miRNA-200s表達對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）EMT影響的研究

朱敏 來依寧 高靜

【摘要】 目的 ?探討miRNA-200s表達改變對EMT的影響。方法 ?WS誘導(dǎo)體外COPD模型， 分別轉(zhuǎn)染miRNA-200s模擬物或者抑制劑，以轉(zhuǎn)染對照miRNA模擬物為對照組，觀測細胞形態(tài)學(xué)變化，運用免疫組織化學(xué)，蛋白印跡以及Real time-PCR檢測EMT相關(guān)指標(biāo)的表達改變， 運用Sircold assay檢測培養(yǎng)細胞分泌的Col I。結(jié)論 ?WSC誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象，miRNA-200c抑制劑促進EMT發(fā)生，而miRNA-200c模擬劑則減少EMT發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】miRNA-200s 慢性阻塞性肺疾?。–OPD）EMT

【中圖分類號】R322.3 ? 【文獻標(biāo)識碼】A ? ?【文章編號】2107-2306（2020）03-086-01

慢性阻塞性肺疾?。–hronic obstructive pulmonary disease，COPD）是一種以不完全可逆的氣流受限為病變特征的疾病【1】。其病因機制復(fù)雜多樣，僅在最近幾年，研究人員已在人肺組織和氣道中觀察到上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition， EMT）現(xiàn)象【2。3】。氣道上皮細胞可能通過EMT獲得間充質(zhì)細胞表型，并成為成纖維細胞和肌成纖維細胞等促纖維化細胞的重要來源。尤其Sohal和Milara等已經(jīng)在二手香煙引起COPD病人SAR的樣本中發(fā)現(xiàn)了EMT的證據(jù)。因此，EMT已成為SAR最重要的一個分子機制。本文旨在探究miRNA-200s表達改變對EMT的影響，研究如下：

研究內(nèi)容、方案及技術(shù)路線

（1）研究內(nèi)容

探究miRNA-200s表達改變對EMT的影響。

（2）實驗結(jié)果

miRNA-200c表達改變對EMT的影響：WSC刺激培養(yǎng)的16HBE，體外誘導(dǎo)COPD模型，分別進行miRNA-200c的過表達和低表達（分別轉(zhuǎn)染miRNA-200c 模擬物和抑制劑），以control miRNA模擬物為對照。相差顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)學(xué)改變，結(jié)果顯示正常細胞呈典型的上皮細胞形態(tài)，經(jīng)WSC激后，細胞形態(tài)明顯拉長，由典型的卵石狀上皮表型轉(zhuǎn)化成纖維細胞樣的間質(zhì)表型，相鄰細胞間連接也變得疏松，呈現(xiàn)EMT狀態(tài)。加入miRNA-200c抑制劑后，上述現(xiàn)象消失，細胞回歸正常上皮細胞狀態(tài)。當(dāng)加入miRNA-200c抑制劑時，細胞再次出現(xiàn)EMT現(xiàn)象;蛋白印跡結(jié)果顯示，經(jīng)WSC刺激后，SEC23A表達增加，加入miRNA-200c模擬劑可以特異性抑制SEC23A的表達，而使用miRNA-200c抑制劑則促進SEC23A表達明顯上調(diào)。EMT相關(guān)標(biāo)記蛋白表達結(jié)果顯示：經(jīng)WSC激后，細胞上皮型標(biāo)記蛋白E-cat表達下調(diào)，間質(zhì)型標(biāo)記蛋白Vimentin表達上調(diào)，說明WSC誘導(dǎo)EMT現(xiàn)象，而加入miRNA-200c抑制劑則進一步促進EMT發(fā)生，而miRNA-200c 模擬劑則減少EMT發(fā)生，促進TME的發(fā)生。Sircol soluble collagen assay檢測顯示：miRNA-200c 模擬劑可降低WSC刺激引起的Collagen I分泌增加，而miRNA-200c抑制劑則促進Collagen I分泌進一步增加。

討論

EMT的發(fā)生與多種蛋白分子，微環(huán)境以及MicroRNA等有關(guān)，除了常見的誘導(dǎo)因子例如轉(zhuǎn)化生長因子TGF-β等，細胞外基質(zhì)的主要成分I型膠原（Type I collagen，Col I）也是誘導(dǎo)EMT的重要原因。Col I不僅能誘導(dǎo)胚胎發(fā)育中EMT的發(fā)生【4】，還可以通過整合素連接激酶依賴性激活NF-kB和淋巴增強因子-1來促進腎臟近曲小管上皮發(fā)生EMT【5】，從而在腎纖維化中發(fā)揮作用。另有研究小組發(fā)現(xiàn)Col1a1基因敲除所導(dǎo)致的EMT異常在小鼠顱面部發(fā)育中起著相當(dāng)重要的作用【6】。體外研究表明，細胞培養(yǎng)在Col I涂層的培養(yǎng)皿中能誘導(dǎo)EMT的發(fā)生，而在正?；蛘咂渌繉拥呐囵B(yǎng)皿中則沒有出現(xiàn)該現(xiàn)象【5，7】。Sun等發(fā)現(xiàn)香煙提取物促進氣道上皮分泌的生長因子LL-37能激活間充質(zhì)細胞分泌大量的Col I，成為COPD小氣道重塑的重要機制。Zhou等研究發(fā)現(xiàn)樹木煙霧促進小氣道膠原蛋白尤其是Col I沉積，同時有EMT的形成。上述研究結(jié)果強烈提示，Col I高分泌，進而導(dǎo)致EMT發(fā)生，可能在COPD小氣道重塑中起著關(guān)鍵的作用。同時，Sircol soluble collagen assay檢測顯示：miRNA-200c 模擬劑可降低WSC刺激引起的Collagen I分泌增加，而miRNA-200c抑制劑則促進Collagen I分泌進一步增加。綜上研究，miRNA-200c抑制劑促進EMT發(fā)生，而miRNA-200c模擬劑則減少EMT發(fā)生。

參考文獻

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[2]Ward C， Forrest IA， Murphy DM， Johnson GE， Robertson H， Caw- ston TE， Fisher AJ， Dark JH， Lordan JL， Kirby JA， Corris PA.Phenotype of airway epithelial cells suggests epithelial to mesenchymal cell transition in clinically stable lung transplant recipients. Thorax 2005， 60： 865–871.

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[7]Shintani Y， Hollingsworth MA， Wheelock MJ， Johnson KR. Collagen I promotes metastasis in pancreatic cancer by activating c-jun nh（2）-terminal kinase 1 and up-regulating n-cadherin expression. Cancer Res 2006， 66：11745–11753.

作者簡介：朱敏，出生年月：1978.8，性別：女;民族：漢;籍貫：湖北武漢;職稱：主任醫(yī)師;最高學(xué)歷：博士;研究方向：呼吸與消化病理及精準(zhǔn)醫(yī)療

基金項目：該項新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金（2016D01A020）