fruitless在桔小實蠅求偶和交配行為中的作用

陳瑤瑤, 古 楓, 鐘國華,*, 易 欣,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南作物有害生物綜合治理重點實驗室, 廣州 510642;2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 天然農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點實驗室, 廣州 510642)

求偶是指交配前雌雄一方為了獲得配偶而盡力展現(xiàn)及動作而使另一方做出選擇的整個過程(Koganezawaetal., 2016)。而與多數(shù)昆蟲一樣，實蠅也是一類具有求偶行為的昆蟲，實蠅通過聚集形成求偶場，且雄成蟲間相互競爭以吸引雌成蟲；接著雌成蟲選擇具有最佳求偶行為的雄成蟲并與之進行交配(de Aquino and Joachim-Bravo, 2014; Ekanayakeetal., 2017)。在實蠅中，求偶行為通常被劃分為幾個關(guān)鍵階段：(1)雄成蟲保衛(wèi)其求偶場避免其他雄成蟲侵入，并通過嗅覺、視覺和聽覺以吸引雌成蟲；(2)雄成蟲附近的單個雌成蟲降落求偶場并爬向雄成蟲；(3)雄成蟲感受到雌成蟲并進行一次或多次交配的嘗試(Robinson and Hooper, 1989)。因此，在昆蟲的求偶過程中，雌性和雄性昆蟲具有不同的行為表現(xiàn)，被稱為性別二態(tài)現(xiàn)象(Greenspan and Ferveur, 2000)。這些行為信息受到一系列性別相關(guān)基因調(diào)控，并表現(xiàn)為受性別二態(tài)型神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控。

在眾多可以調(diào)控交配行為的基因中，fruitless(fru)基因是其中最特殊的一個。fru突變會造成果蠅求偶歌與求偶行為的異常，甚至直接影響交配，導(dǎo)致其不育(Leeetal., 2001; Rideoutetal., 2007)。更有趣的是，fru突變會使得雄性果蠅喪失辨別兩性的能力，直接導(dǎo)致的行為便是fru突變的雄成蟲聚集在一起形成雄-雄交配鏈，產(chǎn)生激烈的雄-雄交配行為(Ryneretal., 1996)。研究證明，在果蠅中，fru基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其中一種可變剪接異構(gòu)體在雄性性別調(diào)控通路中起決定雄性求偶行為的作用(Yamamoto, 2008)。近年來分子生物學(xué)的發(fā)展使人們對求偶交配行為的調(diào)控有了更深層次的了解，特別是針對模式昆蟲果蠅和家蠶的研究為我們了解昆蟲求偶交配行為的內(nèi)在機制提供了豐富的數(shù)據(jù)信息。但昆蟲求偶交配行為機制豐富多樣，不同昆蟲通過不同基因調(diào)控求偶和交配行為。桔小實蠅Bactroceradorsalis作為一種對果蔬具有毀滅性影響的重要農(nóng)業(yè)害蟲，fru對其求偶交配行為的調(diào)控機制尚不明確。

桔小實蠅作為雙翅目中重要的經(jīng)濟害蟲，對其的研究可為雙翅目昆蟲以及其他農(nóng)業(yè)昆蟲提供重要的參考價值和豐富的數(shù)據(jù)信息。本研究對NCBI數(shù)據(jù)進行分析查找，對篩選注釋為fru的基因進行克隆驗證和鑒定，并對序列蛋白結(jié)構(gòu)域等特征進行分析，最后采用RNAi技術(shù)探究該基因是否對桔小實蠅的求偶交配行為發(fā)揮作用，從而進一步了解該基因的功能以及桔小實蠅的求偶交配行為。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

本研究所用桔小實蠅在大小為30 cm×30 cm×30 cm的尼龍紗網(wǎng)養(yǎng)蟲籠飼養(yǎng)于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)，并建立室內(nèi)種群。成蟲飼養(yǎng)溫度27±0.5℃，光照強度60%，相對濕度70%±5%，光周期14L∶10D。成蟲飼料配方為蔗糖∶酵母=3∶1(m/m)，蔗糖用粉碎機打成粉末稱重，加入相應(yīng)比例的酵母粉，充分混勻。配制好后放于室溫備用，并保證飼料不超過30 d。

用新鮮橙汁倒入布滿孔的70 mL離心管中，并將其放入羽化20 d成蟲養(yǎng)蟲籠中，誘集成蟲產(chǎn)卵。8 h后將離心管取出，通過紗布用清水將卵沖洗干凈后置入放有飼料的幼蟲養(yǎng)蟲盒中，并置于人工氣候培養(yǎng)箱。幼蟲飼料配方：香蕉1 500 g、鮮玉米1 500 g、酵母粉150 g、蔗糖150 g、纖維素150 g、苯甲酸鈉6 g、鹽酸12 mL、蒸餾水1 250 mL，充分混勻，放入4℃冰箱備用，保證飼料不超過30 d。在羽化3 d內(nèi)，將雌雄分開飼養(yǎng)，于羽化9 d后進行后續(xù)實驗。

1.2 桔小實蠅頭部RNA的提取和cDNA第1鏈的合成

摘取桔小實蠅羽化10 d已交配的成蟲頭部，用液氮將桔小實蠅頭部組織速凍，后用自動研磨儀將組織磨碎，并使用Trizol Reagent(TaKaRa)提取組織RNA，于30 μL的無核酸酶水溶解。提取后用1.2%的瓊脂糖凝膠檢測RNA的質(zhì)量，并于Spectrophotometer(Thermo Nano DropTM2000c; Santa Clara, 美國)測定RNA的純度及濃度。根據(jù)TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime Script RT Reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA第1鏈，并按照說明書去除基因組DNA。將合成好的cDNA于-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 桔小實蠅fru基因的cDNA克隆

NCBI上獲得桔小實蠅fru基因cDNA全長序列(GenBank登錄號: LOC105224493)，并采用Primer Premier 5.0設(shè)計兩端引物Q-Fru-F和Q-Fru-R(表1)，以桔小實蠅頭部cDNA為模板進行PCR擴增。PCR擴增體系(50 μL): Buffer 5 μL, dNTPs 5 μL, Mg2+3 μL, KOD酶1 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1.5 μL, cDNA模板1 μL, ddH2O 32 μL。PCR反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性3 min; 98℃ 10 s, 55℃ 30 s, 68℃ 1.45 min, 35個循環(huán)；12℃保存。PCR產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離并進行膠回收，將回收得到的DNA片段克隆到pMD19-T Vector載體上：DNA片段7 μL, pMD19-T Vector載體 0.3 μL, Solution I 3 μL, 4℃過夜。將混合體系轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，加1 mL LB培養(yǎng)基放置搖床37℃ 180 r/min培養(yǎng)1 h，于超凈工作臺中取100 μL菌液涂布在含有Ampicilin/X-gal/IPTG的LB固體培養(yǎng)基上，在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12～16 h。藍白斑篩選后挑取陽性單克隆在1 mL LB液體培養(yǎng)基(含Ampicilin)中培養(yǎng)12～16 h，將培養(yǎng)得到的菌液送往廣州擎科生物技術(shù)有限公司進行DNA測序。用Megalign軟件將測序成功的片段拼接獲得桔小實蠅fru基因全長cDNA，將得到的全長序列與NCBI官網(wǎng)上的預(yù)測序列進行比對驗證。

表1 本研究中所用引物序列

1.4 桔小實蠅fru基因序列分析

將克隆獲得的fru基因所編碼的氨基酸序列在SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)蛋白預(yù)測網(wǎng)站上，預(yù)測桔小實蠅FRU蛋白的分子量和等電點。在NCBI官網(wǎng)上獲得黑腹果蠅Drosophilamelanogaster、岡比亞按蚊Anophelesgambiae的fru編碼的氨基酸序列，同時在SilkDB 數(shù)據(jù)庫中獲得家蠶Bombyxmorifru編碼的氨基酸序列，將其放在SMART蛋白預(yù)測網(wǎng)站上，預(yù)測蛋白的結(jié)構(gòu)。并用軟件DNAMAN進行比對，分析fru基因在進化上是否具有保守性。黑腹果蠅D.melanogaster、岡比亞按蚊A.gambiae、家蠶B.morifru基因的GenBank登錄號分別為NM_00127783, AY785361和BGIBMGA006492-TA。

1.5 熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測

根據(jù)桔小實蠅fru序列，用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計引物。其中內(nèi)參為Tublin和EF1a，RT-qPCR所用引物序列見表1。

RT-qPCR反應(yīng)體系(10 μL): SYBB Green Supermix 5 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL, ddH2O 3.5 μL, cDNA 0.5 μL。反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性3 min; 95℃變性10 s, 58℃退火10 s, 72℃延伸30 s, 40個循環(huán)；溶解程序: 95℃ 10 s; 65℃ 5 s; 95℃ 5 s。每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)，按照上述體系進行實驗。

1.6 dsRNA的合成及注射

RNAi基因片段的T克?。河肞rimer Premier 5.0設(shè)計合適桔小實蠅fru基因dsRNA特異性片段PCR擴增的特異性引物，其具體引物見表1。用帶T7啟動子的引物進行交叉PCR擴增，將帶有T7啟動子的PCR原液按照1.3節(jié)的方法進行T克隆，將測序正確的陽性菌液取50 μL在10 mL LB液體培養(yǎng)基(加Ampicilin)于37℃ 180 r/min搖床上培養(yǎng)12～16 h，將培養(yǎng)好的菌液按照質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，放于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

dsRNA的合成：對抽提的重組質(zhì)粒用EcoRI(TaKaRa)進行酶切，獲得線性化質(zhì)粒。以線性化質(zhì)粒為模板，采用T7 RiboMAXTMExpress RNAi System Protocol試劑盒體外合成增強綠色熒光蛋白GFP基因和桔小實蠅fru的dsRNA。合成結(jié)束將其稀釋10倍用1.2%的瓊脂糖電泳分析合成的dsRNA的質(zhì)量，后用Spectrophotometer測定dsRNA的濃度及純度，并置于-80℃超低溫冰箱備用。

顯微注射dsRNA：取出保存的dsRNA，重新確定濃度，并顯微注射儀將其注射到羽化9 d的桔小實蠅雄成蟲腹部(本實驗室前期研究表明在羽化9 d時，桔小實蠅求偶交配頻率達到最大值)，注射量為1 μg/頭(dsGFP和dsfru)，每個處理共注射100頭雄成蟲。在注射后48和72 h取樣，于體視鏡下摘取桔小實蠅雄成蟲頭部，采用RT-qPCR檢測干擾效率。將樣品用液氮速凍后于-80℃超低溫冰箱備用。

交配行為測定方法：在注射后72 h,將干擾的雄成蟲與未干擾的雌成蟲置入直徑8 cm、高20 cm并放有水盒和飼料的圓柱盒子中進行配對，然后仔細(xì)觀察2 h內(nèi)雌雄求偶交配行為并統(tǒng)計交配頻率和交配持續(xù)時間。

1.7 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR實驗每個處理設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，且每個樣品設(shè)置3個技術(shù)重復(fù)；依據(jù)RT-qPCR檢測結(jié)果應(yīng)用2-△△CT法計算基因相對表達量。行為學(xué)實驗每個處理設(shè)置10個生物學(xué)重復(fù)(圓柱盒子)，每個生物學(xué)重復(fù)含10個雌雄試蟲配對。實驗結(jié)果用Excel表統(tǒng)計，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)及Bonferroni事后檢驗進行差異顯著性分析，并用GraphPad Prism 5.0作圖。

2 結(jié)果

2.1 桔小實蠅fru的全長克隆

依據(jù)數(shù)據(jù)庫NCBI中的fru序列信息，克隆獲得桔小實蠅的fru全長序列，經(jīng)比對測序結(jié)果與NCBI官網(wǎng)上的預(yù)測序列相一致。序列全長為2 865 bp，編碼954個氨基酸。將該基因所編碼的氨基酸序列在SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)蛋白預(yù)測網(wǎng)站上，預(yù)測了桔小實蠅FRU蛋白的分子量、等電點和特殊結(jié)構(gòu)域：即桔小實蠅FRU蛋白序列中含有一個BTB(Broad-complex, Tramtrack and Bric-a-bric)結(jié)構(gòu)域和兩個鋅指(zinc finger)結(jié)構(gòu)域(圖1)。其中FRU蛋白的等電點為6.01，蛋白分子量大小為104.1 kD。

根據(jù)蛋白預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，黑腹果蠅D.melanogaster、岡比亞按蚊A.gambiae、家蠶B.mori的FRU蛋白序列在N端亦存在BTB結(jié)構(gòu)域和C端是兩個鋅指結(jié)構(gòu)域。經(jīng)過序列對比發(fā)現(xiàn)，它們的N端非常保守，同源性為87.76%(圖1: A)。然而在兩個鋅指結(jié)構(gòu)域中，桔小實蠅和岡比亞按蚊的同源性較高，黑腹果蠅與家蠶的同源性較高(圖1: B和C)。因此，fru基因非常保守，BTB結(jié)構(gòu)域和鋅指結(jié)構(gòu)域是該基因的特點。

圖1 昆蟲物種間FRU功能域的序列比對

2.2 fru基因在桔小實蠅成蟲不同組織中的表達情況

嗅覺、味覺在求偶性信息素識別的過程中至關(guān)重要，而主要行使嗅覺功能的是觸角、下顎須等組織。在本研究中，我們解剖羽化后9 d的雄成蟲腦、下顎須和觸角等感官組織，采用RT-qPCR檢測這些組織中fru基因的表達量。結(jié)果表明：桔小實蠅中的fru基因在成蟲觸角、下顎須和腦中均有表達。這些感官組織分布在頭部，因此在本研究中我們選取頭部作為主要檢測對象(圖2)。

圖2 fru基因在桔小實蠅9日齡雄成蟲不同組織中的表達譜

2.3 fru在桔小實蠅雄成蟲不同交配狀態(tài)下的表達差異檢測

RT-qPCR檢測在桔小實蠅雄成蟲交配前和交配后4 h之內(nèi)fru基因的表達量差異，結(jié)果表明，相較于未交配雄成蟲，fru在桔小實蠅雄成蟲頭部中的表達量在與雌成蟲交配后顯著上升(P<0.001)(圖3)。

圖3 fru基因在不同交配狀態(tài)下桔小實蠅雄成蟲頭部中的相對表達量

2.4 RNAi干擾效率檢測

RT-qPCR檢測結(jié)果表明，與空白對照組(注射DEPC水)和陰性對照組(注射dsGFP)相比，注射了dsfru的處理組中fru基因的表達水平顯著下降(P<0.05)；與空白對照組和陰性對照組相比，處理組中fru基因表達水平在注射后48 h分別下降了51.66%和47.82%(圖4: A)，在注射后72 h分別下降了72.16%和73.65%(圖4: B)，因此后續(xù)行為學(xué)實驗選擇在干擾后72 h統(tǒng)計交配結(jié)果。

圖4 RNAi后48 h(A)和72 h(B)桔小實蠅成蟲fru基因的相對表達量

2.5 RNAi探究fru在求偶行為中的功能

據(jù)我們觀察可知，桔小實蠅的求偶行為可以分為以下幾個步驟：當(dāng)雄性發(fā)現(xiàn)一個較為感興趣的雌性時，跟隨其后。接近雌性桔小實蠅時，雄性保持翅靠近腹部，并震動翅膀，持續(xù)幾秒到幾分鐘。而雌性會被雄性的振翅(求偶歌)所吸引，較少與振翅時間短(少于30 s)的雄性交配。雌性被雄性的求偶歌所包圍時，較為平和，雄性會趁機舔舐雌性的生殖器，取悅雌性。待時機成熟時，雄性會爬上雌性背部嘗試交配(未遂交配)。受到求偶歌和舔舐的影響，雌性會打開陰道板開始交配。

將已注射dsfru、DEPC水和dsGFP的雄成蟲分別與未進行注射的雌成蟲進行配對。結(jié)果表明(圖5)，注射了dsfru的處理組相對于空白對照組(注射DEPC水)和陰性對照組(注射dsGFP)交配所花費的時間大幅度提高。在對照組中，在60 min后超過60%的雄成蟲進入交配階段，且交配頻率達到最大值。但是注射了dsfru的處理組，在90 min后雌雄交配頻率達到了最大值，僅有不到40%的雄成蟲進入交配階段，且直到觀察結(jié)束(120 min)一直在該交配頻率上下浮動。該結(jié)果表明，當(dāng)fru基因表達量下調(diào)時會直接導(dǎo)致桔小實蠅的交配行為受到抑制，具體表現(xiàn)為求偶時間延長(比空白對照組延長了25～35 min)，交配成功率下降(比空白對照組下降了17%～22%)，說明fru基因在桔小實蠅的求偶交配行為中發(fā)揮著重要作用。

圖5 RNAi干擾fru對桔小實蠅成蟲交配頻率和交配持續(xù)時間的影響

3 討論

在果蠅中，fru基因編碼轉(zhuǎn)錄因子，其中一種可變剪接異構(gòu)體在雄性性別調(diào)控通路中參與雄性求偶行為，而其他可變剪接異構(gòu)體則不具有性別特異性(Salveminietal., 2010; Satoetal., 2019)。在雄性果蠅中，fru基因前體發(fā)生剪接，將位于2號外顯子上的雌性特異性調(diào)節(jié)區(qū)切除，加上雄性特異性5′剪接位點和位于3號外顯子的3′剪接位點，編碼BTB結(jié)構(gòu)域。因此，雄性特異性FRU蛋白在BTB結(jié)構(gòu)域上游具有雄性特異的、長101個氨基酸的N末端。且有研究表明這個FRU蛋白在雄性的求偶行為中也是必要的(Telonis-Scottetal., 2009; Itoetal., 2016)，這與本研究結(jié)果一致。所有報道的FRU蛋白亞型都含有一個BTB結(jié)構(gòu)域，這個結(jié)構(gòu)域可以行使二聚體化的功能，同時在C末端具有ZnF結(jié)構(gòu)與作為DNA結(jié)構(gòu)識別區(qū)，表明FRU蛋白可能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游基因的表達(Vernes, 2014)。且進化分析表明桔小實蠅fru基因序列與果蠅等昆蟲在N端非常保守，預(yù)示著該基因在各個昆蟲中行使類似的功能。

fru在果蠅的性取向、求偶和交配行為中都發(fā)揮著十分重要的作用。在果蠅中，fru基因的突變可以導(dǎo)致雄性果蠅的許多交配和求偶行為的改變(Gaileyetal., 2005; Watanabe, 2019)。除此之外，雄性對配偶辨別跟嗅覺、味覺、視覺等感器接受外界信號息息相關(guān)：當(dāng)果蠅的觸角、下顎須嗅覺組織被剝奪時，與對照組相比，雄性求偶頻率顯著下降(Liuetal., 2008)。且據(jù)報道，fru神經(jīng)元在味覺、視覺、嗅覺等區(qū)域都有分布(Leeetal., 2000)。本研究結(jié)果與前期研究一致，在桔小實蠅中，fru基因在觸角、下顎須、腦組織中均有所表達(圖2)，因此嗅覺系統(tǒng)可能與fru基因?qū)崿F(xiàn)相互作用，并在桔小實蠅交配行為中發(fā)揮著一定的作用。且所涉及參與交配行為的組織主要分布在頭部，因此在本研究中我們選取頭部作為主要檢測對象。fru基因在桔小實蠅雄成蟲不同交配狀態(tài)下頭部的相對表達量并不相同，相較于未交配雄成蟲，fru基因在桔小實蠅雄成蟲頭部中的表達量在與雌成蟲交配后顯著上升(圖3)，因此說明fru基因可能參與桔小實蠅的雄性求偶交配行為。

在果蠅中，當(dāng)FruM完全缺失或者表達下調(diào)時，雄蠅表現(xiàn)出對雌蠅求偶下降，對同性雄蠅強烈追逐以及交配失敗等行為異常。且研究表明人為地在雌性中表達FruM能夠使雌蠅展現(xiàn)出追逐、求偶歌等求偶現(xiàn)象(Villellaetal., 1997; Zhouetal., 2015; Shirangietal., 2016)，說明FruM是求偶行為某些步驟形成的充分調(diào)控因素。因此，F(xiàn)ruM被稱為果蠅求偶的開關(guān)分子(Satoetal., 2019; Wuetal., 2019)。在果蠅中，約有1 500個神經(jīng)元可表達FruM，fruP1Gal4在視覺、嗅覺、味覺以及腹神經(jīng)索區(qū)域都有分布(Leeetal., 2000; Stockingeretal., 2005)。因此，激活fruP1Gal4能夠誘導(dǎo)雄成蟲在沒有求偶對象的情況下展現(xiàn)所有的求偶步驟，而失活fruP1Gal4神經(jīng)元則使雄成蟲求偶下降甚至完全消失(Manolietal., 2005)。與全變態(tài)昆蟲不一樣的是，在雙斑蟀Gryllusbimaculatus中，該基因的表達并未呈現(xiàn)性別二態(tài)型，說明fru在半變態(tài)昆蟲中可能不直接參與求偶和性決定等交配行為(Watanabe, 2019)。因此，fru在果蠅求偶和交配行為中的重要作用不言而喻，但在其他昆蟲中的功能作用以及參與形式還有待進一步挖掘和揭示。本研究結(jié)果闡明了fru參與了桔小實蠅雌雄交配的行為中，RNAi引起的fru基因表達量的降低(圖4)會導(dǎo)致桔小實蠅求偶時間延長以及交配成功率的下降(圖5)。與本研究結(jié)果一致，在家蠶中，使用RNAi降低fru基因的表達量后，只有20%的家蠶在10 min內(nèi)完成交配，與對照組中10 min內(nèi)80%的家蠶均已完成交配差異顯著(Zheng, 2016)，表明fru基因在家蠶求偶行為中發(fā)揮著重要作用。且作者還進一步采用免疫沉淀篩選出4類潛在與FRU蛋白存在相互作用的蛋白(Zheng, 2016)，為進一步研究FRU蛋白的功能提供了基礎(chǔ)。但是fru基因在家蠶中的不同剪切形式，對其功能的調(diào)控是否相同，且該基因是否是調(diào)控交配的必要條件亦不清楚。本研究結(jié)果也表明fru表達與桔小實蠅交配行為緊密相關(guān)，為揭示該基因在非模式昆蟲中的功能和綠色防控桔小實蠅提供了有力證據(jù)，但fru基因(或FRU蛋白)具體以何種形式參與到這些行為中，還需進一步的實驗進行研究與驗證。