小分子熱激蛋白基因HaHSP19.8在棉鈴蟲抗逆反應(yīng)中的作用

魏紀(jì)珍, 王 凱, 劉少凱, 劉曉光, 梁革梅, 杜孟芳,*, 安世恒

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 鄭州 450002;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

熱激蛋白(heat shock protein, HSP)因響應(yīng)熱刺激而得名，但它的快速合成也響應(yīng)其他多種環(huán)境因子的壓力，其中包括溫度、重金屬、滯育和殺蟲劑等(Huang and Kang, 2007; Yangetal., 2016)。熱激蛋白常作為分子伴侶參與調(diào)控多種分子功能，例如蛋白質(zhì)的折疊、組裝、分泌和降解等，來維持壓力和非壓力下的體內(nèi)平衡(Hartl and Hayer-Hartl, 2002; Nollen and Morimoto, 2002)。根據(jù)氨基酸的同源性和分子量大小，熱激蛋白可以分為5類: HSP90，HSP70，HSP60，HSP40和sHSPs(Feder and Hofmann, 1999)。小分子熱激蛋白是普遍存在的獨(dú)立于三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)的分子伴侶，在幾乎所有的生物中，它們可以阻止蛋白質(zhì)在壓力應(yīng)激下的聚集(Bepperlingetal., 2012)。小分子熱激蛋白分子量12～42 kD不等，各小分子熱激蛋白的同源性較低，與其他的熱激蛋白相比，其唯一的特征是保留了保守的α-晶體結(jié)構(gòu)域(α-crystallin domain, ACD)(Kriehuberetal., 2010; Bashaetal., 2012)。另外，被命名為生命必需的致死蛋白[protein lethal(2)essential for life-like, l(2)efl]也屬于小分子的熱激蛋白家族(Kurzik-Dumke and Lohmann, 1995)。

科學(xué)家們?cè)趯?duì)殺蟲劑的脅迫或抗性的研究中發(fā)現(xiàn)，昆蟲體內(nèi)熱激蛋白廣泛地響應(yīng)殺蟲劑的誘導(dǎo)，甚至參與到昆蟲對(duì)殺蟲劑的抗性中。吡蟲啉處理后，褐飛虱NilaparvatalugensHSP70基因的表達(dá)顯著上調(diào)，干擾該基因會(huì)使褐飛虱抵御殺蟲劑的抗性增強(qiáng)(Luetal., 2017)。黑腹果蠅Drosophilamelanogaster取食殺蟲劑后，HSP26和HSP60基因會(huì)顯著上調(diào)(Doganlar and Doganlar, 2015)。蘇云金芽孢桿菌Bacillusthuringiensis(Bt)是目前廣泛應(yīng)用的生物源殺蟲劑，靶標(biāo)昆蟲的熱激蛋白在抵御Bt的壓力中作用也被逐步被研究。其中在棉鈴蟲Helicoverpaarmigera、亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis和棉鈴象Anthonomusgrandis中，HSP被報(bào)道能與Bt蛋白結(jié)合(Chenetal., 2010; Nakasuetal., 2010; Xuetal., 2013)。蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，Cry1Ac處理后，棉鈴蟲幼蟲HSP70基因的表達(dá)量降低(Yuanetal., 2011)。取食Cry11Aa后，埃及伊蚊Aedesaegypti的HSP90基因的表達(dá)量降低，干擾HSP90會(huì)使埃及伊蚊對(duì)Cry11Aa的抗性增強(qiáng)(Cancino-Rodeznoetal., 2012)。云杉夜蛾Choristoneurafumiferana取食亞致死劑量的Cry1Ab后，HSP90基因的表達(dá)量顯著上調(diào)(Meunieretal., 2006)。小菜蛾P(guān)lutellaxylostellaHSP70被報(bào)道可能是Cry1Ac的結(jié)合蛋白，HSP70基因表達(dá)量的下調(diào)參與了小菜蛾對(duì)Cry1Ac的抗性(Xiaetal., 2016)。

棉鈴蟲屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)實(shí)夜蛾屬Helicoverpa，是一種世界性分布的重要農(nóng)業(yè)害蟲，危害棉花、玉米、蔬菜等300多種作物(Wu and Guo, 2005; Wu, 2007)。近些年來，對(duì)轉(zhuǎn)Cry1Ac棉花的普遍推廣，雖然有效地防治了棉鈴蟲的危害，但田間棉鈴蟲對(duì)轉(zhuǎn)基因棉花的抗性水平也在顯著地增加(Zhangetal., 2012; Anetal., 2014; Jinetal., 2015)。且隨著我國(guó)棉花種植結(jié)構(gòu)的調(diào)整，Bt棉花主要集中在新疆地區(qū)大面積種植(陸宴輝等, 2018)，缺少合理的庇護(hù)所，可能會(huì)引起棉鈴蟲對(duì)Bt棉花抗性的快速發(fā)展。為達(dá)到長(zhǎng)期有效的防治效果，需要對(duì)棉鈴蟲抵御Bt的機(jī)理和Bt的作用機(jī)制進(jìn)行深入的研究。我們前期通過對(duì)抗感Cry1Ac棉鈴蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，一些小分子的熱激蛋白表現(xiàn)出顯著差異(Weietal., 2018)。本研究中，我們鑒定得到了棉鈴蟲的一個(gè)小分子熱激蛋白sHSP19.8，其可能參與到棉鈴蟲對(duì)Cry1Ac抗性機(jī)制；通過RACE和PCR克隆了該小分子熱激蛋白sHSP19.8的基因序列，通過qRT-PCR技術(shù)分析了棉鈴蟲受溫度和Cry1Ac處理后該基因的表達(dá)情況，同時(shí)分析了該基因在抗、感Cry1Ac棉鈴蟲各發(fā)育階段和5齡幼蟲各組織中的表達(dá)譜，為明確HSP19.8在棉鈴蟲生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗外界壓力和對(duì)Cry1Ac抗性機(jī)制中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試棉鈴蟲

本研究采用的Cry1Ac敏感棉鈴蟲為L(zhǎng)F品系，該品系棉鈴蟲于2005年采集于河北省廊坊市棉田，幼蟲飼喂棉鈴蟲人工飼料，成蟲飼喂10%的糖水，一直在室內(nèi)人工飼養(yǎng)，未接觸任何殺蟲劑(梁革梅等, 1999)。室內(nèi)飼養(yǎng)環(huán)境溫度為27±2℃，相對(duì)濕度75%±10%，光周期為14L∶10D。本研究中采用的Cry1Ac抗性棉鈴蟲LF120品系來源于LF品系，經(jīng)MVPII[Dow AgroSciences，一種含有Cry1Ac原毒素的商品化殺蟲劑(Welchetal., 2015)]梯度篩選(5, 10, 20, 30, 60和120 μg/mL Cry1Ac前毒素每毫升飼料)后，分離出LF120的抗Cry1Ac品系(Caoetal., 2014; Weietal., 2015)，其對(duì)Cry1Ac的抗性水平有1 600倍(Weietal., 2016)。

1.2 總RNA的提取和cDNA合成

飼養(yǎng)LF敏感品系的棉鈴蟲，取生長(zhǎng)狀況一致的5齡棉鈴蟲幼蟲，放入40℃培養(yǎng)箱，高溫處理1 h和2 h后，立即放入液氮冷凍，再轉(zhuǎn)到-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。每種處理取樣3頭，設(shè)置4次生物學(xué)重復(fù)。27℃正常飼養(yǎng)的5齡棉鈴蟲作為對(duì)照。

飼養(yǎng)LF敏感品系的棉鈴蟲，取生長(zhǎng)狀況一致的5齡棉鈴蟲幼蟲，饑餓24 h后，轉(zhuǎn)到含30 μg/mL Cry1Ac全長(zhǎng)殺蟲蛋白(該濃度是敏感棉鈴蟲5齡幼蟲7 d 30%的死亡劑量)或正常(不含Cry1Ac)的人工飼料上，飼喂1 h和2 h后，立即在冰上解剖取中腸，如上用4℃預(yù)冷的0.7% NaCl溶液洗去內(nèi)含物，用濾紙吸干水分，迅速放入液氮冷凍后再轉(zhuǎn)存到-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。各處理下取?0頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，設(shè)置4次生物學(xué)重復(fù)。

分別飼養(yǎng)LF和LF120品系的棉鈴蟲，收集1齡幼蟲(20頭)、2齡幼蟲(10頭)、3齡幼蟲(5頭)、4齡幼蟲(3頭)、5齡幼蟲(3頭)、蛹(3頭)和成蟲(3頭)期的棉鈴蟲，上述取樣數(shù)量為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)，該樣品用于比較不同品系不同發(fā)育期，基因的表達(dá)模式。分別準(zhǔn)備LF和LF120品系的棉鈴蟲5齡幼蟲(各10頭)，冰上解剖棉鈴蟲的前腸、中腸、后腸、馬氏管和表皮。前腸、中腸和后腸用4℃預(yù)冷的0.7% NaCl溶液洗去內(nèi)含物，用濾紙吸干水分后迅速放入液氮冷凍，后轉(zhuǎn)到-80℃冰箱保存?zhèn)溆?，用于比較不同品系不同組織中基因的差異。各樣品的準(zhǔn)備均設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

以上各處理樣品總RNA的提取按照Invitrogen的操作說明利用Trizol法提取。RACE擴(kuò)增目的基因所用的cDNA模板的合成，取敏感棉鈴蟲5齡幼蟲的中腸組織，參考SMATR-erRRACE cDNA Amplification Kit說明書操作。qRT-PCR所用cDNA模板依照SuperReal PreMix(Probe)說明書合成。

1.3 棉鈴蟲sHSP19.8基因全長(zhǎng)cDNA克隆

根據(jù)棉鈴蟲的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Weietal., 2018)，分析得到sHSP19.8的部分序列，利用Primer 5.0分子生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)5′RACE特異性引物sHSP19.8-RACE-5′(表1)，以1.2節(jié)合成的敏感棉鈴蟲5齡幼蟲的中腸RACE cDNA為模板，擴(kuò)增sHSP19.8基因的5′端序列。PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA 1 μL, 引物sHSP19.8-RACE-5′(10 mmol/L)0.5 μL, UPM 2.5 μL, 10×Buffer 2.5 μL, LATaq 0.25 μL,無菌水17.25 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 72℃ 延伸3 min, 循環(huán)5次; 94℃變性30 s, 70℃退火30 s，72℃延伸3 min，循環(huán)5次；94℃變性30 s, 68℃退火30 s, 72℃延伸3 min，循環(huán)35次；72℃保溫10 min。PCR產(chǎn)物通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳(DYY-6C瓊脂糖水平電泳儀，北京六一儀器廠)進(jìn)行檢測(cè)，確定目的條帶后，送北京博邁德基因技術(shù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。根據(jù)測(cè)定序列與已知序列拼接，再設(shè)計(jì)特異性引物sHSP19.8-ORF-F和sHSP19.8-ORF-R(表1)，以1.2節(jié)合成的敏感品系棉鈴蟲5齡幼蟲中腸cDNA為模板，擴(kuò)增其開放閱讀框。PCR反應(yīng)體系(25 μL): cDNA 1 μL, sHSP19.8-ORF-F/sHSP19.8-ORF-R(10 mmol/L)各0.5 μL, dNTPs 1 μL, 10×EasyTaq Buffer 2.5 μL, EasyTaq E 0.25 μL, 無菌水19.25 μL。PCR反應(yīng)程序: 94℃預(yù)變性4 min; 94℃變性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸1 min，循環(huán)35次；72℃保溫10 min。再次電泳和測(cè)序驗(yàn)證。

表1 引物信息

1.4 基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

用基因探索者軟件對(duì)sHSP19.8基因的可閱讀框長(zhǎng)度進(jìn)行預(yù)測(cè)，并翻譯成對(duì)應(yīng)的氨基酸序列；利用SWISS-MODEL在線軟件分析蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量、等電點(diǎn)和結(jié)構(gòu)域；在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLASTp同源序列分析，選取不同昆蟲的sHSP基因，利用MEGA 7(7.0.14)軟件，選擇Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，利用最大相似法(maximum likelihood method)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行聚類分析。

1.5 基因表達(dá)量qRT-PCR分析

根據(jù)棉鈴蟲sHSP19.8的cDNA序列，由Inviotrogen公司設(shè)計(jì)合成Taqman探針sHSP19.8-RTPCR-P(5′端用FAM標(biāo)記, 3′端用MGB標(biāo)記)及qRT-PCR的特異性引物sHSP19.8-RTPCR-F和sHSP19.8-RTPCR-R(序列見表1)。qRT-PCR分析采用雙內(nèi)參法，內(nèi)參基因分別為棉鈴蟲GAPDH(GenBank登錄號(hào): JF417983.1)和Actin(GenBank登錄號(hào): X97615.1)，內(nèi)參基因的引物和探針同樣由Inviotrogen公司設(shè)計(jì)合成(序列見表1)。RT-PCR反應(yīng)體系(20 μL): MaximaR Probe/ROX qPCR Master Mix(2×)10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各0.6 μL, 探針(10 μmol/L)0.4 μL, cDNA 2 μL和無菌水6.4 μL。PCR反應(yīng)體系于96孔板中，采用7500 Fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)ABI公司)進(jìn)行反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性10 min; 然后95℃變性3 s, 60℃退火/延伸30 s，循環(huán)40次。每個(gè)生物學(xué)處理進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。數(shù)據(jù)分析使用相對(duì)定量分析方法，計(jì)算公式采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen, 2001)。ΔCt=Ct目標(biāo)基因-Ct內(nèi)參基因, Ct內(nèi)參基因=(CtActin+CtGAPDH)/2, ΔΔCt=ΔCt處理樣品-ΔCt參照樣品。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用DPS7.05軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，其中同一品系不同發(fā)育階段、不同組織、溫度或藥劑不同處理時(shí)間之間的方差分析采用單因素Turkey氏法進(jìn)行顯著性分析；LF和LF120兩個(gè)品系間的各齡期和各組織間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 棉鈴蟲sHSP19.8基因序列及系統(tǒng)進(jìn)化位置

通過RACE和PCR技術(shù)，從棉鈴蟲中擴(kuò)增了一條608 bp的sHSP基因序列，經(jīng)基因軟件分析該序列包含開放閱讀框長(zhǎng)528 bp的基因序列，該序列編碼175個(gè)氨基酸，GenBank登錄號(hào)為XP_021195228.1。通過SWISS-MODEL在線軟件預(yù)測(cè)其蛋白分子量為19.8 kD，等電點(diǎn)為6.22，我們將其命名為HaHSP19.8。對(duì)HaHSP19.8基因結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，結(jié)果表明HaHSP19.8具有可變的N末端區(qū)域(第1-48位氨基酸殘基)，小分子熱激蛋白保守的α-晶狀體結(jié)合域(氨基酸殘基第49-160位)，以及C末端區(qū)域(第161-175位氨基酸殘基)(圖1)。

圖1 棉鈴蟲HaHSP19.8基因cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列

將HaHSP19.8的氨基酸序列與其他13種昆蟲的sHSP氨基酸序列比較，發(fā)現(xiàn)不同物種間的差異主要在N端，這與小分子熱激蛋白具有可變的N末端區(qū)域(第1-48位氨基酸殘基)這一特性相吻合(圖2)。同時(shí)它們具有類似的中間α-晶狀體結(jié)合域和延伸的C端(圖2)。通過比對(duì)分析，HaHSP19.8的氨基酸序列與黏蟲Mythimnaseparata的sHSP19.7、甘藍(lán)夜蛾Mamestrabrassicae的sHSP19.7和斜紋夜蛾Spodopteralitura的l(2)efl氨基酸序列一致性在90%以上；與其他作比較的鱗翅目夜蛾科昆蟲的sHSP氨基酸序列一致性在80%以上(圖2)。

為了進(jìn)一步研究HaHSP19.8基因的進(jìn)化關(guān)系，我們將HaHSP19.8的氨基酸序列與其他14種昆蟲的sHSP蛋白進(jìn)行了進(jìn)化樹分析(圖3)。結(jié)果表明，HaHSP19.8與鱗翅目其他昆蟲的sHSP聚在了同一進(jìn)化支上，其中與已經(jīng)鑒定的黏蟲的sHSP19.7的進(jìn)化關(guān)系最近，其次是與甘藍(lán)夜蛾和斜紋夜蛾(圖3),這與上述基于氨基酸序列的分析結(jié)果一致。

2.2 HaHSP19.8在Cry1Ac敏感棉鈴蟲中受高溫和Cry1Ac誘導(dǎo)時(shí)的表達(dá)差異

HaHSP19.8基因是典型的熱激蛋白基因，該基因的表達(dá)響應(yīng)溫度的調(diào)控，40℃高溫處理后，棉鈴蟲敏感品系5齡幼蟲中均表現(xiàn)出該基因的顯著上調(diào)表達(dá)(圖4: A)，特別是在處理后1 h時(shí)，基因顯著上調(diào)113.37倍(F=41.35,P=0.0001)，2 h時(shí)該基因表達(dá)降低。該HaHSP19.8基因同樣響應(yīng)Cry1Ac殺蟲蛋白的誘導(dǎo)，在棉鈴蟲取食含30 μg/mL Cry1Ac全長(zhǎng)殺蟲蛋白的人工飼料后1 h和2 h均表現(xiàn)為顯著的表達(dá)上調(diào)(F=79.34,P=0.0001)，分別上調(diào)20.67和30.50倍(圖4: B)。

圖4 40℃高溫(A)和飼喂含30 μg/mL Cry1Ac的人工飼料(B)時(shí)棉鈴蟲Cry1Ac敏感品系5齡幼蟲中HaHSP19.8基因的相對(duì)表達(dá)量

2.3 HaHSP19.8在Cry1Ac抗感棉鈴蟲不同發(fā)育階段的表達(dá)差異

通過比較Cry1Ac敏感的LF和Cry1Ac抗性的LF120兩種品系的HaHSP19.8基因，并沒有發(fā)現(xiàn)堿基或者氨基酸的差異。利用qRT-PCR分析HaHSP19.8基因在不同發(fā)育階段的表達(dá)譜，結(jié)果表明HaHSP19.8基因在Cry1Ac敏感的LF品系各個(gè)發(fā)育階段均普遍表達(dá)，其中成蟲和5齡幼蟲期表達(dá)量最高，蛹期表達(dá)最低(圖5)。但是在Cry1Ac抗性LF120品系中，各個(gè)發(fā)育階段中均未檢測(cè)到HaHSP19.8基因的表達(dá)。該基因在Cry1Ac敏感的LF品系各個(gè)發(fā)育階段中的表達(dá)均顯著地高于其在抗性LF120品系中的表達(dá)(P<0.05)(圖5)。

圖5 HaHSP19.8基因在Cry1Ac 敏感品系LF和抗性品系LF120品系棉鈴蟲各發(fā)育階段的相對(duì)表達(dá)量

2.4 HaHSP19.8在Cry1Ac抗感棉鈴蟲5齡幼蟲不同組織中的表達(dá)差異

qRT-PCR分析HaHSP19.8基因在LF敏感棉鈴蟲5齡幼蟲各組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在前腸、中腸、后腸、馬氏管和表皮中均有表達(dá)，其中在表皮中表達(dá)量最高，其次是馬氏管、中腸和后腸，前腸中表達(dá)量最少(圖6)。但是HaHSP19.8基因在LF120抗性品系幼蟲各組織中表現(xiàn)出不一樣的表達(dá)模式，具體表現(xiàn)為馬氏管中最高，其次是前腸和中腸，在后腸和表皮中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)(圖6)。在Cry1Ac敏感品系幼蟲的中腸、后腸和表皮中，HaHSP19.8基因的表達(dá)量均顯著高于其在抗性品系LF120中的表達(dá)量(P<0.05)(圖6)。

圖6 HaHSP19.8基因在Cry1Ac敏感品系LF和抗性品系LF120棉鈴蟲5齡幼蟲各組織中的相對(duì)表達(dá)量

3 討論

經(jīng)分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析，HaHSP19.8是典型的小分子熱激蛋白(圖1～3)。昆蟲在整個(gè)生長(zhǎng)階段必須采取相應(yīng)的對(duì)策來對(duì)抗外界壓力，其中通過調(diào)節(jié)熱激蛋白的表達(dá)就是一種重要的手段(Hoffmannetal., 2003; S?rensenetal., 2003)。近些年來的研究也表明，HSP的表達(dá)在昆蟲抵御高溫和殺蟲劑脅迫中發(fā)揮著重要作用(Kriehuberetal., 2010; Bashaetal., 2013)。例如，42℃可以顯著地誘導(dǎo)小菜蛾12種sHSP基因的表達(dá)(Chen and Zhang, 2015)；斜紋夜蛾的HSP19.7和HSP20.7基因響應(yīng)40℃的誘導(dǎo)(Shenetal., 2011)；水稻二化螟幼蟲體內(nèi)HSP19.8和HSP21.7基因受高溫(39和42℃)的誘導(dǎo)超表達(dá)(Luetal., 2014)。同時(shí)殺蟲劑的使用，作為一種外界的非生物因子，也增加了昆蟲適應(yīng)外界環(huán)境的壓力。在殺蟲劑的影響下，褐飛虱HSP70，果蠅HSP26和HSP60基因以及云杉夜蛾HSP90的表達(dá)量顯著上調(diào)(Meunieretal., 2006; Doganlar and Doganlar, 2015; Luetal., 2017)。本研究中，HaHSP19.8在40℃高溫和Cry1Ac殺蟲蛋白的誘導(dǎo)下，其表達(dá)量在棉鈴蟲幼蟲中都顯著地被誘導(dǎo)(圖4)。這些報(bào)道和我們的研究結(jié)果一起證實(shí)：這些熱激蛋白的產(chǎn)生和高表達(dá)可能與昆蟲應(yīng)對(duì)這些不利的生存環(huán)境具有重大的聯(lián)系(Silbermann and Tatar, 2000)。

既然sHSP19.8在昆蟲抗逆過程中過量表達(dá)，那么研究其在昆蟲各發(fā)育階段和組織的中表達(dá)模式，對(duì)揭示該基因功能具有重要意義。HaHSP19.8具有小分子熱激蛋白的典型特征，同其他熱激蛋白(Kriehuberetal., 2010; Bashaetal., 2012)一樣，40℃誘導(dǎo)1～2 h后高表達(dá)(圖4)。通過qRT-PCR檢測(cè)，證實(shí)HaHSP19.8在敏感棉鈴蟲各生長(zhǎng)發(fā)育階段和組織中均有表達(dá)(圖5和6)，這表明HaHSP19.8可能像其他昆蟲的小分子熱激蛋白一樣廣泛地參與到昆蟲各個(gè)發(fā)育階段的生理生化活動(dòng)中(Huangetal., 2009; Takahashietal., 2010; Shenetal., 2011; Conchaetal., 2012; Luetal., 2014)。但是不同的小分子熱激蛋白在昆蟲中的表達(dá)模式差異很大。與其分子量接近的其他昆蟲的小分子熱激蛋白的表達(dá)有些集中的幼蟲期，有些集中在蛹期(Huangetal., 2009; Kokolakisetal., 2009)。HaHSP19.8在成蟲中表達(dá)量最高(圖5)，二化螟C.suppressalisHSP19.8和斜紋夜蛾S.lituraHSP19.7與棉鈴蟲的同源性較高(圖2)，其在成蟲期也表達(dá)最高(Shenetal., 2011; Luetal., 2014)，這說明該小分子熱激蛋白可能也參與成蟲期的生命活動(dòng)。小分子熱激蛋白在昆蟲各組織中的特異性表達(dá)往往可能與其特殊的功能有關(guān)，HaHSP19.8在敏感棉鈴蟲的表皮、馬氏管和中腸內(nèi)高表達(dá)，表明它可能與維持正常的器官功能和在外界壓力下保護(hù)蛋白質(zhì)的正常功能有關(guān)(Guetal., 2012)。

HaHSP19.8響應(yīng)Cry1Ac殺蟲蛋白的誘導(dǎo)，表現(xiàn)出過量表達(dá)，分析其在抗Cry1Ac的棉鈴蟲品系中的表達(dá)模式，qRT-PCR結(jié)果未檢測(cè)到HaHSP19.8在抗Cry1Ac棉鈴蟲的各個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)(圖5)，在其5齡幼蟲各組織中也表現(xiàn)出未表達(dá)或降低表達(dá)(圖6)，這可能與抗性棉齡蟲表現(xiàn)出來一系列適合度代價(jià)有一定的聯(lián)系。這些適合度代價(jià)體現(xiàn)在：抗性昆蟲卵的孵化率降低，幼蟲的存活率降低、發(fā)育歷期延長(zhǎng)、蛹重減小、繁殖能力下降、交配能力降低，以及抵御非生物學(xué)壓力的能力降低等(范賢林等, 2000; Liangetal., 2007, 2008; 鄒朗云等, 2012)。在抗性棉鈴蟲中的表達(dá)模式再次證實(shí)HaHSP19.8可能在棉鈴蟲的發(fā)育過程中起到很重要的作用。由于目前對(duì)小分子熱激蛋白在昆蟲各組織中的功能研究尚不明確，確切地了解HaHSP19.8的功能，還需開展更多的功能研究工作。

進(jìn)一步的比較抗、感Cry1Ac棉鈴蟲中HaHSP19.8的表達(dá)，結(jié)果表明HaHSP19.8在抗性品系中表達(dá)量降低，我們推測(cè)該小分子熱激蛋白可能參與到棉鈴蟲對(duì)Bt的抗性機(jī)理中，具體的作用方式有下列幾種可能：首先，熱激蛋白可能作為棉鈴蟲體內(nèi)功能蛋白質(zhì)的分子伴侶，隨著功能蛋白質(zhì)降低表達(dá)量參與抵抗Cry1Ac的過程而下調(diào)表達(dá)。在昆蟲對(duì)Bt的抗性機(jī)制中，參與Bt的消化、降解和結(jié)合的蛋白表達(dá)量的減少，通常是其重要的作用機(jī)制之一(Weietal., 2018)，熱激蛋白可能作為它們的重要分子伴侶，參與到蛋白質(zhì)的正常功能中，當(dāng)昆蟲因這些參與Bt作用過程的蛋白的表達(dá)量降低時(shí)，HaHSP19.8的表達(dá)量也顯著降低。其次，如其他熱激蛋白或者Bt的結(jié)合蛋白一樣(Meunieretal., 2006; Xiaetal., 2016)，HaHSP19.8蛋白可能與Bt結(jié)合發(fā)揮毒理，昆蟲通過降低該結(jié)合蛋白的表達(dá)量來抵御Bt毒素。第三，HaHSP19.8可能如小菜蛾Hsp90一樣，可以與Bt蛋白結(jié)合，保持Bt蛋白的正確折疊，以提高Bt的毒性(García-Gómezetal., 2019)，而作為昆蟲的抗性機(jī)制，HaHSP19.8的表達(dá)量下調(diào)來降低Bt的毒性。第四，HaHSP19.8可能僅僅作為生長(zhǎng)發(fā)育中的重要作用因子，因昆蟲對(duì)Bt的適合度代價(jià)或免疫性活動(dòng)在抗性個(gè)體中降低表達(dá)。在小菜蛾Bt抗性研究中表明，表達(dá)量降低的HSP70作為上游的免疫調(diào)控因子，可能激活了JNK, ERK和p38激酶等而使小菜蛾對(duì)Bt產(chǎn)生抗性(Xiaetal., 2016)。本研究初步證實(shí)了HaHSP19.8在棉鈴蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中起到重要作用，該基因可能參與到棉鈴蟲對(duì)Cry1Ac的抗性機(jī)理中。但對(duì)于其具體的作用方式還有待下一步深入研究。