響應(yīng)面法優(yōu)化海藻酸鈉固定幾丁質(zhì)脫乙酰酶的研究

杭加豪，任思雨，張春光，武波飛，蘇永成，劉姝，焦豫良，盧靜，房耀維，*

（1.江蘇海洋大學(xué)海洋生命與水產(chǎn)學(xué)院，江蘇連云港222005；2.江蘇海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程，江蘇連云港222005）

幾丁質(zhì)（chitin）是由N-乙酰氨基葡萄糖通過(guò)β-（1，4）鍵連接的線性多糖[1]，也是地球上含量?jī)H次于纖維素的天然多糖生物大分子[2]，但因其不溶于水和一般有機(jī)溶劑，難以開發(fā)利用其商業(yè)價(jià)值[3]。殼聚糖（chitosan）是幾丁質(zhì)脫乙酰度大于55%的產(chǎn)物[4]，也是目前已知唯一的堿性多糖[5]。殼聚糖分子鏈上存在的游離氨基使其溶解性能優(yōu)于幾丁質(zhì)[6]。此外，殼聚糖還具有良好的降解性和生物相容性，對(duì)人體無(wú)害，并且具有抑菌、降血壓、降膽固醇和抗癌等作用，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工、化妝品和環(huán)境治理等領(lǐng)域[7-10]。

目前，殼聚糖的制備方法有化學(xué)熱堿法和生物酶法[11]。熱堿法是工業(yè)上最常用的方法，即向40%的氫氧化鈉或氫氧化鉀中加入幾丁質(zhì)后70℃加熱制備殼聚糖[12]。該方法雖操作簡(jiǎn)單，但存在反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、產(chǎn)品脫乙酰度不穩(wěn)定和排放物污染環(huán)境等缺點(diǎn)[13]。生物酶法利用幾丁質(zhì)脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）催化幾丁質(zhì)脫乙酰制備殼聚糖[14]，其反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)品的脫乙酰度穩(wěn)定、可控，最為關(guān)鍵的是生產(chǎn)過(guò)程綠色環(huán)保[15]。CDA在碳水化合物活性酶數(shù)據(jù)庫(kù)（www.cazy.org）中屬于碳水化合物脂酶家族4（carbohydrate esterase family 4，CE4）[16]。來(lái)自海洋節(jié)桿菌 Arthrobacter sp.AW19M34-1的CDA（ArCE4）是目前已知唯一可以催化不溶性幾丁質(zhì)脫去乙?；募?xì)菌CDA，易于在大腸桿菌中可溶性表達(dá)[17]。但是，重組ArCE4穩(wěn)定性和活性容易受溫度、pH值和其它外界因素的影響，增加了殼聚糖生產(chǎn)成本。

固定化酶技術(shù)為提高CDA穩(wěn)定性提供了有效的解決途徑。固定化酶技術(shù)將游離酶制作成具有催化活性但不溶于水的固相酶，提高了生物酶的穩(wěn)定性[18]。游離酶經(jīng)過(guò)固定后還易于從產(chǎn)物中分離，可以循環(huán)使用，降低了生產(chǎn)成本[19]。海藻酸鈉包埋法是最常用和最有效的酶固定方法之一[20]，該法不會(huì)對(duì)酶的構(gòu)象產(chǎn)生影響，并且酶活回收率高，但包埋條件對(duì)酶活影響較大[21]?；诖?，本研究設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)海藻酸鈉包埋固定ArCE4的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并研究固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)和操作穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組Arthrobacter sp.CDA：江蘇海洋大學(xué)海洋生物酶工程實(shí)驗(yàn)室制備保存；海藻酸鈉、氯化鈣（calcium chloride，CaCl2）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；戊二醛（glutaric dialdehyde，GA）：阿拉丁試劑有限公司；對(duì)硝基-N-乙酰苯胺：上海博微生物科技有限公司。所用試劑皆為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（HW·SY）：海源儀器廠；高速冷凍離心機(jī)（日立CR 22G）：日本HITACHI公司；新世紀(jì)紫外可見分光光度計(jì)（T6）：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.3 方法

1.3.1 固定化酶的制備

參考王靜等[22]以海藻酸鈉為載體、戊二醛為交聯(lián)劑對(duì)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶固定的方法，對(duì)CDA進(jìn)行固定。將海藻酸鈉溶液與酶液按2∶1（體積比）混合，攪拌均勻。用5 mL注射器將上述混合溶液以緩慢速度滴入CaCl2溶液中，形成尺寸相似的固定化酶凝膠顆粒。4℃靜置硬化一段時(shí)間，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）與超純水洗滌凝膠顆粒。干燥后加入一定濃度的GA溶液，25℃振蕩交聯(lián)數(shù)十分鐘后，用PBS與超純水洗滌凝膠顆粒，4℃保存在PBS中用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化固定條件

以30.0 g/L的海藻酸鈉，30.0 g/L的CaCl2，靜置硬化4 h，0.05%的GA溶液，振蕩交聯(lián)30 min為基本條件，分別對(duì)海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度、靜置硬化時(shí)間、GA濃度和振蕩交聯(lián)時(shí)間進(jìn)行單因素優(yōu)化。

1.3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化固定條件

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取對(duì)固定化CDA酶活影響較大的海藻酸鈉濃度、CaCl2濃度和靜置硬化時(shí)間為考察因素，以CDA的酶活為考察指標(biāo)，根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。使用Design-Expert.V8.0.6.1軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面回歸分析。

表1 響應(yīng)面法分析因素及水平Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.4 最優(yōu)條件驗(yàn)證試驗(yàn)

分析響應(yīng)面法試驗(yàn)數(shù)據(jù)得到最優(yōu)的CDA固定條件，用該條件進(jìn)行5次重復(fù)驗(yàn)證，測(cè)定固定化CDA的相對(duì)酶活，取其平均值與預(yù)測(cè)值比較。

1.3.5 固定化CDA酶學(xué)性質(zhì)的測(cè)定

1.3.5.1 熱穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶分別置于 20、30、40、50、60℃水浴鍋中保溫2 h后，于30℃進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活性以研究固定化酶的熱穩(wěn)定性。

1.3.5.2 pH值穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶分別置于pH 3～9的緩沖液中保存20 h后，于30℃進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定酶活性以研究固定化酶的pH值穩(wěn)定性。

1.3.5.3 操作穩(wěn)定性

將固定化酶在相同條件下連續(xù)操作10次，測(cè)定相對(duì)酶活。

1.3.6 CDA酶活性的測(cè)定

參考來(lái)蔣麗等[23]測(cè)定CDA酶活性的方法并稍作修改。試管中加入3 mL 0.05 mol/L pH 7.0的PBS和1 mL 200 mg/L的對(duì)硝基-N-乙酰苯胺溶液，30℃預(yù)處理15min后加入1mL酶液，酶促反應(yīng)30min，沸水浴終止酶促反應(yīng)，5000r/min離心15min，取上清液在400nm處測(cè)定上清液吸光值?？瞻讓?duì)照組添加1 mL滅活酶液，其余不變。

固定化酶活性的測(cè)定是以0.5 g固定化酶代替1 mL游離酶，酶促反應(yīng)30 min后取出固定化酶顆粒終止反應(yīng)。以添加0.5 g用滅活酶液制作的固定化酶顆粒為空白對(duì)照。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗(yàn)設(shè)置3組平行試驗(yàn)，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差的形式表示試驗(yàn)結(jié)果，并用SPSS Statistics 25.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活性的影響

海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活性的影響見圖1。

圖1 海藻酸鈉濃度對(duì)固定化酶活性的影響Fig.1 Effect of sodium alginate concentration on the immobilized enzyme

如圖1所示，固定化酶活性隨著海藻酸鈉濃度的增加而升高，當(dāng)濃度達(dá)到30.0 g/L時(shí)酶活性最高；隨著海藻酸鈉濃度繼續(xù)升高，酶活性顯著降低。這可能因?yàn)楫?dāng)海藻酸鈉濃度過(guò)低時(shí)，與CaCl2反應(yīng)形成的凝膠顆?？讖酱?，CDA包埋不緊密，易流失，所以酶活性低；當(dāng)濃度過(guò)高時(shí)，溶液黏度大，與CDA溶液混合時(shí)酶液分散不均勻，并且制成的凝膠顆粒形狀不規(guī)則，有拖尾，影響CDA與底物結(jié)合，所以酶活性降低。

2.1.2 CaCl2濃度對(duì)固定化酶活性的影響

CaCl2濃度對(duì)固定化酶活性的影響見圖2。

圖2 CaCl2濃度對(duì)固定化酶活性的影響Fig.2 Effect of CaCl2concentration on the immobilized enzyme

如圖2所示，當(dāng)CaCl2濃度為30.0 g/L時(shí)，固定化酶活性最高。推測(cè)原因?yàn)镃a2+濃度過(guò)低時(shí)，凝膠交聯(lián)度低，顆粒不易形成，酶包埋不緊密，流失過(guò)多，所以酶活性低；Ca2+濃度過(guò)高時(shí)，凝膠過(guò)度交聯(lián)，顆粒表面布滿Ca2+，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑小，阻礙酶與底物結(jié)合，所以酶活性低。

2.1.3 硬化時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響

硬化時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響見圖3。

圖3 硬化時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響Fig.3 Effect of solidifying time on the immobilized enzyme

如圖3所示，硬化2 h時(shí)，固定化酶活性最高；繼續(xù)硬化，酶活性降低。說(shuō)明硬化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致交聯(lián)過(guò)度，凝膠顆粒表面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)孔徑小，CDA包埋過(guò)于緊密，底物難以與其結(jié)合。

2.1.4 GA濃度對(duì)固定化酶活性的影響

GA濃度對(duì)固定化酶活性的影響見圖4。

圖4 GA濃度對(duì)固定化酶活性的影響Fig.4 Effect of glutaric dialdehyde concentration on the immobilized enzyme

如圖4所示，當(dāng)GA濃度為0.025%時(shí)，固定化酶活性最高；當(dāng)GA濃度增加時(shí)，酶活性顯著降低。這可能因?yàn)檫m當(dāng)濃度的GA可以強(qiáng)化海藻酸鈉分子與CDA的交聯(lián)，增加固定化CDA的穩(wěn)定性，而高濃度的GA溶液會(huì)使蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致喪失酶活性。

2.1.5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響

交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響見圖5。

圖5 交聯(lián)時(shí)間對(duì)固定化酶活性的影響Fig.5 Effect of cross-linking time on the immobilized enzyme

如圖5所示，固定化酶活性隨著交聯(lián)時(shí)間的增加而提高，當(dāng)交聯(lián)時(shí)間為30 min時(shí)，酶活性最高；繼續(xù)延長(zhǎng)交聯(lián)時(shí)間，酶活性降低。這是因?yàn)樵贕A的作用下，CDA與海藻酸鈉凝膠活性位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和時(shí)，GA開始影響CDA的酶活，導(dǎo)致酶活性降低。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

對(duì)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到固定化酶活性（U）對(duì)海藻酸鈉濃度（A）、CaCl2濃度（B）和靜置硬化時(shí)間（C）的三元二次回歸方程為：

表2 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiment

回歸方程的方差分析見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance in regression model

對(duì)測(cè)得的固定化酶活性進(jìn)行方差分析，模型的P值=0.000 8＜0.01，差異極顯著，失擬項(xiàng)的P值=0.391 6＞0.05，差異不顯著。表明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合合理，回歸方程有較高可信度，誤差小，能夠用來(lái)對(duì)固定化酶的酶活性進(jìn)行預(yù)測(cè)。模型中一次項(xiàng)A和C、二次項(xiàng)A2與交互項(xiàng)AB、AC和BC對(duì)固定化酶活性影響顯著，二次項(xiàng)B2和C2對(duì)固定化酶活性影響極顯著。說(shuō)明各固定條件對(duì)固定化酶活性影響并非線性關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

響應(yīng)面3D圖可以直接反映各固定條件間的交互作用對(duì)固定化CDA酶活的影響。等高線圖可以體現(xiàn)出各因素交互作用的強(qiáng)弱，橢圓形的等高線表示相互作用顯著；越接近正圓，交互作用越不顯著。各因素對(duì)固定化酶活性的影響見圖6。

圖6 各因素對(duì)固定化酶活性的影響Fig.6 Interaction effect on activity of immobilized enzyme

如圖6所示，海藻酸鈉濃度和CaCl2濃度之間以及海藻酸鈉和硬化時(shí)間之間交互作用較強(qiáng)，而CaCl2濃度和硬化時(shí)間之間交互作用較弱。結(jié)合各因素交互作用對(duì)CDA相對(duì)酶活性影響的響應(yīng)面圖和回歸模型，優(yōu)化海藻酸鈉包埋法固定CDA的條件，結(jié)果為海藻酸鈉濃度27.8 g/L、CaCl2濃度31.0 g/L、靜置硬化1.84 h。各因素取最優(yōu)值后預(yù)測(cè)固定化酶活性可達(dá)2.13 U/mL。

2.3 最優(yōu)固定條件驗(yàn)證結(jié)果

5 次重復(fù)試驗(yàn)的結(jié)果為 1.98、2.07、2.27、2.01、2.19 U/mL，平均值為2.10 U/mL，與預(yù)測(cè)值2.13 U/mL相比偏差極小，表明模型可信度高。

2.4 固定化酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 熱穩(wěn)定性

固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性見圖7。

圖7 固定化酶與游離酶的熱穩(wěn)定性Fig.7 Thermal stability of immobilized enzyme and free enzyme

由圖7可知，CDA適合儲(chǔ)存在低溫環(huán)境中，隨著儲(chǔ)存溫度的升高，損失的酶活性越多。當(dāng)儲(chǔ)存溫度為45℃時(shí)，游離酶幾乎沒(méi)有酶活性，固定化酶還保留最高酶活20.05%的酶活性。該結(jié)果表明CDA的固定化可以提高其溫度穩(wěn)定性。

2.4.2 pH值穩(wěn)定性

固定化酶與游離酶的pH值穩(wěn)定性見圖8。

圖8 固定化酶與游離酶的pH值穩(wěn)定性Fig.8 pH stability of immobilized enzyme and free enzyme

由圖8可知，CDA儲(chǔ)存在pH 7的緩沖液中效果最佳。pH 3條件下放置20 h后，游離酶幾乎沒(méi)有酶活性，固定化酶還保留最高酶活36.70%的活性；pH 9時(shí)，游離酶還保留最高酶活32.60%的活性，而固定化酶還保留最高酶活52.70%的活性。該結(jié)果表明經(jīng)過(guò)固定后的CDA，pH值穩(wěn)定性有所提高。

2.4.3 操作穩(wěn)定性

固定化CDA的操作穩(wěn)定性見圖9。

圖9 固定化CDA的操作穩(wěn)定性Fig.9 The operation stability of immobilized CDA

如圖9所示，固定化酶活性隨循環(huán)操作次數(shù)的增加而降低。這是因?yàn)檫B續(xù)操作使凝膠強(qiáng)度降低，酶漏失過(guò)多，導(dǎo)致酶活性降低。固定化酶在連續(xù)操作6次后，酶活性依然保持最高酶活性的60.39%。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)使用海藻酸鈉包埋法對(duì)CDA進(jìn)行固定，通過(guò)設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)固定條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件：海藻酸鈉濃度為27.8 g/L，CaCl2濃度為31.0 g/L，硬化1.84 h，GA濃度為0.025%，交聯(lián)30 min。重復(fù)試驗(yàn)驗(yàn)證了優(yōu)化結(jié)果，與預(yù)測(cè)值偏差較小。通過(guò)對(duì)比固定化酶和游離酶的酶學(xué)性質(zhì)，發(fā)現(xiàn)固定化酶的熱穩(wěn)定性和pH值穩(wěn)定性相較于游離酶有明顯提升。固定化酶的操作穩(wěn)定性研究表明，在連續(xù)操作6次后，固定化酶活性依然保持最高酶活的60.39%。CDA是催化幾丁質(zhì)脫乙酰制備殼聚糖的酶，提高幾丁質(zhì)脫乙酰的穩(wěn)定性可以降低成本，提高殼聚糖制備效率。本研究為固定化CDA催化制備殼聚糖的工業(yè)應(yīng)用奠定了試驗(yàn)基礎(chǔ)。