保存的樣品,均需用去離子水漂洗3次; 第三, 樣品研磨成均勻粉末, 避免研磨過程中的交叉污染; 第四, 樣品裝載到錫杯過程中, 對應(yīng)編號并記錄裝載量[8]。

5 總體建議

在運用穩(wěn)定同位素技術(shù)研究水域生態(tài)系統(tǒng)時,首先要制訂科學(xué)的采樣計劃(圖 3)。根據(jù)采樣計劃對收集樣品的工具進行處理(酸化或預(yù)燒, 消除收集樣品工具可能帶來的誤差)。使用處理后的工具收集相關(guān)樣品, 對于采集到的初級生產(chǎn)者, 需要根據(jù)大小和種類進行分類, 然后進行鏡檢、純化和均一化, 初級生產(chǎn)者樣品在測定碳同位素時需要對容易產(chǎn)生誤差的樣品進行酸化處理(如濾膜樣品、表層沉積物樣品等); 對于采集到的浮游動物和底棲動物樣品, 需要根據(jù)種類、生活史和大小進行分類,然后進行鏡檢、純化和均一化, 接下來是排除腸含物;對于采集到的魚類樣品, 經(jīng)過鑒定和組織分離后,對于需要去脂的樣品進行去脂處理。對于需要保存的樣品, 直接采集的樣品可以首先經(jīng)過60℃烘干或冷凍干燥, 然后保存在有干燥器的容器中待測;也可以在-20℃冷凍保存至樣品處理。博物館等化學(xué)保存的樣品, 需要設(shè)計相關(guān)方法學(xué)實驗計算出相關(guān)的校正系數(shù), 以便于得出準確的結(jié)果。樣品進入質(zhì)譜前, 需要將樣品60℃烘干至恒重, 然后在經(jīng)過酸化或者預(yù)燒過的工具中對樣品進行研磨, 等待測試; 在這個過程中, 必須盡量防止對樣品的污染(包括樣品間的交叉污染)。

圖3 建議在穩(wěn)定同位素生態(tài)學(xué)中對水生生物樣品收集、處理和保存的步驟圖Fig. 3 Diagram of the logical steps suggested for sample collection, handling and preservation of aquatic organisms in stable isotope ecology

5.1 關(guān)于樣品采集的總體建議

(1)所有樣品采集裝置及樣品容器使用前必須進行酸洗或高溫預(yù)燒;

(2)初級生產(chǎn)者樣品采集需依據(jù)研究目的進行分類、清洗和鑒定, 并確保均一性;

(3)小個體消費者樣品采集需依據(jù)研究目的進行分類、清洗和鑒定, 并確保均一性; 大個體消費者采集需區(qū)分樣品的生活史以及組織器官。

5.2 關(guān)于樣品處理的總體建議

(1)腸含物對小個體生物穩(wěn)定同位素可能存在一定影響, 因此采集后的小個體樣品需進行腸道排空處理。

(2)由于有機樣品采集過程中易受到碳酸鹽的潛在影響, 因此需要對易受此類影響的樣品, 包括沉積物有機物、懸浮顆粒有機物、有機碎屑和大型水生植物等, 進行酸化處理。

(3)生物組織中脂類δ13C值相對于其他生物化學(xué)物質(zhì)較低, 因此, 在分析樣品同位素之前在分析之前對樣品進行脂類提取。

5.3 關(guān)于樣品保存的總體建議

(1)在樣品采集和處理與運輸?shù)倪^程中冷凍、冷凍干燥和烘干保存是現(xiàn)階段最理想的方法;

(2)對于已經(jīng)用化學(xué)方法保存的樣品, 應(yīng)進行保存方法的預(yù)試驗研究, 確定同位素變異的大小; 對于穩(wěn)定變異的保存, 可以通過預(yù)試驗獲得短期或長期保存的校正系數(shù)。

致謝:

感謝華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院與湖北大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院部分實習(xí)學(xué)生幫助本文中部分資料的收集與整理。