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    細菌瓶法用于產(chǎn)甲烷菌菌量的測定*

    2020-10-15 06:42:14易紹金邱思語
    油田化學(xué) 2020年3期
    關(guān)鍵詞:培養(yǎng)箱法測定培養(yǎng)液

    易紹金,邱思語,余 燦,2

    (1.長江大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院,湖北荊州 434023;2.中石化江漢石油工程設(shè)計有限公司,湖北武漢 430200)

    產(chǎn)甲烷菌(methane-producing bacteria,簡稱MPB)是一類能夠?qū)o機或有機化合物厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化成甲烷等的古細菌[1-3]。它是微生物采油功能菌之一[4-8],也被應(yīng)用于污泥厭氧消化過程中[9-10],是廢水生物處理的重要菌群[11-12],同樣也是沼氣發(fā)酵的主要菌群[13-16]。因此,在微生物采油(microbial enhanced oil recovery,簡稱MEOR)尤其是本源微生物采油研究和應(yīng)用、廢水厭氧生物處理及沼氣發(fā)酵領(lǐng)域等工作過程中常常需要測定MPB 的菌量。目前主要采用Hungate 滾管培養(yǎng)法測定MPB 菌量,采用該法測試需要嚴(yán)格的厭氧無菌環(huán)境和特殊的實驗裝置——滾管機,但滾管機操作繁瑣、費時、效率低下,而且計數(shù)采用活菌計數(shù)法存在計數(shù)不準(zhǔn)、讀數(shù)不精確的明顯缺陷。目前的MPB 菌量測定的工作效率極低,需要一定的操作技術(shù)和操作條件,不能滿足現(xiàn)代高效工作的需要,因此,需要研制一種快速方便且準(zhǔn)確的MPB菌量的新方法、新工具。

    1989年,孫炳德[17]使用細菌瓶法測定了硫酸鹽還原菌(SRB)的菌量,認為細菌瓶法是一種高效、準(zhǔn)確的測定菌量的一種方法。隨后易紹金[18-20]將細菌瓶法應(yīng)用于測定石油烴降解菌、產(chǎn)表面活性劑菌、黃原膠降解菌等細菌的菌量,擴大了細菌瓶法測定細菌的種類和范圍。國內(nèi)早已采用了既簡便又準(zhǔn)確的細菌測試瓶法,如北京華興化學(xué)試劑廠生產(chǎn)的SRB 細菌測試瓶,細菌瓶內(nèi)裝有SRB 專用培養(yǎng)基,但只能用于測定SRB 而不能用于測定MPB。由于MPB 測定需要嚴(yán)格的厭氧環(huán)境,且滾管機不易攜帶,Hungate滾管培養(yǎng)法不適用于現(xiàn)場測定,改進方法大多數(shù)以滾管機為基礎(chǔ),測定條件苛刻,目前仍沒有一種較好的測定MPB 菌量的方法。為了更加方便且易于測定MPB的菌量,本文根據(jù)細菌瓶法的基本原理,研制了用于培養(yǎng)MPB的專用測試瓶,內(nèi)含有MPB的專用培養(yǎng)基,并進行了許多樣品的實際測試。

    1 實驗部分

    1.1 儀器

    STARTER3100 型pH 計,奧豪斯儀器設(shè)備有限公司;SPX-300BS-Ⅱ型生化培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;YM 型不銹鋼立式電熱蒸汽消毒器,上海三申醫(yī)療器械有限公司;YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱,上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;R05型厭氧培養(yǎng)滾管機,北京豐美儀器公司;螺口厭氧培養(yǎng)管,1.0 mL一次性無菌注射器,山東威高集團高分子制品股份有限公司。

    1.2 MPB測試瓶的制備

    (1)MPB培養(yǎng)液的配制。通過比較不同配方培養(yǎng)液培養(yǎng)MPB 的生長速度優(yōu)選培養(yǎng)液配方,反復(fù)篩選得到了以低分子有機酸鹽[21,22]為碳源,含有銨鹽、磷源和化學(xué)脫氧劑等組分的專門用于培養(yǎng)MPB 的培養(yǎng)液配方及其合適的pH 值。該培養(yǎng)基的配方是按照MPB 的生理生化特性所設(shè)計,所培養(yǎng)的細菌只是在厭氧條件下將低分子有機酸裂解為甲烷等的MPB[21-22],測試工作不會受其它細菌的干擾。

    (2)生長指示。為了及時準(zhǔn)確地反映培養(yǎng)液中有無MPB 的生長,必須確定易于觀察的生長指示,要求生長指示特異性強,易于判斷。根據(jù)MPB代謝特點和代謝產(chǎn)物確定其生長指示。MPB 的正常生命代謝會讓培養(yǎng)液變渾濁,在厭氧條件下會將低分子有機酸裂解為甲烷等,即培養(yǎng)液變渾濁并且有氣泡即為MPB的生長指示[23]。

    (3)測試瓶制備與滅菌。將配制好的培養(yǎng)液在厭氧培養(yǎng)箱中分裝入標(biāo)準(zhǔn)玻璃瓶(15 mL)中,每瓶裝9.0 mL 培養(yǎng)液,然后進行橡膠蓋和鋁蓋封口,再按常規(guī)滅菌,即成為MPB測試瓶。

    1.3 測試方法

    具體測定方法按細菌瓶常規(guī)測定方法進行[18-20]。把接種后的測試瓶放在30℃或現(xiàn)場溫度±5℃[24]培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),無MPB存在的測試瓶內(nèi)培養(yǎng)液無明顯變化,而有MPB存在的測試瓶內(nèi)培養(yǎng)液會逐漸變渾變濁并出現(xiàn)肉眼可見的氣泡,一般此過程為14 d,因此確定14 d讀數(shù)。

    1.4 計數(shù)

    MPB 菌量的測定一般采用二次平行管測定方法[24],可根據(jù)表1 進行計數(shù)。實際樣品測定時需乘以稀釋倍數(shù)。

    表1 二次平行管的細菌最大可能值

    2 結(jié)果與討論

    為了驗證細菌瓶法測定MPB 的準(zhǔn)確性和可靠性,采用了工業(yè)化生產(chǎn)的MPB測試瓶測定某油田采出液、某微生物采油菌劑、某污水處理廠厭氧消化池等樣品中的MPB 菌量,并與Hungate 滾管培養(yǎng)法測定結(jié)果進行對比,選擇具有代表性的3 個測定結(jié)果分別列于表2、表3和表4。

    表2 某油田采出液中MPB測定結(jié)果(二次平行)

    表3 某微生物采油菌劑中MPB測定結(jié)果(二次平行)

    表4 污水處理廠厭氧消化池中MPB測定結(jié)果(二次平行)

    由表2數(shù)4 可見,細菌瓶法的測定結(jié)果與Hungate 滾管培養(yǎng)法基本相同,表明其測試結(jié)果是準(zhǔn)確可靠的。在表4中,可能是Hungate滾管培養(yǎng)法在除氧階段混入了少量的氧氣,沒有形成完全厭氧的環(huán)境,導(dǎo)致Hungate 滾管培養(yǎng)法測定MPB 數(shù)量少于細菌瓶法,更能證明細菌瓶法的測試結(jié)果是可靠的。

    3 結(jié)論

    細菌瓶法可準(zhǔn)確測定樣品中的MPB的菌量,可用于微生物采油(MEOR)研究尤其是依靠本源微生物提高原油采收率、廢水厭氧生物處理及沼氣發(fā)酵等領(lǐng)域。與傳統(tǒng)的Hungate 滾管培養(yǎng)法相比,細菌瓶法測定MPB數(shù)量具有生長指示明顯,操作極為簡單,可大大提高工作效率等優(yōu)點,值得推廣應(yīng)用。

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