黃芪甲苷改善人內(nèi)皮祖細(xì)胞生物學(xué)功能的實(shí)驗(yàn)研究

蔡昫　鄒曉玲　王禹萌　余亦程　蘭宏偉　郭娟　王婷婷　熊武

〔摘要〕 目的 探討黃芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）生物學(xué)功能的影響，為深入研究AS-IV調(diào)節(jié)EPCs介導(dǎo)的血管新生的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。方法 取足月健康新生兒臍帶血，采用密度梯度離心法分離得到單個(gè)核細(xì)胞，經(jīng)傳代培養(yǎng)，采用CD31抗體聯(lián)合DAPI核染以及FITC-UEA-I和 Dil-ac-LDL雙熒光染色法鑒定EPCs 。將鑒定成功的EPCs隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組采用100 mg/L的AS-IV干預(yù)，對(duì)照組用等容量的PBS液處理，兩組細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，通過CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、黏附能力測(cè)定試驗(yàn)、細(xì)胞劃痕試驗(yàn)及Matrigel體外成血管試驗(yàn)觀察AS-IV對(duì)EPCs增殖、黏附、遷移和成管功能的影響。結(jié)果 與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的OD值增大，細(xì)胞黏附數(shù)增多，細(xì)胞遷移寬度增加（即細(xì)胞遷移率增大），體外成管數(shù)增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 黃芪甲苷能改善體外人EPCs的生物學(xué)功能，具有調(diào)節(jié)EPCs介導(dǎo)血管新生的潛能。

〔關(guān)鍵詞〕 黃芪甲苷;內(nèi)皮祖細(xì)胞;生物學(xué)功能;血管新生

〔中圖分類號(hào)〕R285.5? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.008

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Astragaloside IV （AS-IV） on the biological function of human endothelial progenitor cells （EPCs）， and to lay a foundation for further study of the mechanism of AS-IV regulating EPCs-mediated angiogenesis. Methods Umbilical cord blood was collected for full-term healthy newborns， and the mononuclear cells were separated by density gradient centrifugation method. After subculture， CD31 antibody combined with DAPI staining identification， and double staining identification of FITC-UEA-I and Dil-ac-LDL were adopted to identify EPCs. The successfully identified EPCs were randomly divided into an experimental group and a control group. The experimental group was treated with 100 mg/L Astragaloside IV and the control group was treated with the same amount of PBS solution. After 24 hours of cell culture， the effects of AS IV on EPCs proliferation， adhesion， migration and tube formation were observed by CCK-8 cell proliferation kit， adhesion ability assay test， cell scratch test and Matrigel angiogenesis test in vitro. Results Compared with the control group， the OD value of cell proliferation， the number of cell adhesion， the width of cell migration （namely cell migration rate） and the number of tubes formed in vitro increased in the experimental group， with significant difference （P<0.05）. Conclusion Astragaloside IV can improve the biological function of human EPCs in vitro and has the potential to regulate the angiogenesis mediated by EPCs.

〔Keywords〕 Astragaloside IV; endothelial progenitor cells; biological function; angiogenesis

內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）是一類具有游走特性的能自我增殖更新和分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的定向干細(xì)胞。1997年Asahara等[1]利用免疫磁珠細(xì)胞分選法從人外周血中成功分離得到EPCs。隨著對(duì)EPCs分離、培養(yǎng)、鑒定、功能和應(yīng)用方面的研究的廣泛開展，為難治性缺血性疾病的治療提供了新思路。而這與EPCs增殖、黏附、遷移和成管等生物學(xué)功能密不可分，如何通過藥物或物理療法誘導(dǎo)EPCs以提高其生物學(xué)功能將有助于EPCs發(fā)揮血管新生作用。黃芪甲苷（Astragaloside IV，AS-IV）是中藥黃芪中最主要的活性成分，具有血管藥理活性，能誘導(dǎo)血管新生[2]。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明AS-IV能提升EPCs的細(xì)胞活性，且發(fā)現(xiàn)AS-IV促人EPCs增殖的最適濃度為100 mg/L[3]。本研究是在前期研究基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討AS-IV對(duì)EPCs增殖、黏附、遷移和成管等生物學(xué)功能的影響，將為深入研究AS-IV作用于EPCs介導(dǎo)的血管新生奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1? 主要藥品試劑

ECM（上海中喬新舟公司）;ECGS、胎牛血清、 M199培養(yǎng)基、PBS液（美國(guó)Gibco公司）;胎牛血清（美國(guó)Gibco公司）;胰蛋白酶（美國(guó)Amresco公司）;細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）;黃芪甲苷（純度98%，批號(hào)：110781-201813上海吉至公司）;Anti-CD31抗體（ab28364）、山羊抗兔IgG H&L （FITC，ab6717）均購于英國(guó)Abcam公司;DAPI溶液（北京中科瑞泰公司）;Dil-ac-LDL（澳大利亞Molecular Probes公司）;FITC-UEA-I（美國(guó)Sigma公司）; CCK-8試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所）;Matrigel基底膜基質(zhì)膠（上海前塵公司）。

1.2? 主要儀器

奧林巴斯顯微鏡（SZX7）、熒光顯微鏡（Olympus-BX51）均購于北京同舟同德公司。

2 方法

2.1? EPCs的培養(yǎng)

取足月健康新生兒臍帶血，經(jīng)密度梯度離心分離得到單個(gè)核細(xì)胞。將臍血單個(gè)核細(xì)胞應(yīng)用M199培養(yǎng)基（20%胎牛血清，VEGF10 mg/L，青霉素100 kU/L，鏈霉素100 kU/L），在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d;取貼壁細(xì)胞，換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)7 d;再取貼壁細(xì)胞，用胰酶消化細(xì)胞按1∶3進(jìn)行傳代。

2.2? EPCs的鑒定

參考CD31免疫磁珠分選法[4]及FITC-UEA-I和 Dil-ac-LDL雙熒光染色法[5]共同對(duì)人內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行鑒定。

CD31抗體聯(lián)合DAPI核染鑒定：P3代細(xì)胞用4%多聚甲醛固定15 min;0.5%Triton X-100（PBS配制）室溫通透20 min;PBS浸洗后滴加山羊血清，室溫封閉30 min;滴加Anti-CD31抗體并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。PBST浸洗后滴加山羊抗兔IgG（H&L）抗體，20～37 ℃濕盒孵育1 h;再用PBST浸洗后滴加DAPI，避光孵育5 min進(jìn)行染核，PBST洗去多余的DAPI，加50%甘油，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

FITC-UEA-I和 Dil-ac-LDL雙熒光染色鑒定：將P3代細(xì)胞接種于蓋玻片上使細(xì)胞爬片，加入2.4 g/L的Dil-ac-LDL，于37 ℃避光孵育1 h，使用20 g/L多聚甲醛固定10 min，PBST浸洗后加入10 g/L的FITC-UEA-I，于37 ℃避光孵育1 h，PBST洗滌，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

2.3? 實(shí)驗(yàn)分組

將獲得的EPCs隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組加入100 mg/L的AS-IV進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組用等容量的PBS液處理。

2.4? AS-IV對(duì)EPCs生物學(xué)功能的影響

2.4.1? EPCs增殖實(shí)驗(yàn)? 取對(duì)數(shù)期EPCs，胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，分于96孔板，1×105個(gè)/孔;置于37 ℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁;取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種到96孔板上，配制成100 μL的細(xì)胞懸液;將培養(yǎng)板在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h;實(shí)驗(yàn)組加入100 mg/L AS-IV進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)照組加等容量PBS液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育24 h后加入10 μL CCK8溶液，繼續(xù)孵育1 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定細(xì)胞在450 nm處的吸光度值;同時(shí)設(shè)置對(duì)照孔，每組設(shè)定3復(fù)孔。

2.4.2? EPCs黏附實(shí)驗(yàn)? 用胰酶消化貼壁EPCs，使細(xì)胞脫落，形成500 μL的細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，然后將同等數(shù)量EPCs鋪在24孔板，在37 ℃、5% CO2孵育培養(yǎng)1 h后，分別用100 mg/L AS-IV和PBS液進(jìn)行干預(yù)，培養(yǎng)8 h后，將同等數(shù)目的EPCs接種在包被有大鼠纖維連接蛋白培養(yǎng)板，在37 ℃下培養(yǎng)30 min，2個(gè)隨機(jī)200倍視野計(jì)數(shù)EPCs。

2.4.3? EPCs遷移實(shí)驗(yàn)? 先用Marker筆在6孔板背后每隔1 cm劃?rùn)M線一道，橫穿過孔。每孔至少穿過5條線。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EPCs，在孔中加入約5×105個(gè)細(xì)胞，預(yù)培養(yǎng)1 d后用無菌200 μL槍頭在培養(yǎng)孔底部中央劃一道痕跡，用PBS洗去劃下的細(xì)胞。分別用含有100 mg/L AS-IV和PBS液的無血清M199完全培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇2個(gè)不同視野，用顯微標(biāo)尺，分別測(cè)量0 h和24 h的劃痕創(chuàng)面邊距并拍照。細(xì)胞遷移能力用遷移率表示。

細(xì)胞遷移率=（0 h劃痕的平均邊距-24 h劃痕的平均邊距）/0 h劃痕的平均邊距×100%。

2.4.4? EPCs體外成管實(shí)驗(yàn)? 用M200無血清及生長(zhǎng)因子的培養(yǎng)基1∶1稀釋Matrigel基質(zhì)膠，50 μL/孔加入12孔板，37 ℃孵箱放置30 min。當(dāng)EPCs長(zhǎng)到80%～90%時(shí)，胰酶消化，用含10% FBS的DMEM重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/μL，待細(xì)胞貼壁加入含有PBS的M199培養(yǎng)基，其中一半的孔板用100 mg/L AS-IV進(jìn)行干預(yù)，另一半用PBS液處理，重復(fù)三孔。37 ℃孵箱孵育，于24 h后在倒置顯微鏡下觀察并拍照。每孔隨機(jī)選取4個(gè)視野計(jì)算小管數(shù)，取平均值。

2.5? 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的計(jì)量資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，采用均數(shù)“x±s”表示;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? EPCs的培養(yǎng)及鑒定

第7天培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)典型集落形態(tài)，中央細(xì)胞呈圓形，周邊細(xì)胞呈梭形（見圖1）。細(xì)胞膜結(jié)合CD31免疫熒光抗體呈綠色，細(xì)胞攝取DAPI后核染呈藍(lán)色，融合圖像顯示膜染綠色熒光，核染藍(lán)色熒光（見圖2）;同時(shí)細(xì)胞結(jié)合FITC-UEA-I呈綠色，細(xì)胞攝取Dil-ac-LDL呈紅色，兩者雙染呈橙黃色改變的細(xì)胞即為正常分化的EPCs（見圖2-3）。

3.2? 黃芪甲苷對(duì)EPCs增殖、黏附、遷移、體外成管功能的影響

與對(duì)照組相比，在AS-IV最佳濃度（100 mg/L）干預(yù)下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖的OD值增大;200倍視野下細(xì)胞黏附數(shù)增多;24 h細(xì)胞遷移寬度增加，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞遷移率為68.39%，對(duì)照組細(xì)胞遷移率為43.79%;100倍視野下體外成管數(shù)增多，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

4 討論

EPCs在人體出生后損傷血管修復(fù)和血管新生中發(fā)揮重要作用，尤其在缺血性病變的組織修復(fù)中，需要重建血運(yùn)，離不開EPCs從骨髓中動(dòng)員、遷移到病損部位發(fā)揮血管新生作用。雖然人體固有的EPCs能對(duì)自身分泌的血管生長(zhǎng)因子起反應(yīng)，發(fā)揮一定的血管新生作用，但由于病變軀體擁有的EPCs存在功能缺陷或數(shù)量不足，限制了EPCs在病損組織中發(fā)揮血管新生的程度。為此國(guó)內(nèi)外學(xué)者尋找物理治療手段和藥物來改善EPCs的生物學(xué)功能。有研究表明制成的生物活性納米纖維支架可通過上調(diào)HIF-1a/VEGF/SDF-1a信號(hào)通路，能高效地促進(jìn)EPCs增殖、遷移和成管，以維持和促進(jìn)EPCs的生物活性和血管生成能力[6]?？梢姼纳艵PCs的生存環(huán)境有利于提高其生物學(xué)功能。糖尿病患者體內(nèi)EPCs生存環(huán)境遭到破壞，細(xì)胞功能受損，血管發(fā)生病變，遠(yuǎn)端供血障礙，易出現(xiàn)足潰瘍。另有研究表明姜黃素能促進(jìn)糖尿病體缺血小鼠中VEGF-A和Ang-1的分泌，并通過調(diào)節(jié)EPCs以增強(qiáng)其活力，降低衰老EPCs的數(shù)量，逆轉(zhuǎn)受損EPCs的增殖、遷移和體外成管能力[7]。該研究進(jìn)一步提示病變的機(jī)體或受損的EPCs，需要借助藥物或生物活性材料來改善EPCs的生物學(xué)功能以更好地發(fā)揮血管新生的作用。

AS-IV是補(bǔ)益類中藥黃芪的主要活性成分，目前研究發(fā)現(xiàn)AS-IV在心腦血管梗死后的血管新生方面發(fā)揮重要作用，而在下肢缺血性皮膚潰瘍方面的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用研究相對(duì)缺乏。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)AS-IV可通過調(diào)節(jié)JAK-STAT3信號(hào)通路促進(jìn)血管新生以緩解結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈誘導(dǎo)的大鼠心衰模型[8]。為研究黃芪（AS-IV）對(duì)糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合的影響，本團(tuán)隊(duì)前期用黃芪注射液全身靜脈滴注加局部創(chuàng)面外敷換藥用于糖尿病足潰瘍創(chuàng)面，與貝復(fù)濟(jì)組相比，發(fā)現(xiàn)AS-IV能快速誘導(dǎo)創(chuàng)面血管新生，促進(jìn)肉芽組織生長(zhǎng)，加速創(chuàng)面愈合[9]。然而AS-IV促糖尿病足潰瘍創(chuàng)面血管新生的作用機(jī)制尚不明確，可能通過改善EPCs的生物學(xué)功能而發(fā)揮作用。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)AS-IV能增強(qiáng)人臍帶血來源的EPCs活性和促進(jìn)EPCs增殖，且通過繪制增殖曲線發(fā)現(xiàn)AS-IV促人EPCs增殖的最佳濃度為100 mg/L[3]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上用100 mg/L的AS-IV對(duì)人EPCs增殖、黏附、遷移及體外成管等生物學(xué)功能進(jìn)行研究。研究結(jié)果顯示AS-IV能明顯改善內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、黏附、遷移、體外成管等生物學(xué)功能，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者陳聲榮等[10]用5、25、75 mg/L的AS-IV干預(yù)EPCs后其增殖能力、黏附細(xì)胞數(shù)、血管數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)均明顯增加的研究結(jié)果相吻合。但陳聲榮的研究采用的是外周血提取的EPCs，實(shí)驗(yàn)依據(jù)有所欠缺，且研究中未找到AS-IV發(fā)揮作用的最佳濃度。而陳軍等[11]通過人臍血提取EPCs研究AS-IV對(duì)3，4苯并芘介導(dǎo)EPCs損傷的保護(hù)作用機(jī)制中發(fā)現(xiàn)AS-IV對(duì)預(yù)保護(hù)可呈濃度依賴性地提高EPCs增殖、黏附及遷移能力。上述學(xué)者從不同從側(cè)面研究了不同濃度的AS-IV能改善EPCs的生物學(xué)功能，有力佐證了本研究結(jié)果的可靠性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)最佳濃度AS-IV能顯著改善EPCs的生物學(xué)功能，為深入探討AS-IV通過EPCs介導(dǎo)的促進(jìn)血管新生的作用機(jī)制奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開發(fā)以AS-IV為主要成分的促皮膚潰瘍血管新生的藥物制劑提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（本文編輯? 蘇? 維）