缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證病證結(jié)合動(dòng)物模型研究

蔣成婷，葛金文，聶慧芳，羅寧，鐘達(dá)源，鄧奕輝

缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證病證結(jié)合動(dòng)物模型研究

蔣成婷，葛金文，聶慧芳，羅寧，鐘達(dá)源，鄧奕輝

湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，湖南 長沙 410208

探索缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證病證結(jié)合動(dòng)物模型制備方法。通過腎上腺素/內(nèi)毒素、角叉菜膠（CA）和角叉菜膠/干酵母菌（CA/Y）3組藥物干預(yù)，并復(fù)合大腦中動(dòng)脈梗死（MCAO）構(gòu)建缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證大鼠模型。造模后24 h，觀察并檢測大鼠表征、神經(jīng)功能評分、腦病理形態(tài)學(xué)、血液流變學(xué)和腦組織促炎因子水平。上述3組病證結(jié)合組大鼠缺血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬均出現(xiàn)顯著神經(jīng)元壞死和免疫細(xì)胞浸潤，且CA組和CA/Y組大鼠肢體遠(yuǎn)端膚色晦黯甚至發(fā)黑；其中，CA/Y組神經(jīng)功能缺損癥狀和血液流變學(xué)改變最顯著，低切、高切全血黏度均明顯升高（＜0.05），且缺血側(cè)腦區(qū)促炎因子白細(xì)胞介素-1β水平顯著升高（＜0.01）。角叉菜膠和干酵母菌兩種因素疊加復(fù)合MCAO手術(shù)造模能較好地構(gòu)建缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證動(dòng)物模型。

缺血性中風(fēng)；瘀毒互結(jié)；動(dòng)物模型；病證結(jié)合

缺血性中風(fēng)是一種因栓子或血栓阻塞腦部血流而導(dǎo)致的腦內(nèi)局部缺血缺氧的中風(fēng)類型，具有高發(fā)病率、高病死率和高致殘率特點(diǎn)[1-2]。缺血性中風(fēng)屬中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇，歷代醫(yī)家將其病因歸結(jié)為“虛、風(fēng)、火、痰、瘀、毒”[3-4]。目前，理論研究表明，瘀毒互結(jié)已成為缺血性中風(fēng)的重要病機(jī)[5]。臨床研究表明，中風(fēng)后3～5 d患者出現(xiàn)明顯毒損癥狀[6]，且利用化瘀解毒法能提高缺血性中風(fēng)療效[7-8]。課題組前期通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)化瘀解毒法能改善大腦中動(dòng)脈梗死（MCAO）大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，且較單純活血化瘀法或清熱解毒法治療效果更好[9-10]。瘀毒互結(jié)證是中風(fēng)病主要證候之一，但鮮有文獻(xiàn)闡明其臨床機(jī)制。有效病證結(jié)合動(dòng)物模型將有助探索中風(fēng)病中醫(yī)證候病理生理機(jī)制，進(jìn)而為臨床藥物篩選提供靶點(diǎn)。在課題組前期研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)提出利用腎上腺素/內(nèi)毒素（adrenaline/lipopolysaccharide，A/LPS）、角叉菜膠（carrageenan，CA）、角叉菜膠/干酵母菌（CA/Yeast，CA/Y）3種方法干預(yù)大鼠后進(jìn)行MCAO造模構(gòu)建中風(fēng)瘀毒互結(jié)證病證結(jié)合模型，并對其表征、大腦病理形態(tài)學(xué)改變、血液流變學(xué)和腦內(nèi)促炎因子水平等進(jìn)行評價(jià)，旨在建立一種穩(wěn)定且符合臨床表現(xiàn)的中風(fēng)瘀毒互結(jié)證病證結(jié)合模型。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

雄性SD大鼠36只，SPF級，體質(zhì)量250～280 g，湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號SYXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物環(huán)境設(shè)施合格證號SYXK（湘）2015-0003。

1.2 試劑

0.1%腎上腺素，遠(yuǎn)大醫(yī)藥中國有限公司；細(xì)菌脂多糖（LPS），美國Sigma公司，批號O111B4，用生理鹽水配制成1 mg/mL，再用0.22 μm濾器除菌，置4 ℃冰箱貯存，使用時(shí)用生理鹽水稀釋成50 μg/mL；CA，上海麥克林生化科技有限公司，批號C804872，用生理鹽水配制成10 mg/mL，用沸水浴使之充分溶解混勻，冷卻后置于0～5 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。高活性Yeast，湖北安琪酵母股份有限公司，批號GB/T20886，用生理鹽水配制成0.2 g/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用；MCAO栓線（北京西濃科技有限公司，型號263650A4）；RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH，批號010-59822688）；2×NovoScript?SYBR qPCR SuperMix Plus，cDNA purge，RNase Free Water（Novoprotein，批號E096）。白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）引物，由北京擎科生物科技有限公司湖南分公司合成，引物序列：上游5’-CAGGCTCCGAGATGAACAAC-3’，下游5’-GGTG GAGAGCTTTCAGCTCATA-3’。

1.3 儀器

KD-BM Ⅱ電腦生物組織包埋機(jī)（金華市科迪儀器設(shè)備有限公司），輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（20000056）、MoticamPro顯微鏡（賽默飛世爾上海儀器有限公司，BA410E），T100TMThermal Cycler反轉(zhuǎn)錄儀（BIO-RAD公司），多功能酶標(biāo)儀（BioTek），CFX96TMOptics Module熒光定量PCR儀（BIO-RAD公司），微量高速冷凍離心機(jī)（Thermo Scientific）。

1.4 分組和造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（J組）、MCAO組（IS組）、CA＋MCAO組（CA組）、CA/Y＋MCAO組（CA/Y組）和A/LPS＋MCAO組（A/LPS組），前4組各6只，A/LPS組12只。CA組大鼠腹腔注射CA 50 mg/kg，每日1次，連續(xù)3 d[11]。CA/Y組在CA組基礎(chǔ)上，第4日大鼠背部皮下注射0.1%干酵母懸液10 mL/kg[12]。A/LPS組大鼠皮下注射0.01%腎上腺素溶液0.8 mg/kg，每日1次，連續(xù)14 d，第15日大鼠尾靜脈注射50 μg/mL LPS溶液（50 μg/kg）[13-14]。IS組經(jīng)藥物干預(yù)后24 h的CA組、CA/Y組和A/LPS組采用改良Zea Longa線栓法制備大腦MCAO永久性腦缺血模型[15]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，仰臥位固定于鼠板，通過腹側(cè)頸切口分離出右頸總動(dòng)脈，于分離出的頸總動(dòng)脈處剪一小口，從此處將栓線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，并前進(jìn)以閉塞大腦中動(dòng)脈。以線栓插入大腦中動(dòng)脈即刻作為0時(shí)。假手術(shù)組大鼠除未插入栓線外，接受MCAO造模相同的外科手術(shù)過程。

1.5 神經(jīng)功能評分

大鼠MCAO造模后24 h評估神經(jīng)功能缺損，神經(jīng)功能評分方法參考Zea Longa評分標(biāo)準(zhǔn)[15]。0分：無神經(jīng)功能缺損；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損（不能完全伸展左前爪）；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損（向左轉(zhuǎn)圈）；3分：嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損（向左側(cè)傾倒）；4分：不能自發(fā)行走且意識水平低下。

1.6 表征采集

造模完成后24 h，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉，采用數(shù)碼相機(jī)對大鼠耳廓、四肢、尾部進(jìn)行圖像采集。

1.7 腦組織病理形態(tài)學(xué)檢測

HE染色觀察腦組織變化，包括大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體形態(tài)。大鼠腹主動(dòng)脈采血，取全腦固定于4%多聚甲醛溶液24 h，包埋石蠟，切成4 μm厚冠狀切片，然后用二甲苯和乙醇脫蠟。切片HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.8 血液流變學(xué)檢測

大鼠表征采集后，于腹主動(dòng)脈采血，用血液流變儀檢測全血黏度和纖維蛋白原指標(biāo)。

1.9 熒光定量PCR檢測白細(xì)胞介素-1β基因表達(dá)

總RNA通過RNAsimple Total RNA Kit總RNA提取試劑盒提取，總cDNA用2×NovoScript?SYBR qPCR SuperMix Plus提取。將提取的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，取新200 μL無酶離心管，加10 μL 2×NovoScript?SYBR qPCR SuperMix Plus、IL-1β上游引物和下游引物各1 μL模板cDNA和7 μL RNase-Free ddH2O，熒光定量PCR儀中擴(kuò)增，反應(yīng)體系為95 ℃、1 min，再95 ℃、20 s和60 ℃、1 min（40個(gè)循環(huán)）。反應(yīng)后得Ct值，計(jì)算ΔΔCt值。ΔCt＝Ct目的基因－Ct內(nèi)參，ΔΔCt＝ΔCt實(shí)驗(yàn)－ΔCt對照，基因相對表達(dá)量用2-ΔΔCt表示。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠表征比較

CA組和CA/Y組在CA注射后第2日即出現(xiàn)尾部遠(yuǎn)心端瘀血，造模完成后24 h尾部遠(yuǎn)心端及四肢末梢出現(xiàn)皮膚發(fā)黑，且局部發(fā)黑處皮膚溫度降低。A/LPS組、IS組和J組表征無明顯變化，見圖1。由此看出，CA組和CA/Y組大鼠表現(xiàn)更符合瘀毒互結(jié)證病情急重、膚色晦黯的特征。

注：A. CA組；B. CA/Y組；C.A/LPS組；D. IS組；E. J組；F. CA注射0日；G. CA注射1 d；H. CA連續(xù)注射3 d

2.2 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較

造模后24 h對大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分，J組大鼠未見明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，病證結(jié)合組（A/LPS組、CA組和CA/Y組）和單純病組（IS組）大鼠具有較明顯神經(jīng)功能缺損癥狀，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05，＜0.01）；與IS組比較，病證結(jié)合組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05），見圖2。由此得出，CA/Y組神經(jīng)功能缺損最嚴(yán)重，在宏觀表征上更符合瘀毒互結(jié)證發(fā)病急且病情嚴(yán)重特點(diǎn)。

注：與J組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

2.3 各組大鼠腦組織病理形態(tài)學(xué)改變比較

造模后24 h大鼠進(jìn)行大腦病理形態(tài)學(xué)檢測。J組大腦皮質(zhì)、海馬和紋狀體區(qū)未見明顯病理形態(tài)學(xué)改變；病證結(jié)合組（A/LPS組、CA組和CA/Y組）和IS組大鼠腦組織出現(xiàn)明顯損傷，HE染色顯示缺血側(cè)大腦皮質(zhì)和海馬形態(tài)明顯被破壞，出現(xiàn)大量神經(jīng)元壞死，膠質(zhì)細(xì)胞增多，免疫細(xì)胞浸潤，而紋狀體區(qū)破壞較輕微；病證結(jié)合組大鼠腦組織形態(tài)破壞較單純病組嚴(yán)重，見圖3。由此可得出病證結(jié)合組均能造成明顯神經(jīng)元壞死和免疫細(xì)胞浸潤，在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上符合瘀毒互結(jié)證急且重的特點(diǎn)。

圖3 各組大鼠腦組織皮質(zhì)、海馬和紋狀體形態(tài)（HE染色，×200）

2.4 各組大鼠全血黏度比較

造模后24 h檢測大鼠全血進(jìn)行血液流變學(xué)。另外，考慮到A/LPS組大鼠造模周期較長并為減少雙重藥物干預(yù)時(shí)實(shí)驗(yàn)誤差，故將該組大鼠分配12只，其余4組每組6只。在實(shí)驗(yàn)中，上述5組手術(shù)中共死亡5只，A/LPS組藥物干預(yù)時(shí)死亡1只，CA組因血液凝固棄用標(biāo)本1個(gè)。結(jié)果顯示，在不同切變率（1、5、30、200 s-1）時(shí)，病證結(jié)合組（A/LPS組、CA組和CA/Y組）和IS組大鼠全血黏度均升高；與J組比較，IS組全血黏度低切（1、5 s-1）、中切（30 s-1）和高切（200 s-1）時(shí)均顯著升高（＜0.01），且CA/Y組全血黏度低切（1、5 s-1）和高切（200 s-1）時(shí)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05）；與IS組比較，病證結(jié)合組大鼠全血黏度均降低，A/LPS組全血黏度（切變率為1、5、200 s-1時(shí)）和CA組全血黏度（切變率為1、5 s-1時(shí)）明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.01，＜0.05），見表1。由此得出在全血黏度層面，CA/Y組更符合瘀毒互結(jié)證血液流動(dòng)緩慢、瘀滯的特點(diǎn)。

表1 各組大鼠全血黏度比較（±s，mPa?s）

注：與J組比較，*＜0.05，**＜0.01；與IS組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.5 各組大鼠纖維蛋白原比較

造模后24 h檢測大鼠全血纖維蛋白原，每組檢測大鼠數(shù)量同“2.4”項(xiàng)。與J組比較，IS組大鼠纖維蛋白原含量明顯降低（＜0.01），病證結(jié)合組大鼠纖維蛋白原含量降低，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）；與IS組比較，A/LPS組大鼠纖維蛋白原含量明顯升高（＜0.01），見圖4。由此得出MCAO手術(shù)造模能造成大鼠低凝狀態(tài)，而病證結(jié)合組藥物可不同程度影響大鼠纖維蛋白原水平從而改變低凝狀態(tài)。

注：與假手術(shù)組比較，**P＜0.01；與IS組比較，##P＜0.01

2.6 各組大鼠缺血側(cè)大腦組織促炎因子白細(xì)胞介素- 1β基因表達(dá)比較

上述數(shù)據(jù)表明，CA/Y組能較好地模擬缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證病證結(jié)合動(dòng)物模型。基于以上結(jié)果，對CA/Y組檢測大鼠缺血側(cè)腦內(nèi)促炎因子IL-1β信使RNA基因表達(dá)。與J組比較，CA/Y組和IS組大鼠腦組織IL-1β mRNA表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與IS組比較，CA/Y組大鼠腦組織IL-1β mRNA表達(dá)明顯降低（＜0.01），見圖5。由此得出CA/Y組導(dǎo)致腦內(nèi)毒性產(chǎn)物IL-1β顯著增高，進(jìn)一步證明CA/Y組缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證模型成功。

注：與J組比較，**P＜0.01；與IS組比較，##P＜0.01

3 討論

從中醫(yī)視角，中風(fēng)病除風(fēng)證、火熱證、痰濕證、血瘀證、氣虛證和陰虛陽亢證外，瘀毒互結(jié)證也是重要證候[5]。理論研究表明，瘀毒作為致病因素，既是引發(fā)缺血性中風(fēng)發(fā)作的關(guān)鍵之“因”，又是瘀血日久不化轉(zhuǎn)化為毒所致的“果”[5，16]。瘀毒互結(jié)，阻滯腦竅，導(dǎo)致氣血運(yùn)行失常，引動(dòng)內(nèi)風(fēng)而發(fā)中風(fēng)，此為“因”。瘀毒阻滯三焦，氣機(jī)升降受阻，濁陰不降，則濁毒不能隨水液代謝排出體外，毒邪積聚日久化熱，煎灼精血津液，導(dǎo)致血液黏稠而致瘀血加重，進(jìn)一步加重腦竅阻塞；而氣機(jī)升降失常，清陽不升，則會(huì)加重腦竅缺血缺氧，毒、瘀相互轉(zhuǎn)化并結(jié)合為病，以上惡性循環(huán)導(dǎo)致中風(fēng)病情進(jìn)一步加重，此為“果”。臨床研究也表明，瘀毒是中風(fēng)病情惡化的關(guān)鍵病機(jī)，中風(fēng)后3～5 d患者體溫、血壓和癥狀出現(xiàn)明顯加重表現(xiàn)[6]，而利用化瘀解毒法治療缺血性中風(fēng)能顯著改善中風(fēng)后神經(jīng)功能缺損癥狀[7-8]。綜上可知，瘀毒互結(jié)是導(dǎo)致中風(fēng)病情惡化及不良功能預(yù)后的一種重要病機(jī)[17]。因此，構(gòu)建合適的病證結(jié)合動(dòng)物模型，對研究者理解中風(fēng)瘀毒互結(jié)發(fā)病機(jī)制及新藥開發(fā)提供靶點(diǎn)具有重要意義。

事實(shí)上，瘀毒互結(jié)和炎癥反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)，且均是導(dǎo)致中風(fēng)病情加重的重要原因[17-18]。理論研究表明，瘀毒阻塞脈絡(luò)，氣血運(yùn)行不暢，使毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)，促進(jìn)炎癥滲出、充血和水腫[17]，呈現(xiàn)為以微血管為核心的炎癥級聯(lián)損傷病理過程[18]，而這些病理過程是加重中風(fēng)后腦損傷的重要原因[19]。臨床研究表明，中風(fēng)瘀毒互結(jié)證患者血液中大多炎癥因子水平明顯升高，且這些因子與神經(jīng)功能缺損呈正相關(guān)[20-21]。有研究顯示，中風(fēng)瘀毒互結(jié)證患者急性期血液中炎性因子高敏C反應(yīng)蛋白（Hs-CRP）、IL-6升高。同時(shí)，這些因子與神經(jīng)功能缺損程度呈正相關(guān)[20]。張粲等[21]通過臨床觀察發(fā)現(xiàn)，中風(fēng)瘀毒互結(jié)證患者血清中白細(xì)胞、Hs-CRP和紅細(xì)胞沉降率明顯升高，而運(yùn)用解毒化瘀湯干預(yù)后能明顯降低上述炎癥指標(biāo)、改善患者中風(fēng)后神經(jīng)功能缺損癥狀?？梢姡w內(nèi)炎癥因子升高是中風(fēng)瘀毒互結(jié)證患者的微觀表現(xiàn)。研究表明，腎上腺素、內(nèi)毒素、角叉菜膠和干酵母菌單用或復(fù)合使用均能夠誘發(fā)體內(nèi)炎癥因子升高[22-23]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)參考中醫(yī)瘀熱證和火毒證造模方法[11-14]，利用導(dǎo)致炎癥反應(yīng)藥物，即A/LPS、CA/Y和CA并復(fù)合MCAO手術(shù)造模方法構(gòu)建缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證模型。

在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)瘀毒具有酷烈、暴戾和多損的特點(diǎn)，其致病急且重，患者血液流變學(xué)呈現(xiàn)高黏狀態(tài)[7，25]。本實(shí)驗(yàn)通過觀察表征、病理形態(tài)學(xué)改變和血液流變學(xué)變化來評估中風(fēng)瘀毒互結(jié)證模型。表征觀察是中醫(yī)望診的體現(xiàn)，而望診在中醫(yī)辨證論治中至關(guān)重要。《素問?五臟生成篇》“色見青如草茲者死，黃如枳實(shí)者死，黑如炲者死，赤如血者死，白如枯骨者死”，總結(jié)了色澤與病情嚴(yán)重程度和預(yù)后的關(guān)系。本研究中CA/Y組和CA組大鼠均出現(xiàn)肢體遠(yuǎn)端部分瘀血或發(fā)黑，依據(jù)“黑如炲者死”，提示病情嚴(yán)重、預(yù)后不良，符合瘀毒酷烈、暴戾和多損的特點(diǎn)[5，24]。而病理形態(tài)學(xué)改變能從細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化直觀地判別病情嚴(yán)重程度。本實(shí)驗(yàn)病理形態(tài)學(xué)檢測提示CA/Y組和CA組大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元壞死明顯增多且有免疫細(xì)胞浸潤，從細(xì)胞形態(tài)學(xué)角度也符合瘀毒致病嚴(yán)重的特點(diǎn)。瘀毒膠結(jié)阻滯血脈會(huì)導(dǎo)致血液黏滯且流動(dòng)緩慢，而血液流變學(xué)能夠反映血液流速以及黏稠度，臨床可作為評價(jià)瘀毒互結(jié)的重要指標(biāo)[25]。本實(shí)驗(yàn)通過檢測血液流變學(xué)發(fā)現(xiàn)，CA/Y組大鼠全血黏度在低切變率（1、5 s-1）和高切變率（200 s-1）時(shí)均明顯升高，呈高黏狀態(tài)。全血黏度在低切變率（1、5 s-1）時(shí)，血液易形成紅細(xì)胞聚集體，低切值升高，說明紅細(xì)胞聚集程度增高，血液變黏稠且血流緩慢。全血黏度在高切變率（200 s-1）時(shí)反映紅細(xì)胞變形程度，高切值升高說明紅細(xì)胞變形性差，血流阻力增大[25]。CA/Y組低切值和高切值均升高，說明全血黏度增高，血液流動(dòng)變慢，易形成血栓，符合瘀毒互結(jié)證血液流動(dòng)變化的特點(diǎn)。對CA/Y組大鼠病證結(jié)合模型進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)論證，發(fā)現(xiàn)該組缺血側(cè)腦區(qū)毒性產(chǎn)物促炎因子IL-1β mRNA表達(dá)明顯升高，進(jìn)一步證明CA/Y組缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)模型成功。而CA/Y組IL-1β較IS組降低，結(jié)合病理形態(tài)學(xué)改變，表明CA/Y組細(xì)胞壞死更明顯，這些壞死細(xì)胞可能包括分泌IL-1β的細(xì)胞，因此IL-1β升高在CA/Y組較IS組低，進(jìn)一步表明瘀毒損害暴戾、嚴(yán)重的特點(diǎn)。需要說明的是，本實(shí)驗(yàn)中單純病組纖維蛋白原明顯降低，說明在手術(shù)過程中消耗大量纖維蛋白原，術(shù)后大鼠處于低凝狀態(tài)，而3組病證結(jié)合組大鼠纖維蛋白原雖有降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且A/LPS組比單純病組纖維蛋白原明顯升高，說明前期藥物干預(yù)可能導(dǎo)致大鼠纖維蛋白原合成增多，血液處于高凝狀態(tài)，在一定程度上抵消了手術(shù)的消耗。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)利用藥物A/LPS、CA/Y和CA并復(fù)合MCAO手術(shù)造模能模擬出缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證模型，且角叉菜膠和干酵母菌2種因素疊加組在表征、腦病理形態(tài)學(xué)變化、血液流變學(xué)和炎癥因子變化上均符合中風(fēng)瘀毒互結(jié)的特征，其表現(xiàn)更加典型且穩(wěn)定，可用于缺血性中風(fēng)瘀毒互結(jié)證的中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究、新藥開發(fā)和中藥藥效靶點(diǎn)篩選等多方面的研究。

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Study on Disease-syndrome Combination Animal Model of Ischemic Stroke Stasis Toxin Syndrome

JIANG Chengting, GE Jinwen, NIE Huifang, LUO Ning, ZHONG Dayuan, DENG Yihui

To explore the method for establishing the disease-syndrome combination animal model of the ischemic stroke stasis toxin syndrome.The rat model of the ischemic stroke stasis toxin syndrome was established by the treatment of drugs and the surgical method of middle cerebral artery occlusion (MCAO). These drugs were devided into 3 groups, i.e., adrenaline + endotoxin, carrageenan (CA) and carrageenan + yeast (CA/Y). After that, the surgical model of MCAO was conducted. 24 hours after MCAO, the changes of skin color, neurological function scores, brain cell morphology, hemorheology, and proinflammatory factors in the ischemic area were detected.Neuronal necrosis and immune cells were observed in the ischemic cortex and hippocampus of disease-syndrome combination rats. Additionally, dark and gloomy skin was observed in the rat of CA and CA/Y groups. Furthermore, the change of neurological deficits and hemorheology were significant in the CA/Y group, whole blood viscosity increased significantly at low and high shear rates (<0.05). Additionally, the gene expression of IL-1β was significantly increased in the ischemic brain of the CA/Y group.The disease-syndrome combination animal model of ischemic stroke stasis toxin syndrom can be established by the combination of carrageenan, yeast and the surgical approach of MCAO.

ischemic stroke; stasis toxin syndrome; animal model; disease-syndrome combination

R285.5

A

1005-5304(2020)09-0069-06

10.3969/j.issn.1005-5304.202002282

國家自然科學(xué)基金（81874416）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新課題資助項(xiàng)目（2019CX02）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科開放基金（2018ZXYJH01）

鄧奕輝，E-mail：644138330@qq.com

（2020-02-17）

（2020-03-22；編輯：華強(qiáng)）