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    改良封閉活檢術(shù)在兔VX2移植性骨腫瘤模型穿刺活檢中的應(yīng)用

    2020-10-14 03:32:30白磊鵬呂家興李哲宏甘新天楊朝昕曹海營金宇
    解放軍醫(yī)學雜志 2020年8期
    關(guān)鍵詞:家兔內(nèi)置造模

    白磊鵬,呂家興,李哲宏,甘新天,楊朝昕,曹海營,金宇

    承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院創(chuàng)傷骨科,河北承德 067000

    惡性骨腫瘤占20歲及其以下青少年惡性腫瘤的6%,其中約2/3為骨肉瘤,其余大部分屬于尤因肉瘤家族[1]。雖然影像學檢查可以獲得腫瘤的病變性質(zhì)、大小、解剖位置、對周圍骨骼或軟組織的影響,以及鄰近關(guān)節(jié)和神經(jīng)血管結(jié)構(gòu)受累等基本信息,但臨床一般將組織活檢作為確定診斷的首選[2]。 細針抽吸活檢創(chuàng)傷小、確診率高,是目前閉合組織活檢的主要方法[3],但存在腫瘤細胞沿穿刺通道擴散的問題[4]。因此,本課題組對封閉活檢技術(shù)進行了改良。VX2腫瘤是起源于Shope病毒誘導(dǎo)的人乳頭狀瘤來源的鱗狀細胞癌[5]。大量研究發(fā)現(xiàn),兔VX2腫瘤細胞生長迅速,可以接種到肺、肝臟、肌肉或骨骼組織[6-7]。兔VX2骨腫瘤模型具有人類惡性骨腫瘤類似的生物學特性,可用于模擬人骨腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移過程[8-9]。因而,本研究采用兔VX2移植性骨腫瘤模型進行實驗,探討了改良封閉活檢技術(shù)的應(yīng)用價值。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 日本大耳白兔(簡稱家兔)30只,雌雄各半,3個月齡,體重2.0~2.5 kg,購自北京市昌揚西山養(yǎng)殖場[動物許可證號:SCXK(京)2016-0007]。于溫度25 ℃、濕度50%的環(huán)境下喂養(yǎng),維持12 h/12 h光/暗周期。食物和水的獲取受到限制(2次/d)。本研究獲得承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院動物倫理委員會審核批準(批準文號LL047)。

    1.2 實驗細胞及儀器 VX2腫瘤細胞株購自重慶蒙博生物科技有限公司。X光機(OEC9800,上海先威光電科技有限公司);Olympus-BX53光學顯微鏡(Olympus-BX53,日本Olympus公司);骨髓穿刺抽吸活檢針[BM09/15,德邁特醫(yī)學技術(shù)(北京)有限公司]。用于封閉活檢的自主設(shè)計改良通道內(nèi)置式骨腫瘤病理組織取出裝置(中國專利號ZL201416055578.0)由鈦合金材料制作(圖1、2)。

    1.3 制作VX2腫瘤組織塊 將VX2腫瘤細胞注入兔左股外側(cè)肌進行連續(xù)傳代培養(yǎng),使用彩色多普勒超聲評估腫瘤大小。4周后,皮下可觸及3 cm×3 cm大小的腫塊時,經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉(戊巴比妥鈉35 mg/kg),以兔角膜反射消失為麻醉成功的標志。去除腫瘤區(qū)兔毛,俯臥位固定于動物實驗操作臺上,碘伏消毒術(shù)區(qū),鋪蓋無菌孔巾,切開皮膚,分離皮下組織、腫瘤。將腫瘤完整取出后移至無菌工作臺上,置于37 ℃的PBS中清洗3遍,去除血跡、壞死組織和纖維組織,用眼科剪將腫瘤剪成1 mm×1 mm×1 mm的組織塊。

    圖1 內(nèi)置通道裝置進行骨腫瘤封閉活檢的原理Fig.1 Principle of closed biopsy of bone tumor with built-in channel device

    圖2 改良內(nèi)置通道骨腫瘤活檢裝置Fig.2 Improved internal channel biopsy device for bone tumor biopsy

    1.4 VX2骨腫瘤模型制備 30只家兔經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉(戊巴比妥鈉35 mg/kg),后肢備皮,仰臥位固定于操作臺上,碘伏消毒后鋪無菌孔單。選取膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)皮膚做1 cm長切口,逐層切開皮下組織和筋膜,暴露髕韌帶,縱行鈍性分離髕韌帶,顯露脛骨平臺,在脛骨平臺面用克氏針(直徑1 mm)鉆孔,將1 cm長的套管插入骨孔后,用頂棒將體積為1 mm3的VX2腫瘤組織塊沿套管推入脛骨髓腔內(nèi),拔出套管,骨蠟封堵骨孔,無水乙醇沖洗骨孔周圍組織3次,每次保留無水乙醇浸泡1 min以上,重建髕韌帶后,逐層縫合切口。雙側(cè)脛骨均以上述方法植瘤,待家兔麻醉蘇醒后,放回籠舍繼續(xù)喂養(yǎng)。所有家兔左腿設(shè)為實驗組,采用改良封閉活檢技術(shù)進行活檢,右腿設(shè)為對照組,采用空芯穿刺針進行活檢。兩組家兔術(shù)后均大腿肌注青霉素80萬U/次, 1次/d,連續(xù)3 d,造模完成。

    1.5 骨組織活檢 造模后7 d,經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉(戊巴比妥鈉35 mg/kg)家兔,在X線引導(dǎo)下,以左側(cè)膝關(guān)節(jié)下1 cm處脛骨外側(cè)為穿刺點,做0.5 cm縱行切口。將內(nèi)置通道安裝在穿刺手柄上,穿透骨皮質(zhì),進入髓腔內(nèi),拔出穿刺手柄,內(nèi)置通道留在骨皮質(zhì)內(nèi)形成人工通道,以G14號注射器針頭通過內(nèi)置通道抽取2 ml髓腔內(nèi)容物后,將尾釘擰入內(nèi)置通道內(nèi)(圖3),達到封閉穿刺通道的效果,然后逐層縫合切口。右側(cè)脛骨模擬臨床中對骨腫瘤進行空芯穿刺針抽吸活檢診斷的方法,以相同方法在右側(cè)膝關(guān)節(jié)下1 cm處脛骨外側(cè)作為穿刺點,暴露骨面后以骨髓穿刺針進行穿刺活檢,獲取2 ml骨髓標本后,穿刺孔不做封堵處理,壓迫止血,逐層縫合切口。骨腫瘤穿刺完成,待家兔麻醉蘇醒后,放回籠舍繼續(xù)喂養(yǎng)。兩組家兔術(shù)后均大腿肌注青霉素 80萬U/次,1次/d,連續(xù)3 d。

    圖3 通道內(nèi)置腫瘤活檢裝置進行家兔活檢的過程Fig.3 The process of performing a tumor biopsy of rabbit using a internal channel

    1.6 穿刺孔周圍軟組織影像學、病理學檢測 造模后14 d,行X線檢查雙側(cè)脛骨后,經(jīng)腹腔注射麻醉(戊巴比妥鈉,40 mg/kg),耳緣靜脈空氣栓塞處死家兔,以胸部可觸及心跳消失為死亡標志。手術(shù)切除穿刺孔外周2 cm范圍內(nèi)的軟組織,由病理科醫(yī)師對其進行HE染色并鏡檢。鏡檢結(jié)果由同一高年資病理醫(yī)師以盲法進行。

    1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 25.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用χ2檢驗分析造模后14 d的影像學檢查結(jié)果和病理檢測結(jié)果。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 造模和骨組織活檢結(jié)果30只家兔造模后,1只骨髓穿刺后1 d休克死亡,2只在造模后9 d因多臟器衰竭死亡,最終共27只納入研究。造模植瘤切口與穿刺活檢切口處均無明顯感染,但皮膚組織生長愈合緩慢。27只家兔活檢骨組織病理檢測均檢出腫瘤細胞,腫瘤確診率均為100.00%。

    2.2 穿刺孔周圍軟組織影像學、病理學檢測結(jié)果造模14 d時,X線檢查結(jié)果顯示,所有內(nèi)置通道在穿刺孔位置良好(圖4),實驗組4只、對照組11只家兔脛骨穿刺孔周圍出現(xiàn)骨膜反應(yīng)和骨外高密度影。兩組穿刺孔周圍骨膜反應(yīng)和骨外高密度影出現(xiàn)率比較[14.81%(4/27) vs. 40.74%(11/27)]差異有統(tǒng)計學意義(χ2=35.092,P<0.05)。穿刺孔周圍軟組織病理檢測結(jié)果顯示,實驗組8只、對照組27只家兔穿刺孔周圍軟組織鏡下檢出腫瘤細胞(圖5),兩組腫瘤細胞轉(zhuǎn)移率比較[29.63%(8/27) vs. 100.00%(27/27)]差異有統(tǒng)計學意義(χ2=29.314,P<0.05)。

    圖4 家兔造模第14天穿刺通道周圍脛骨X線片F(xiàn)ig.4 X-ray of tibia around puncture passage on the 14th day of rabbit modeling

    圖5 家兔活檢獲得組織及造模第14天穿刺孔周圍軟組織病理檢查結(jié)果(HE ×40)Fig.5 The tissue obtained by rabbit biopsy and the pathology of soft tissue around the puncture hole on the 14th day of modeling (HE ×40)

    3 討 論

    近年來,惡性腫瘤的治療已成為世界范圍的醫(yī)學問題[10],骨腫瘤的發(fā)病率也在逐年增高[1]。適當、及時的診斷檢查和多學科協(xié)作的治療方法對于提高腫瘤的治療效果十分重要。腫瘤的最終診斷需要結(jié)合臨床表現(xiàn)、影像學、病理學和分子生物學檢測結(jié)果[11-12]。準確的病理診斷有助于選擇合適的治療計劃,有利于改善預(yù)后。目前組織活檢仍是臨床診斷腫瘤的“金標準”[13],但需要經(jīng)驗豐富的團隊正確設(shè)計和實施?;顧z后遺留的穿刺通道出血、腫瘤細胞擴散等逐漸引起臨床醫(yī)師的關(guān)注,對穿刺通道進行切除或封堵逐漸成為共識[14-15]。

    組織活檢的方法有閉合活檢、切口活檢和切除活檢[16]。其中切口活檢的優(yōu)點為可獲得充足的腫瘤樣本和較高的診斷準確率[17],缺點為出血和局部腫瘤細胞擴散。此外,切口可能會影響隨后的手術(shù)治療。閉合活檢包括細針抽吸活檢和空芯針活檢,優(yōu)點為創(chuàng)傷小、出血少、操作簡便,是骨科醫(yī)師最常用的方法;缺點為獲取的腫瘤樣本較少[18]。活檢完成后,穿刺孔需要壓迫止血或用骨蠟封堵,在機體組織的自然愈合下,穿刺孔會自然閉合[19]。但在此之前,腫瘤細胞在髓腔內(nèi)外壓力差的作用下,可能會擴散到腫瘤穿刺孔外?,F(xiàn)有的組織活檢技術(shù)會破壞腫瘤周圍的自然屏障,導(dǎo)致滲出或腫瘤細胞擴 散[20-23]。Barrientos等[15]發(fā)現(xiàn),穿刺針活檢患者中穿刺通道腫瘤種植發(fā)生率為0.8%。

    本研究中用于減少腫瘤細胞沿穿刺通道擴散的內(nèi)置通道活檢儀器是本課題組的專利產(chǎn)品(中國專利號ZL201416055578.0)。內(nèi)置通道和封堵螺釘使用可置入人體的鈦合金材料制作,可長期留置于體內(nèi)。通過置入金屬通道,抽吸獲得足夠的病理組織,然后擰入封堵螺釘達到閉合穿刺通道的目的,從而減少局部滲出和腫瘤細胞擴散。本研究使用的兔VX2移植性骨腫瘤模型是常用的骨腫瘤動物模型[24-26]。以往研究顯示,VX2腫瘤細胞移植后第1周,脛骨腫瘤在髓腔內(nèi)生長緩慢,骨皮質(zhì)完整;第2周,腫瘤基本上可生長至骨皮質(zhì)邊緣;第3周X線片顯示腫瘤生長迅速,骨皮質(zhì)部分破壞,但不會出現(xiàn)在周圍軟組織中[27]。為了消除腫瘤對周圍軟組織的影響,使實驗過程更加符合臨床診斷過程,本研究采用了1周模型,實驗組穿刺孔周圍骨膜反應(yīng)和骨外高密度影出現(xiàn)率、腫瘤細胞轉(zhuǎn)移率均低于對照組,表明改進后的活檢方法能有效防止腫瘤擴散。

    本研究具有一定的局限性:相對家兔的體型,實驗中所使用器械較大,導(dǎo)致兩種穿刺方法均可100%檢出腫瘤細胞。空芯針活檢穿刺通道較大,導(dǎo)致對照組穿刺孔外周軟組織腫瘤浸潤率過高,并且由于樣本量小,導(dǎo)致數(shù)據(jù)發(fā)生偏倚。而封閉活檢裝置由于金屬穿刺通道的限制,穿刺中取材方向有限,在應(yīng)用中可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果,且此裝置對于留置部位的適用性,對骨骼強度的影響,以及長期留置體內(nèi)是否會導(dǎo)致排異反應(yīng)等有待深入研究,本課題組將繼續(xù)改進該裝置設(shè)計,并進行進一步的研究,以期為臨床診斷提供更多參考。

    綜上所述,改良封閉活檢技術(shù)不僅物理隔離了腫瘤與穿刺通道的骨組織、外周軟組織,且封堵了穿刺孔。整套裝置是由可以置入人體的鈦合金制成的,可以穩(wěn)定地固定在穿刺孔,以防止腫瘤擴散。本研究結(jié)果表明,采用內(nèi)置通道活檢技術(shù)在兔VX2移植性骨腫瘤模型中進行穿刺活檢,可以減少脛骨穿刺孔的腫瘤細胞擴散。

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