甜菜夜蛾谷氧還蛋白SeGrx1原核表達(dá)、純化及酶學(xué)性質(zhì)分析

楊付來(lái), 趙真真, 王月華, 張 蘭, 張燕寧, 毛連綱, 蔣紅云

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 北京 100193)

甜菜夜蛾Spodopteraexigua隸屬于鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)，在世界范圍內(nèi)均有分布，可取食130余種農(nóng)作物和蔬菜，食源性廣、繁殖能力強(qiáng)、具有很強(qiáng)的抗逆能力和成蟲遷飛能力，是極難防治的害蟲之一(Sunetal., 2015)。因此，研發(fā)以甜菜夜蛾蛋白酶為特異殺蟲藥劑作用靶標(biāo)的環(huán)境和諧性農(nóng)藥對(duì)于有效控制該蟲為害具有重要意義。

谷氧還蛋白(glutaredoxin, Grx)是生物體內(nèi)依賴硫醇的抗氧化酶，因?yàn)橐蕾嚬入赘孰牟拍苓€原核苷酸還原酶的二硫鍵被鑒定出來(lái)(M?ssneretal., 1998)，廣泛存在于各種生物體內(nèi)且功能高度保守(Holmgren, 1976)。Grx通過(guò)可逆性谷胱甘肽化修飾蛋白質(zhì)上特定的氨基酸殘基調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能，維持和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)及相關(guān)的信號(hào)途徑，參與生物體內(nèi)電子傳遞以及鐵代謝等重要生理活動(dòng)，在生物氧化脅迫、細(xì)胞調(diào)亡等許多重要的生命活動(dòng)中發(fā)揮作用，目前是國(guó)內(nèi)外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病治療靶蛋白的研究熱點(diǎn)。至今為止，在釀酒酵母Saccharomycescerevisiae中共發(fā)現(xiàn)8個(gè)Grxs，以數(shù)字分別命名為Grx1-8(Abdallaetal., 2018)。通過(guò)χ射線晶體學(xué)和核磁共振光譜方法解析其晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)Grx1具有典型的CPYC雙巰基活性位點(diǎn)，只有一個(gè)谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，N端無(wú)信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，主要由5個(gè)α螺旋包圍4個(gè)β折疊組成(Coppoetal., 2019; Sousaetal., 2019)。其中研究發(fā)現(xiàn)Grx1對(duì)氧化劑高度敏感，特異性地催化還原特定的靶標(biāo)蛋白質(zhì)，具有保護(hù)細(xì)胞、抗氧化的重要功能(Yeetal., 2014; Mantaetal., 2019)。如哺乳動(dòng)物細(xì)胞毒性試驗(yàn)表明, Grx1可以用來(lái)降解除草劑2,4-二氯苯氧基乙酸的毒性，產(chǎn)生羥基自由基，防止2,4-二氯苯氧基乙酸的危害(Liuetal., 2013)。在人類及哺乳動(dòng)物模型中，Grx1作為細(xì)胞內(nèi)氧化還原態(tài)勢(shì)的重要調(diào)節(jié)蛋白功能已經(jīng)得到一定明確，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)人類重大疾病如阿爾茨海默病，血色素沉著病、帕金森病和癌癥具有調(diào)控功能(Sabensetal., 2010; Levinetal., 2018; Lietal., 2018; Brancoetal., 2020)。隨著蛋白修飾、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及蛋白質(zhì)組學(xué)等方面研究的深入，結(jié)合各種技術(shù)挖掘Grx1對(duì)細(xì)胞氧化還原態(tài)勢(shì)調(diào)節(jié)作用及機(jī)理，對(duì)于深刻認(rèn)識(shí) Grx1對(duì)人類疾病的調(diào)控以及藥物開(kāi)發(fā)都十分重要。

國(guó)內(nèi)外關(guān)于昆蟲Grx的研究較少，僅有幾種昆蟲的Grx基因被分類鑒定，并初步研究了其在氧化脅迫中的抗氧化功能(Lietal., 2018)。在模式昆蟲黑腹果蠅Drosophilamelanogaster中有報(bào)道人類Grx1直系同源基因CG6852在果蠅血液重金屬銅平衡中具有重要的調(diào)節(jié)作用(Mercer and Burke, 2016)。在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera中，共有3個(gè)Grx基因(HaGrx,HaGrx3和HaGrx5)被鑒定，當(dāng)棉鈴蟲受到非正常溫度脅迫和H2O2處理時(shí)，HaGrx,HaGrx3和HaGrx5表達(dá)量發(fā)生改變，作者推測(cè)其在棉鈴蟲保護(hù)組織免受氧化脅迫損傷中發(fā)揮重要作用(Zhangetal., 2016)。但這些研究中，關(guān)于昆蟲Grx基礎(chǔ)生物學(xué)特性及抗氧化機(jī)制并沒(méi)有得到系統(tǒng)深入的研究。

本研究中，利用本課題組前期已經(jīng)獲得甜菜夜蛾脂肪體細(xì)胞IOZCAS-Spex-Ⅱ轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，克隆甜菜夜蛾谷氧還蛋白1基因SeGrx1，構(gòu)建原核蛋白表達(dá)系統(tǒng)，純化SeGrx1蛋白，并測(cè)定SeGrx1蛋白酶活性和催化動(dòng)力學(xué)參數(shù)，以期為明確谷氧還蛋白在昆蟲氧化脅迫及凋亡等生命活動(dòng)中的作用機(jī)理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 昆蟲細(xì)胞

甜菜夜蛾中腸脂肪體細(xì)胞IOZCAS-Spex-Ⅱ，由中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所提供(Zhangetal., 2012)。細(xì)胞培養(yǎng)于Grace昆蟲培養(yǎng)基(10%胎牛血清，Invitrogen, CA, 美國(guó))，其培養(yǎng)條件為26±1℃，RH 70%～80%，每6 d傳代1次。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞和BL21(E3)菌株,購(gòu)自天根生化(北京)有限公司;原核表達(dá)載體(pET-16b)和基因克隆載體(pGEM-T Easy Vector System),購(gòu)自Promega公司;RACE試劑盒(SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit)、DNA聚合酶(Ex Taq?)、DNA Marker(DL1000和DL2000),購(gòu)自TaKaRa公司;HindⅢ,XhoⅠ內(nèi)切酶以及T4 DNA連接酶,購(gòu)自New England Biolabs公司;RNA提取試劑盒(RNeasy?Mini Kit),購(gòu)自QIAGEN公司;DNA純化提取試劑盒(EasyPure? Quick Gel Extraction Kit)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix),購(gòu)自全式金公司;鎳-瓊脂糖凝膠 HP和分子篩(Superdex75和Superdex200),購(gòu)自GE Healthcare公司;熒光谷氧還蛋白分析試劑盒(Fluorescent Glutaredoxin Assay Kit 96 Well),IMCO Corporation Ltd AB公司產(chǎn)品;異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)等常用分子和生化試劑,均購(gòu)自北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

1.3 甜菜夜蛾SeGrx1基因序列克隆

分別按照RNA提取試劑盒(RNeasy?Mini Kit)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TransScript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix)說(shuō)明書方法進(jìn)行甜菜夜蛾中腸脂肪體細(xì)胞IOZCAS-Spex-Ⅱ總RNA提取和cDNA合成。根據(jù)本課題組前期已獲得的甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，利用Primer Premier 6.0軟件和RACE試劑盒說(shuō)明書分別設(shè)計(jì)特異性引物和RACE擴(kuò)增引物(表1)，RACE試劑盒(SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit)和DNA聚合酶(Ex Taq?)進(jìn)行PCR和RACE擴(kuò)增。針對(duì)獲得的SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列，使用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，獲得甜菜夜蛾SeGrx1基因全長(zhǎng)。通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的Open Reading Frame Finder預(yù)測(cè)開(kāi)放閱讀框(ORF)，并設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行ORF擴(kuò)增(Ex Taq?)，PCR產(chǎn)物純化后連接至pGEM-T Easy Vector System載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR檢測(cè)并送公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 引物信息

1.4 生物信息學(xué)分析

將獲得的SeGrx1基因利用DNAMAN 翻譯的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行分子量大小和等電點(diǎn)以及多序列對(duì)比，通過(guò)NCBI Conserved Domains Search在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)家族和活性位點(diǎn)(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)。用MEGA7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。使用Phyre2在線工具預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)(http:∥www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)。

1.5 SeGrx1原核表達(dá)

將克隆質(zhì)粒pGEM-T Easy-SeGrx1和原核表達(dá)載體pET-16b分別進(jìn)行HindⅢ和XhoⅠ雙酶切后純化回收目的產(chǎn)物，T4 DNA連接酶連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(E3)，涂布含氨芐青霉素(Amp)的固體LB培養(yǎng)基37℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性克隆，進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒酶切鑒定。將陽(yáng)性克隆接種于含氨芐青霉素(100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，恒溫培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)加入IPTG至其終濃度為0.4～1.0 mmol/L, 25～37℃ 220 r/min誘導(dǎo)4～8 h。離心收集重組菌體后，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白表達(dá)，確定最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件為IPTG終濃度0.5 mmol/L，30℃，220 r/min誘導(dǎo)4 h。

1.6 SeGrx1融合蛋白純化

按照1.5節(jié)獲得的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件將陽(yáng)性克隆菌株大量誘導(dǎo)表達(dá)后，收獲菌體，冰中超聲破碎后離心收集上清與提前平衡好的Ni柱相結(jié)合，用含0, 20, 50和100 mmol/L咪唑的平衡液洗脫雜蛋白，用含200, 300和500 mmol/L咪唑的平衡液來(lái)梯度洗脫目的融合蛋白，SDS-PAGE檢測(cè)蛋白純化效果。合并純化融合蛋白樣品，TEV酶切除標(biāo)簽，TEV酶切His標(biāo)簽蛋白與TEV酶質(zhì)量比分別為4∶1, 2∶1, 1∶1, 1∶1.25, 1∶2.5和1∶5進(jìn)行酶切比例篩選。然后，將含有融合蛋白的洗脫液，在含有0.5 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT的反應(yīng)體系中按照質(zhì)量比為2∶5(融合蛋白∶TEV)加入TEV酶，30℃酶切2 h切除融合蛋白HIS標(biāo)簽。用超濾管濃縮除鹽除氣，Superdex 75/200分子篩進(jìn)一步純化SeGrx1蛋白，純化蛋白進(jìn)行Western blot驗(yàn)證，其中SeGrx1多克隆抗體為山東濟(jì)南安博特生物科技有限公司制備。

1.7 酶活性及酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行谷氧還蛋白比活力及酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定。酶促反應(yīng)體系(100 μL):反應(yīng)緩沖液10 μL, β-NADPH 0.5 μL, GSH 50 mmol/L, 酵母谷胱甘肽還原酶10 nmol/L, 酶液樣品50 μL。在標(biāo)準(zhǔn)酶促反應(yīng)條件下，使用全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀記錄反應(yīng)液30 min在520 nm激發(fā)光下的545 nm發(fā)射光值。以人類谷氧還蛋白酶1(hGrx1)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算SeGrx1比活力。酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定時(shí)，熒光底物酵母谷胱甘肽還原酶濃度設(shè)置為100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.12和1.56 nmol/L。實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，采用雙倒數(shù)作圖法計(jì)算Vmax和Km。

2 結(jié)果

2.1 甜菜夜蛾SeGrx1基因克隆與生物信息學(xué)分析

通過(guò)對(duì)甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得的甜菜夜蛾Grx1基因片段進(jìn)行克隆，獲得SeGrx1部分序列及其5′和3′端序列。結(jié)果顯示甜菜夜蛾SeGrx1基因cDNA全長(zhǎng)為738 bp(GenBank登錄號(hào): MK318813)，其中5′非編碼區(qū)長(zhǎng)40 bp，3′非編碼區(qū)長(zhǎng)347 bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)全長(zhǎng)為351 bp(圖1)，編碼116個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量為12.57 kD，等電點(diǎn)(pI)為8.45，不含信號(hào)肽序列。

圖1 甜菜夜蛾SeGrx1基因序列擴(kuò)增

NCBI Blast數(shù)據(jù)顯示獲得的甜菜夜蛾谷氧還蛋白氨基酸序列隸屬于人類GRX human class 1 and 2(h_1_2)-like亞家族，與釀酒酵母SaccharomycescerevisiaeGrx1和Grx2氨基酸序列一致性分別為33.06%和31.47%，但是釀酒酵母Grx2在N端含有信號(hào)肽序列。因此，我們確認(rèn)本研究中獲得的甜菜夜蛾胱天蛋白酶為Grx1。甜菜夜蛾SeGrx1與鱗翅目昆蟲家蠶Bombyxmori, 棉鈴蟲Helicoverpaarmigera和斜紋夜蛾Spodopteralitura的同源氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì)，與家蠶BmGrx1同源性最高，序列一致性為81.03%，與斜紋夜蛾SlGrx1-like氨基酸序列一致性最低，為67.80%。它們都具有5個(gè)α螺旋4個(gè)β折疊等保守序列，含有經(jīng)典的KXXCPYC催化位點(diǎn)特征殘基，CPYC為雙巰基活性位點(diǎn)，且只有這一個(gè)谷氧還蛋白結(jié)構(gòu)域，為雙巰基谷氧還蛋白(圖2)。

圖2 4種昆蟲Grx1蛋白氨基酸序列比對(duì)

利用Phyre2在線工具預(yù)測(cè)甜菜夜蛾SeGrx1蛋白的三維結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示甜菜夜蛾SeGrx1在數(shù)據(jù)庫(kù)中與人類Grx2氨基酸序列覆蓋度為93%，一致性為40%，三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可信度100%。預(yù)測(cè)結(jié)果為SeGrx1中心由4個(gè)平行的和反向平行的β折疊混合組成，外圍被5個(gè)α螺旋包圍。

2.2 SeGrx1系統(tǒng)發(fā)育和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)

應(yīng)用MEGA7.0中的鄰接法，對(duì)甜菜夜蛾SeGrx1和其他11種昆蟲的Grx1基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。如圖所示，臍橙螟蛾Amyeloistransitella和叢林斜眼褐蝶BicyclusanynanaGrxs聚為一個(gè)分支，同時(shí)又和甜菜夜蛾SeGrx1聚為同一分支，表明這3個(gè)物種在進(jìn)化上距離較近。

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的甜菜夜蛾SeGrx1與其他11種昆蟲Grx1蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))

利用DNAMAN翻譯的相應(yīng)氨基酸序列，輸入到STRING在線工具，預(yù)測(cè)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。因昆蟲谷氧還蛋白研究本身較少，在選擇分類時(shí)，我們選擇人類基因組進(jìn)行，輸入甜菜夜蛾SeGrx1的氨基酸序列，bit score最高的是人類谷氧還蛋白2(GLRX2)，與2.1節(jié)中三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)選擇人類谷氧還蛋白2作為模板相一致。因此，以人類谷氧還蛋白2作為模板進(jìn)行相互作用網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果表明與目標(biāo)蛋白人類谷氧還蛋白2存在已知、預(yù)測(cè)或其他相互作用關(guān)系的蛋白有硫氧還蛋白(TXN)，谷氧還蛋白酶3和5(GLR3和GLR5)，谷胱甘肽還原酶(GSR)，磷脂過(guò)氧化氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶4(GPX4)，硫氧化還蛋白2(TXN2)，過(guò)氧化氫酶(CAT)，超氧化物歧化酶(SOD)，以及過(guò)氧化物還原酶3和6(PRDX3和PRDX6)，這些蛋白的主要功能具有相似性，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)而參與多種細(xì)胞生理過(guò)程，表明SeGrx2在保護(hù)昆蟲組織免受氧化脅迫損傷中可能發(fā)揮重要作用。

2.3 重組質(zhì)粒pET-16b-SeGrx1構(gòu)建及原核表達(dá)

圖4所示，相比空載體，攜帶重組質(zhì)粒pET-16b-SeGrx1菌株在OD值為0.6, 0.8和1.0時(shí)經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，裂解液上清中呈現(xiàn)明顯多出蛋白條帶，大小約為16 kD，與預(yù)期重組蛋白大小相符合，且當(dāng)菌液OD600=0.6時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白條帶相對(duì)OD值為0.8和1.0時(shí)較為明顯，且在上清液總蛋白含量比率較高。因此，誘導(dǎo)表達(dá)條件為當(dāng)菌液OD600=0.6時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG在30℃下誘導(dǎo)4 h。

圖4 甜菜夜蛾SeGrx1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

2.4 融合蛋白純化及驗(yàn)證

SDS-PAGE結(jié)果(圖5)顯示，含有目的融合蛋白的上清液過(guò)Ni-TNA柱后，目的融合蛋白能夠有效掛柱，用含有0, 20和50 mmol/L咪唑的洗脫液能夠洗脫雜蛋白，而含有200和300 mmol/L咪唑的洗脫液能夠洗脫目的融合蛋白，融合蛋白條帶清晰，分子量大小約16 kD左右，與預(yù)測(cè)目標(biāo)蛋白大小一致。因此，融合蛋白純化條件為先用含有0, 20和50 mmol/L咪唑洗脫液能夠洗脫雜蛋白，而后用含有200 mmol/L咪唑的洗脫液洗脫目的融合蛋白。

圖5 SDS-PAGE檢測(cè)純化的His-SeGrx1融合蛋白

圖6(A)顯示切除His標(biāo)簽后的目的蛋白分子量大小在13 kD左右。用Superdex 75/200分子篩進(jìn)一步純化目的蛋白。純化樣品SDS-PAGE電泳檢測(cè)(圖6: A, 泳道8和9)及Western blot驗(yàn)證純化搜集的蛋白就是SeGrx1，同時(shí)目的蛋白純度可達(dá)95%以上(圖6: B)。

圖6 His-SeGrx1融合蛋白His標(biāo)簽切除與純化的SDS-PAGE(A)和Western blot(B)驗(yàn)證

2.5 SeGrx1蛋白的酶活力和酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

根據(jù)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定純化SeGrx1酶比活力和動(dòng)力學(xué)常數(shù)，用人類谷氧還蛋白1(hGrx1)標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線可求出SeGrx1酶比活力為0.577 U/mg pro(根據(jù)試劑盒說(shuō)明，1 U定義為在20℃，pH 7.5條件下，1 nmol/L hGrx1對(duì)熒光底物酵母谷胱甘肽還原酶的催化能力)(圖7: A)。通過(guò)建立的雙倒數(shù)曲線，得到動(dòng)力學(xué)常數(shù)最大反應(yīng)速度Vmax為20.5 U/mg pro，米氏常數(shù)Km為14.3 nmol/L(圖7: B)。

圖7 SeGrx1蛋白酶活力和酶動(dòng)力學(xué)常數(shù)

3 討論

本研究以甜菜夜蛾轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆了SeGrx1基因全長(zhǎng)(GenBank登錄號(hào): MK318813)，開(kāi)放閱讀框(ORF)長(zhǎng)351 bp，編碼116個(gè)氨基酸。在結(jié)構(gòu)上，SeGrx1蛋白中心含有4個(gè)平行和反向平行的β折疊，外圍被5個(gè)α螺旋包圍，含有經(jīng)典的KXXCPYC催化位點(diǎn)特征殘基，CXXC為雙巰基活性位點(diǎn)，即SeGrx1屬于雙巰基谷氧還蛋白(圖2)。雙巰基谷氧還蛋白在生物體內(nèi)有多種功能，通常都是通過(guò)CXXC催化位點(diǎn)催化可逆的二硫鍵還原和氧化反應(yīng)來(lái)執(zhí)行(Foloppe and Nilsson, 2007)。這些預(yù)測(cè)結(jié)果表明, SeGrx1的結(jié)構(gòu)與其他已知谷氧還蛋白在結(jié)構(gòu)上明顯相似，具有典型的谷氧還蛋白折疊。同時(shí)催化位點(diǎn)和GSH結(jié)合口袋氨基酸的保守性也表明SeGrx1具有典型的谷氧還蛋白酶活性功能。

為了進(jìn)一步探究谷氧還蛋白的基礎(chǔ)生物學(xué)特性，我們構(gòu)建了pET-16b-SeGrx1蛋白表達(dá)質(zhì)粒。通過(guò)優(yōu)化誘導(dǎo)條件，在250 r/min培養(yǎng)大腸桿菌至OD600為0.6時(shí)，加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，30℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá)(圖4)?？扇苄許eGrx1-6 His融合蛋白被Ni-TNA柱吸附結(jié)合后，通過(guò)優(yōu)化洗脫條件，融合蛋白條帶清晰，分子量大小為16 kD左右，切除標(biāo)簽后的目的蛋白大小在13 kD左右(圖5)，和理論SeGrx1蛋白的分子量12.57 kD相符。經(jīng)過(guò)Superdex 75/200分子篩進(jìn)一步純化目的蛋白，可以得到基本無(wú)雜蛋白、純度在95%以上的目的蛋白，其狀態(tài)均一，折疊良好，Western blot進(jìn)一步驗(yàn)證收集的目的蛋白就是SeGrx1(圖6)。谷氧還蛋白催化的氧化還原反應(yīng)主要是通過(guò)Grx中的半胱氨酸(C)基團(tuán)催化GSH的巰基(-SH-)與二硫鍵(-S-S-)的交換反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的氧化與還原態(tài)，維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡(Galloglvetal., 2008, 2009)。體外測(cè)定了甜菜夜蛾SeGrx1對(duì)GSH依賴的還原酶的氧化能力，SeGrx1酶比活力為0.577 U/mg pro，最大反應(yīng)速度Vmax為20.5 U/mg pro，米氏常數(shù)Km為14.3 nmol/L(圖7)。

本研究克隆了甜菜夜蛾谷氧還蛋白基因SeGrx1，在通過(guò)不斷優(yōu)化誘導(dǎo)和純化條件獲得了高純度和高活性的SeGrx1蛋白，并發(fā)現(xiàn)酶活性和催化活性都比較高，為深入研究谷氧還蛋白在昆蟲氧化脅迫及凋亡等生命活動(dòng)中的功能提供了理論基礎(chǔ)。